用于體外組織和器官的再生功能單元的微流體系統(tǒng)的制作方法
【專利說明】用于體外組織和器官的再生功能單元的微流體系統(tǒng)
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請涉及且要求來自申請案(co-pending)美國臨時申請N0.61/707，907的、諾依曼(Neumann et al.)等人2012年9月29日提交的、申請名稱為“用于體外組織和器官的再生功能單元的微流體系統(tǒng)”的優(yōu)先權，該申請的內容將通過引用并入本申請中；以及進一步要求來自申請案美國臨時申請N0.61/721，002的、諾依曼等人2012年10月31日提交的的優(yōu)先權，該申請的內容將通過弓I用并入本申請中。
技術領域
[0003]本申請涉及用于體外組織和器官的再生功能單元的方法，以及，更具體地，本申請涉及包括切片上的組織工程化的微環(huán)境的系統(tǒng)。
【背景技術】
[0004]盡管投資醫(yī)藥研宄上的調查和開發(fā)已經(jīng)獲得了指數(shù)增長，但是由FDA批準的新的藥物的數(shù)目在過去60年仍沒有變化。在研發(fā)的臨床前階段以及臨床階段，接近于95%的新的候選藥物主要是由于藥物相關毒性而不及格。顯然，需要較好的臨床前藥物篩選測定。候選藥物的當前的藥物代謝動力學以及毒性評價主要依靠于動物測試系統(tǒng)，明顯表示出用于臨床療效和毒性的僅具有非常有限的預測值。另外，維護動物模型大幅地推高了藥物開發(fā)的成本。還有一些高通量的常常應用于藥物開發(fā)中的二維(2D)細胞系模型。由于生理方面的損失，它們的預測值是非常有限的。正在開發(fā)的從培養(yǎng)三維(3D)細胞到切片上的器官的更復雜的人性化的基于細胞的測定能夠解決培養(yǎng)2D細胞的限制以及減少或甚至可能完全替代動物模型。在3D細胞培養(yǎng)模型中的細胞在3D微環(huán)境內生長。3D微環(huán)境模擬在體內發(fā)現(xiàn)的結構、生化和機械方面的微環(huán)境。這種培養(yǎng)基恢復體內相應的組織特定的生化和形態(tài)特征特點是已知的。傳統(tǒng)穩(wěn)固的3D培養(yǎng)基的實例包括水凝膠-內置于膠囊內的細胞、“三明治”培養(yǎng)基、多細胞球狀體和生長在微載體和微機構支撐體上的細胞。雖然功能強大，這些模型仍然缺乏藥代動力學研宄所需的復雜性以及具有許多其他的缺點:1)有限的營養(yǎng)供給和堆積代謝廢物產(chǎn)物可以混淆細胞對藥物的反應，2)無法模擬存在于體內的時空生化梯度，3)缺乏機械線索如流量、灌注、壓力、機械應力，4)難于探測，5)存在問題的實時成像，以及6)由于反應擴散現(xiàn)象在活細胞內不能實施的生化分析。此外，至今還沒有可以設計與活躍血管導管和屏障組織集成的多個器官/組織類似物的微系統(tǒng)。
[0005]結果，有一個既定的系統(tǒng)，但該系統(tǒng)尚未滿足用于藥物研宄、開發(fā)疫苗和其他類型的醫(yī)學研宄的更便宜、更復雜、更可控的需要。本發(fā)明提供了用于該種可控系統(tǒng)的新穎方法，該方法包括一種集成血管細胞和器官細胞以再生體內組織和器官的功能性單元的系統(tǒng)。這些以及其他重要的新的教導從以下說明書和以上權利要求中可見。
[0006]在寄生蟲病疫苗的研發(fā)的醫(yī)學研宄上不僅僅需要可利用的和可獲得的體外寄生蟲細胞，而且還要有能力制備寄生蟲的宿主生物體模型。人類瘧原蟲傳染給蚊子，反過來，作為載體又將疾病傳染給人類。為了研發(fā)且有效地識別瘧疾疫苗，研宄人員需要一個模型系統(tǒng)，其中，能夠在蚊子中腸的環(huán)境中研宄瘧疾寄生蟲，該環(huán)境為瘧疾寄生蟲自然生活的地方。然而，目前沒有系統(tǒng)可用于培養(yǎng)人類瘧疾寄生蟲瘧原蟲科惡性流行在體外的研發(fā)昆蟲階段。此外，研宄瘧疾寄生蟲、子孢子的傳染階段，取決于不準確的和難以控制的方法，該方法涉及活的受感染的蚊子。該方法在分析過程中引入了許多不期望的變量。例如，活的蚊子不受制于血液攝取參數(shù)以及藥物效果分析必須通過解剖蚊子腸道的相對主觀人工檢測進行。
[0007]結果，有一個既定的系統(tǒng)，但該系統(tǒng)尚未滿足用于藥物和疫苗研宄、開發(fā)疫苗和如與瘧疾相關疾病的醫(yī)學研宄的其它類型的更便宜和更可控的需要，該系統(tǒng)用于體外培養(yǎng)系統(tǒng)以生產(chǎn)所有寄生蟲昆蟲階段，包括，例如，寄生蟲蚊子階段，以及用于測試平臺。本發(fā)明提供了用于該種可控系統(tǒng)的新穎方法，該方法包括一種用于蚊子中腸系統(tǒng)的再生功能單元，以及瘧疾寄生蟲于其中培養(yǎng)的模型。其它的重要的新教導從以下說明書和以上權利要求中可見。

【發(fā)明內容】

[0008]本摘要提供了以簡化形式介紹概念的選擇，其在下述詳細的說明書中進一步描述。該摘要不是用于確定權利要求主題的重要特征，也不是以確定權利要求主題的范圍為目的。
[0009]本發(fā)明公開了一種用于形成體外組織和器官的腔室化的微環(huán)境以及用于獨立地灌注腔室的微流體系統(tǒng)。一種微流體裝置包括至少第一灌注路徑和第二分離灌注路徑。該微流體裝置還具有含有基質的腔室，其中，所述基質環(huán)繞著至少一種空腔(void)，該空腔的管腔專門與第一灌注路徑流體連接，其中，所述至少一種空腔能夠填充有至少一種細胞類型，按照該種方式，該細胞與所述基質直接接觸，以及所述基質專門與所述第二分離灌注路徑流體連接。
[0010]另一方面，本發(fā)明公開了一種用于再生體外無脊椎動物的功能性單元的方法，作為用于培養(yǎng)寄生蟲的組織工程化的微環(huán)境，該方法提供了一種具有至少第一灌注路徑和第二分離灌注路徑的微流體裝置，該微流體裝置還具有一種腔室。所述腔室中充滿基質，其中，所述基質圍繞著至少一種空腔，該空腔的管腔專門與第一灌注路徑流體連接，其中，所述至少一種空腔能夠填充有至少一種細胞類型，按照該種方式，該細胞與所述基質直接接觸，以及所述基質專門與所述第二分離灌注路徑流體連接。所述至少一種空腔播種無脊椎動物細胞，以及將所述無脊椎動物細胞灌注以增殖并產(chǎn)生無脊椎動物器官或組織。將寄生蟲階段于微環(huán)境中栽培以提供測試用微環(huán)境。
【附圖說明】
[0011]盡管在隨附的權利要求中具體詳盡地解釋了本發(fā)明的新穎的特征，但是，本發(fā)明將結合附圖在組織和內容上詳細地描述，以更好地理解和明白其它發(fā)明目的和特征。
[0012]圖1A和圖1D分別顯示了兩腔室和三腔室(單細胞管和雙細胞管)的TEM切片。
[0013]圖1B和圖1E說明了兩種TEM切片類型的技術設計。
[0014]圖1C和圖1F分別圖示了用于管腔液體流動的單流體管道和雙流體管道。
[0015]圖2A顯示了嵌入在環(huán)繞著類似為微脈管的細胞管的基質中的細胞的實例，該細胞管包括嵌入在由人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)組成的微脈管的周邊的人腦星形膠質細胞和周細胞。
[0016]圖2B顯示了嵌入環(huán)繞著類似為微微脈管的細胞管的基質中的細胞的實例，其中，周細胞和人腦星形膠質細胞補充到該微脈管的管壁。
[0017]圖2C和圖2D說明了 HUVECs的刺激產(chǎn)物。
[0018]圖3A、圖3B和圖3C顯示了表明具有在四天以上由HUVECs產(chǎn)生的HEK293-管的腎髓質和相對應的血管細胞管的三腔室模塊的實例。
[0019]圖4A至圖4C顯示了包括具有由HT29細胞株產(chǎn)生的細胞管的腸模塊和相對應的由HUVECs產(chǎn)生的血管細胞管的三腔室設置的實例。
[0020]圖5A顯示了表明具有由hep_G2細胞產(chǎn)生的肝臟細胞管的肝臟模塊和由HUVECs產(chǎn)生的血管細胞管的三腔室模型的實例。
[0021]圖5B顯示了嵌入在環(huán)繞著血管的基質中的肝細胞。
[0022]圖6A至圖6F顯示了血-腦-屏障模型的實例，尤其是說明了在兩腔室裝置中穿過血管細胞管(主要由人微血管內皮細胞中產(chǎn)生)的管壁的旁細胞滲透性。
[0023]圖7A和圖7B顯示了在由hCMEC/D3 (人腦微血管細胞株)和嵌入ECM的周細胞和人腦星形膠質細胞(主要人腦細胞)組成的BBB模型中的細胞的重組。
[0024]圖8A至圖8F聯(lián)合顯示了在7天以上的腫瘤血管內皮細胞的相互作用的兩腔室模型的實例。圖8D、圖8E和圖8F顯示了不同焦平面的同樣標本以說明趨向于癌細胞簇生長的多個新芽。
[0025]圖9A至圖9D聯(lián)合顯示了腫瘤血管內皮細胞相互作用的三腔室模型的實例。
[0026]圖1OA和圖1OB聯(lián)合顯示了癌細胞外滲的實例。
[0027]圖11說明了形成復雜系統(tǒng)的四連接的TEM切片而每個切片表示不同器官的實例。
[0028]圖12說明了用于連接四TEM切片以形成復雜系統(tǒng)的替代的系統(tǒng)結構的實例，每一個TEM切片代表著不同的器官。
[0029]圖13說明了利用多個生理學模塊結合為一個線路的替代的系統(tǒng)結構的實例。
[0030]圖14A至圖14C顯示了表明具有在5天以上研發(fā)的蚊子4A-3A涂布細胞小管的細胞管的兩腔室蚊子中腸切片的實例。
[0031]圖15A至圖15F顯示了在初期培養(yǎng)環(huán)境中的早期卵囊的實例。
[0032]圖16圖示了中腸切片的實例。
[0033]圖17A至17D顯示了富含GFP表達惡性皰原蟲動合子(Plasmodium falciparumookinete)在RBC’ s懸浮液中受精48小時后的實例。
[0034]圖17E至17F是包括具有注入GFP表達的寄生蟲的4A-3B細胞管于受精卵，發(fā)展并且生長為成熟動合子階段的實例。
[0035]在附圖中，相同的參考數(shù)字確定相類似的要素或元件。在附圖中要素的尺寸和相應位置沒有必須依據(jù)比例尺繪制。例如，各個要素的形狀和角度沒有依據(jù)比例尺繪制，以及任意擴大和配置了一些要素以提高繪圖清晰度。此外，要素的具體尺寸如圖所示，不在于表達一些與具體要素的實際形狀相關的信息，僅在于在附圖中易于識別選擇。
【具體實施方式】
[0036]本發(fā)明中所展示的實例是為了進一步理解本發(fā)明的目的。該實例用于說明本發(fā)明，但并不限于該實施例。
[0037]除非上下文需要，否則，在整個說明書和權利要求中，所述術語“組成”及其變異，例如，“包含”和“含有”用于解釋公開，包括理解為，即“包括，但并不限于”。
[0038]整個說明書所引用的“一個實例”或“一個實施例”、“一種【具體實施方式】”、“一個【具體實施方式】”或組合和/或這些術語的變異意味著具體的特征、結構或特性，其在【具體實施方式】的相關內容中描述且包括在本發(fā)明的至少一種【具體實施方式】中。因此，在整個說明書的各個地方出現(xiàn)的短語“在一種【具體實施方式】中”或“在一個【具體實施方式】中”沒有必要全部指同一個【具體實施方式】。此外，具體的特征、結構或特性可以以任何適合的方式在一個或多個【具體實施方式】中并存。
[0039]說曰月書
[0040]通常，如在本發(fā)明中所使用的，除非上下文啟示，否則下述術語具有下述意思:
[0041]如在本發(fā)明中所使用的，“BBB”可理解為意味著血-腦屏障，由腦部具體的血管內皮形成。
[0042]如在本發(fā)明中所使用的，“ELISA”具有其通常所公認的意思以及可理解為意味著酶聯(lián)免疫吸附測定。
[0043]如在本發(fā)明中所使用的，“HUVEC”具有其通常所公認的意思以及可理解為意味著人臍靜脈內皮細胞。
[0044]如在本發(fā)明中所使用的，“PDMS”具有其通常所公認的意思以及可理解為意味著聚二甲基硅氧烷。
[0045]如在本發(fā)明中所使用的，“多數(shù)”可理解為意味著多于一個。例如，多數(shù)指至少3、4、5、70、1000、10000 或更多。
[0046]如在本發(fā)明中所使用的，“TEM”可理解為意味著組織工程化的微環(huán)境。
[0047]如在本發(fā)明中所使用的，“組織”被定義為來自相同起源的一種或多種類似細胞與細胞外基質