糖苷酶抑制劑及其用圖
【專利說(shuō)明】糖苷酶抑制劑及其用途 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及抑制糖苷酶的化合物及其用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 許多不同的細(xì)胞蛋白（細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)兩者）是通過(guò)添加經(jīng)由0-糖苷鍵連接的 單糖2-乙酰氨基-2-脫氧-e -D-吡喃葡萄糖苷（e -N-乙酰葡糖胺）而進(jìn)行翻譯后修飾 、此修飾通常被稱為〇-連接的N-乙酰葡糖胺或0-GlcNAc。負(fù)責(zé)使0 -N-乙酰葡糖胺 (GlcNAc)翻譯后連接至許多核質(zhì)蛋白的特異性絲氨酸和蘇氨酸殘基的酶為O-GIcNAc轉(zhuǎn)移 酶（OGT)2A被稱為糖蛋白2-乙酰氨基-2-脫氧-0 -D-吡喃葡萄糖苷酶（0-GlcNAcase)6' 7的第二酶除去該翻譯后修飾以釋放出蛋白，使得0-GlcNAc-修飾成為在蛋白壽命期間多次 發(fā)生的動(dòng)態(tài)循環(huán) 8。
[0004]O-GlcNAc-修飾的蛋白調(diào)節(jié)許多重要的細(xì)胞功能，包括例如轉(zhuǎn)錄9_12、蛋白酶體降 解13和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)14。在許多結(jié)構(gòu)蛋白上也發(fā)現(xiàn)了 O-GlcNAc1547。例如，其已在許多細(xì)胞 骨架蛋白上被發(fā)現(xiàn)，包括神經(jīng)絲蛋白18' 19、突觸蛋白6'2°、突觸蛋白-特異性網(wǎng)格蛋白裝配蛋 白AP-3 7和錨定蛋白G 14。已在腦中發(fā)現(xiàn)豐富的O-GIcNAc修飾21'22。其還已經(jīng)在明確涉及 幾種疾?。òò柎暮Ｄ。ˋD)和癌癥）的病因?qū)W的蛋白上被發(fā)現(xiàn)。
[0005] 例如，完全確定的是，AD和許多相關(guān)tau蛋白病，包括唐氏綜合征、皮克氏癥、尼 曼-皮克氏C型癥和肌萎縮性側(cè)索硬化癥（ALS)，部分地以神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFT)的發(fā)展為 特征。這些NFT為成對(duì)螺旋絲樣結(jié)構(gòu)（PHF)的聚集體，且由異常形式的細(xì)胞骨架蛋白"tau" 組成。tau通常穩(wěn)定微管的關(guān)鍵細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，其為神經(jīng)元內(nèi)分配蛋白和營(yíng)養(yǎng)素所必需的。然 而，在AD患者中，tau變得過(guò)度磷酸化，擾亂其正常功能，形成PHF且最終聚集形成NFT。在 人腦中發(fā)現(xiàn)了 tau的6種同種型。在AD患者中，tau的所有6種同種型皆在NFT中被發(fā)現(xiàn)， 且所有6種皆顯著地過(guò)度磷酸化23' 24。在健康的腦組織中的tau僅攜帶2或3個(gè)磷酸酯基 團(tuán)，而在AD患者腦中發(fā)現(xiàn)的tau平均攜帶8個(gè)磷酸酯基團(tuán) 25'26。在AD患者腦中的NFT水 平與癡呆癥的嚴(yán)重性之間明確的平行性強(qiáng)力地支撐tau功能障礙在AD中的關(guān)鍵作用 27_29。 tau的這種過(guò)度磷酸化的確切原因仍然難以捉摸。因此，相當(dāng)大的努力曾經(jīng)致力于：a)闡明 tau過(guò)度磷酸化的分子生理基礎(chǔ) 3°;及b)鑒別能限制tau過(guò)度磷酸化的策略，希望這些策略 可以停止或甚至逆轉(zhuǎn)阿爾茨海默病的進(jìn)展^34。到目前為止，雖然最近已提出這種過(guò)度磷酸 化的替代基礎(chǔ) 21，一些證據(jù)跡象表明，許多激酶的上調(diào)可能涉及tau的過(guò)度磷酸化21'35' 36。
[0006] 具體地，已經(jīng)出現(xiàn)了通過(guò)tau上的O-GlcNAc水平來(lái)調(diào)節(jié)tau的磷酸酯水平。在tau 上存在的O-GIcNAc已經(jīng)激勵(lì)了將O-GIcNAc水平與tau磷酸化水平相關(guān)聯(lián)的研宄。在該領(lǐng) 域的興趣起源于以下的觀察：已經(jīng)發(fā)現(xiàn)O-GIcNAc修飾出現(xiàn)于許多蛋白上已知經(jīng)歷磷酸化 的氨基酸殘基處37^39。與此觀察一致的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)磷酸化水平的提高導(dǎo)致降低的O-GlcNAc 水平，而相反地，提高的O-GIcNAc水平與降低的磷酸化水平相關(guān)聯(lián)4°。O-GIcNAc與磷酸化 之間的這種彼此相反的關(guān)系已被稱為"陰-陽(yáng)（Yin-Yang)假設(shè)"41，且已經(jīng)通過(guò)酶OGT 4與 用于從蛋白除去磷酸酯基團(tuán)的磷酸酶一起形成功能性復(fù)合物的發(fā)現(xiàn)而得到強(qiáng)力的生化支 持42。像磷酸化一樣，O-GIcNAc為能夠在蛋白壽命期間被除去和重建數(shù)次的動(dòng)態(tài)修飾。提 示性地，已將編碼O-GlcNAcase的基因標(biāo)定成與AD連接的染色體位點(diǎn)7' 43。在人AD腦中過(guò) 度磷酸化的tau具有明顯比健康人腦中所發(fā)現(xiàn)的更低的O-GIcNAc水平21。已經(jīng)表明，來(lái)自 患有AD的人腦的可溶性tau蛋白的O-GlcNAc水平，明顯低于那些來(lái)自健康腦部的可溶性 tau蛋白的O-GlcNAc水平 21。還表明，來(lái)自患病腦部的PHF完全毫無(wú)任何O-GlcNAc修飾 21。tau的這種低糖基化的分子基礎(chǔ)是未知的，雖然其可能起源于增加的激酶活性和/或參 與加工O-GIcNAc的酶之一的功能障礙。在小鼠的PC-12神經(jīng)細(xì)胞和腦組織切片兩者中支 持該后一觀點(diǎn)，使用了非選擇性N-乙酰葡萄糖胺酶抑制劑來(lái)提高tau O-GIcNAc水平，此時(shí) 觀察到磷酸化水平降低21。這些共同的結(jié)果暗示，通過(guò)維持AD患者中的健康O-GIcNAc水平 (諸如通過(guò)抑制O-GlcNAcase的作用），應(yīng)該能阻斷tau的過(guò)度磷酸化和tau過(guò)度磷酸化的 所有相關(guān)效應(yīng)，包括形成NFT和下游效應(yīng)。然而，因?yàn)?-氨基己糖苷酶恰當(dāng)發(fā)揮功能至關(guān) 重要，所以用于AD治療的阻斷O-GlcNAcase作用的任何潛在治療介入，必須避免伴隨抑制 氨基己糖苷酶A和B。
[0007] 神經(jīng)元不儲(chǔ)存葡萄糖，因此腦部依賴由血液供給的葡萄糖來(lái)維持其基本的代謝功 能。尤其地，已經(jīng)表明腦內(nèi)的葡萄糖攝取及代謝隨著變老而降低 44。在AD患者的腦內(nèi)發(fā)生 顯著降低的葡萄糖利用性，且被認(rèn)為是神經(jīng)變性的潛在原因45。這種AD腦中的降低的葡萄 糖供給的基礎(chǔ) 46_48被認(rèn)為起源于降低的葡萄糖輸送49'5°、受損的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 51'52和降低 的血流量53中任何一個(gè)。
[0008] 鑒于這種受損的葡萄糖代謝，值得注意的是進(jìn)入細(xì)胞中的所有葡萄糖中2-5%被 分流至己糖胺生物合成途徑中，從而調(diào)節(jié)該途徑的最終產(chǎn)物（尿苷二磷酸-N-乙酰葡萄 糖胺（UDP-GlcNAc))的細(xì)胞濃度 54。UDP-GlcNAc為核質(zhì)酶O-GIcNAc轉(zhuǎn)移酶（OGT)的底 物2_5,其用于翻譯后添加GIcNAc至許多核質(zhì)蛋白的特異性絲氨酸和蘇氨酸殘基中。OGT 通過(guò)其三角形四肽重復(fù)（TPR)結(jié)構(gòu)域 58'59識(shí)別許多其底物55'56及結(jié)合伴侶42' 57。如上所 述，0-GlcNAcase6'7除去該翻譯后修飾以釋放出蛋白，使得O-GlcNAc-修飾成為在蛋白壽 命期間多次發(fā)生的動(dòng)態(tài)循環(huán) 8。已經(jīng)在若干蛋白中已知的磷酸化位點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)了 0-GlcNAc10' 38'39'6°，包括tau和神經(jīng)纖維絲 61。另外，OGT表現(xiàn)出不尋常的動(dòng)力學(xué)行為，使其對(duì)細(xì)胞內(nèi) UDP-GlcNAc底物濃度極其敏感，并因此對(duì)葡萄糖供給極其敏感 42。
[0009] 與己糖胺生物合成途徑的已知特性、OGT的酶特性及O-GIcNAc與磷酸化之間彼此 相反的關(guān)系一致的是，已經(jīng)證明腦中降低的葡萄糖利用率造成tau過(guò)度磷酸化 45。因此，逐 漸受損的葡萄糖輸送和代謝（不管其原因如何）造成O-GIcNAc降低和tau(及其它蛋白） 的過(guò)度磷酸化。因此，抑制O-GlcNAcase應(yīng)當(dāng)補(bǔ)償在健康對(duì)象以及患有AD或相關(guān)神經(jīng)變性 疾病患者的腦內(nèi)與年齡相關(guān)的葡萄糖代謝受損。
[0010] 這些結(jié)果表明，調(diào)節(jié)tau O-GlcNAc水平的機(jī)制功能失常在形成NFT和相關(guān)神經(jīng)變 性中可能非常重要。阻斷tau過(guò)度磷酸化作為治療上有用的介入的良好支持 62來(lái)自最近的 研宄，所述研宄表明當(dāng)攜帶人類tau的轉(zhuǎn)基因小鼠被激酶抑制劑處理時(shí)，它們并未發(fā)展成 典型的運(yùn)動(dòng)缺陷 34,而在另一實(shí)例中33,表明不可溶性tau的水平降低。這些研宄提供了在 這種疾病的小鼠模型中，降低tau磷酸化水平與減輕AD樣行為癥狀之間清晰的關(guān)聯(lián)。事實(shí) 上，對(duì)tau過(guò)度磷酸化進(jìn)行藥理調(diào)節(jié)被廣泛認(rèn)定為治療AD和其它神經(jīng)變性病癥的有效治療 策略 63。
[0011] 限制tau過(guò)度磷酸化的小分子O-GlcNAcase抑制劑已被考慮用于治療AD和有關(guān) tau蛋白病64。具體地，所述O-GlcNAcase抑制劑thiamet-G已經(jīng)涉及在培養(yǎng)的PC-12細(xì) 胞中的病理相關(guān)位點(diǎn)上降低tau磷酸化64。此外，向健康Sprague-Dawley大鼠口服施用 thiamet-G已經(jīng)涉及在大鼠皮質(zhì)和海馬體兩者中Thr231、Ser396和Ser422上降低tau磷 酸化64。
[0012] 還有大量的證據(jù)表明，O-GlcNAc蛋白修飾的水平提高提供了對(duì)心臟組織中應(yīng)激反 應(yīng)的致病效應(yīng)的保護(hù)，所述應(yīng)激包括由局部缺血、出血、低血容量性休克和鈣反常所引起的 應(yīng)激。例如，通過(guò)施用葡糖胺來(lái)活化己糖胺生物合成途徑（HBP)，已證明在局部缺血/再灌 注65'創(chuàng)傷性出血 72'低血容量性休克75和鈣反常65'76的動(dòng)物模型中發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。此 外，強(qiáng)有力的證據(jù)表明，升高水平的蛋白O-GIcNAc修飾介導(dǎo)這些心臟保護(hù)效應(yīng)65'66'68' 71'73' 76,〇還存在的證據(jù)是，O-GIcNAc修飾在包括帕金森氏癥和亨廷頓氏癥在內(nèi)的各種神經(jīng)變 性疾病中發(fā)揮作用8°。
[0013] 人類有三種編碼裂解糖綴合物的末端e-N-乙酰葡糖胺殘基的酶的基因。這些 基因中的第一種基因編碼O-GlcNAcase。O-GlcNAcase為糖苷水解酶的家族84中的成員， 所述家族包括來(lái)自從原核生物病原至人的各種有機(jī)體的酶（對(duì)于糖苷水解酶的家族分類， 參見(jiàn) Coutinho, P. M. &Henrissat，B. (1999) Carbohydrate-Active Enzymes server 在 URL : http://afmb. cnrs-mrs. fr/CAZY/ 上 81'82)。O-GlcNAcase 用于水解以除去翻譯后修飾的蛋 白上絲氨酸和蘇氨酸殘基的0-GlcNAc1'6' 7'83'84。與O-GlcNAc存在于許多細(xì)胞內(nèi)蛋白上一致 的是，該O-GlcNAcase酶看來(lái)在幾種疾病的病因?qū)W中發(fā)揮作用，包括II型糖尿病 14'85、AD16' 21'86和癌癥 22'87。雖然有可能在更早之前分離