一種用于同時檢測或診斷豬多種病毒感染的多重rt-pcr檢測試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于病毒檢測的試劑盒，特別涉及一種用于同時檢測或診斷豬多 種病毒混合感染的多重RT-PCR檢測試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明屬于病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 近幾年病毒病對畜牧業(yè)造成危害，在大規(guī)模的養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)中，經(jīng)常發(fā)生豬多種病毒 的混合感染，其中豬偽狂犬病毒（PRV)、豬細小病毒（PPV)、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)、豬繁殖 與呼吸綜合癥病毒（PRRSV)、經(jīng)典豬瘟病毒（CSFV)、豬乙型腦炎病毒（JEV)是引起豬生殖系 統(tǒng)破壞和造成養(yǎng)殖企業(yè)經(jīng)濟損失的主要病原。另外PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV這5種病 毒能夠引起豬的免疫系統(tǒng)損傷，同時容易導致豬體感染其他病原。
[0003] 因此，實現(xiàn)對豬偽狂犬病毒（PRV)、豬細小病毒（PPV)、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)、豬 繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV)、經(jīng)典豬瘟病毒（CSFV)、豬乙型腦炎病毒（JEV)的快速檢測 和診斷是疾病檢測、監(jiān)測、防控的重要必須的環(huán)節(jié)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種實現(xiàn)對豬偽狂犬病毒（PRV)、豬細小病毒 (PPV)、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV)、經(jīng)典豬瘟病毒（CSFV)、 豬乙型腦炎病毒（JEV)快速檢測和診斷的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)手段實現(xiàn)的：
[0006] 本發(fā)明利用多重RT-PCR的原理開發(fā)了一種快速檢測和區(qū)別六種豬經(jīng)常流行傳染 病毒的試劑盒，可實現(xiàn)一次反應(yīng)立時檢測引起豬呼吸與生殖疾病的6種病毒，包括3種RNA 病毒和3種DNA病毒。通常對病毒的核酸檢測，尤其是RNA病毒檢測，需要進行逆轉(zhuǎn)錄后再 擴增，本發(fā)明合2步反應(yīng)為1步反應(yīng)，節(jié)約了時間和檢測試劑。
[0007] 本發(fā)明的一種用于同時檢測或診斷多種豬病毒感染的多重RT-PCR檢測試劑盒， 其特征在于所述試劑盒中包括分別用于豬偽狂犬病毒（PRV)、豬細小病毒（PPV)、豬圓環(huán)病 毒2型（PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV)、經(jīng)典豬瘟病毒（CSFV)、豬乙型腦炎病毒 (JEV)檢測的特異性引物對，其中，用于豬偽狂犬病毒檢測的特異性引物對序列如SEQID NO. 1以及SEQIDNO. 2所示，用于豬細小病毒檢測的特異性引物對序列如SEQIDNO. 3以 及SEQIDNO. 4所示，用于豬圓環(huán)病毒2型檢測的特異性引物對序列如SEQIDNO. 5以及 SEQIDNO. 6所示，用于豬繁殖與呼吸綜合癥病毒檢測的特異性引物對序列如SEQIDNO. 7 以及SEQIDNO. 8所示，用于豬瘟病毒檢測的特異性引物對序列如SEQIDNO. 9以及SEQ IDNO. 10所示，用于豬乙型腦炎病毒檢測的特異性引物對序列如SEQIDNO. 11以及SEQID NO. 12所示。
[0008] 多聚酶鏈反應(yīng)中，高度特異引物設(shè)計對檢測特異性至關(guān)重要，本發(fā)明中PRV引物 特異擴增豬偽狂犬病毒保守序列g(shù)E，PPV引物特異擴增豬細小病毒的保守序列NS1，PCV2引 物特異擴增圓環(huán)病毒2型的0RF2片段，PRRSV引物特異擴增豬繁殖與呼吸綜合癥的0RF7片 段（N蛋白基因），CSFV引物特異擴增豬瘟病毒E2基因片段，JEV引物特異擴增乙型腦炎病 毒的E基因片段。同時提供了提高特異性反應(yīng)的引物濃度，可混合配制到一起裝入試劑盒， 用時按標準要求濃度加入引物即可。同時克服了引物的核苷酸G/C含量過高或過低或形成 頸-環(huán)結(jié)構(gòu)降低檢測特異性的風險，優(yōu)化了退火溫度為56. 4°C。
[0009] 在本發(fā)明所述的試劑盒中，優(yōu)選的還包括反應(yīng)混合液，逆轉(zhuǎn)錄酶和TaqDNA多聚酶 混合液以及不含RNase的雙蒸水。
[0010] 采用本發(fā)明的試劑盒用于同時檢測或診斷豬多種病毒感染時，優(yōu)選的，多重 町-?〇?的反應(yīng)體系包括：25微升2\0116 5七印81^€61'，2微升？1^11165(^1口七1110116 5七印 EnzymeMix，濃度分別為500pmol/mL的PPV、PCV2、PRRSV、JEV正反引物各1. 0微升，濃度 分別為500pmol/mL的PRV和CSFV正反引物各1. 5微升，提取的濃度為l-10ng/微升樣本 DNA/RNA混合物5-8微升，DEPC水加至50微升。
[0011] 優(yōu)選的，用于同時檢測或診斷豬多種病毒感染時，反應(yīng)條件：50°C，40min反應(yīng)一 次，94°C變性5min，按94°C變性30s、56. 4°C復性30s、72°C延伸30s，進行35次循環(huán)，最后 72°C延伸lOmin。
[0012] 靈敏度實驗表明本發(fā)明設(shè)計的引物對？1^、？?￥、？(^2、？1?1^工5?￥以及邛￥的檢測 限值分別是2. 5、7. 3、4. 8、3. 9、3. 8、0. 4pg/y1。采用本發(fā)明的多重RT-PCR方法檢測PRV、 PPV、PCV2、PRRSV、CSFV以及JEV的核酸混合物，其檢測限值分別是6. 6、96、12. 9、10. 5、51、 46pg/yl。特異性實驗表明本發(fā)明設(shè)計的引物對豬流感病毒（SIV)、大腸桿菌或豬病的主 要細菌病原，包括冠狀病毒以及豬1型圓環(huán)病毒并無非特異性擴增產(chǎn)物出現(xiàn)。說明使用本 發(fā)明試劑盒同時檢測豬多種常見病毒具有靈敏度高、特異性強等特點，可即時檢測和區(qū)別 PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV以及JEV6 種病毒。
[0013] 因此，進一步的，本發(fā)明還提出了所述的試劑盒在制備同時檢測或診斷豬多種病 毒感染試劑中的應(yīng)用，所述的豬多種病毒包括豬偽狂犬病毒（PRV)、豬細小病毒（PPV)、豬 圓環(huán)病毒2型（PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV)、經(jīng)典豬瘟病毒（CSFV)以及豬乙 型腦炎病毒（JEV)。
[0014] 本發(fā)明對豬病毒混合感染的監(jiān)測和防控、養(yǎng)殖場生物安全、減少養(yǎng)殖業(yè)損失、食品 安全和檢疫等有重要意義。
【具體實施方式】
[0015] 下面通過實驗并結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實施例 僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。
[0016] 實施例1、試劑盒的制備和組裝
[0017] 1、引物的設(shè)計及合成
[0018] 按照基因庫公開序列和國內(nèi)局部地區(qū)的流行株序列設(shè)計并合成了分別用于檢測 豬偽狂犬病毒（PRV)、豬細小病毒（PPV)、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒 (