骨髓間充質(zhì)干細胞表達成骨基因的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種骨髓間充質(zhì)干細胞表達成骨基因的構(gòu)建 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 因創(chuàng)傷、腫瘤、炎癥等導致的大范圍骨缺損是臨床上長期面臨的難題，嚴重危害人 類健康。傳統(tǒng)的治療手段如自體骨移植存在骨量缺乏、同種異體骨移植有傳播疾病可能、異 種異體骨移植則會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)等問題，因此骨組織工程已成為治療大范圍骨缺損的 新策略。目前在動物實驗中，組織工程骨修復小范圍骨缺損時，骨折的愈合效果很好，但是 在修復大范圍骨缺損時，中心部分經(jīng)常發(fā)生缺血壞死。因此，單純的使用組織工程骨治療大 范圍骨缺損困難重重。近年的研宄表明，將具有促成骨作用的基因（如骨形態(tài)發(fā)生蛋白2) 通過基因轉(zhuǎn)染的方法整合到種子細胞中，可以誘導其向成骨方向分化，提高成骨活性。
[0003] 骨髓間充質(zhì)干細胞是存在于骨髓中的一類具備多方向分化潛能的非造血干細胞， 在一定的誘導條件下能向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞等方向分化。而且骨髓 間充質(zhì)干細胞在臨床上已被應(yīng)用于治療移植物抗宿主病和同種異體造血干細胞移植，其生 物安全性已得到證實。然而骨髓間充質(zhì)干細胞不易于外源基因?qū)耄虼诉x擇合適的基因 轉(zhuǎn)染技術(shù)至關(guān)重要。
[0004] 低氧誘導因子 1a(hypoxia-induciblefactor-lalpha，HIF-1a)作為低氧反應(yīng) 的一種核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過對其下游靶基因的誘導表達，調(diào)控血管生成、能量代謝、細胞 增殖迀移分化等反應(yīng)。
[0005] 把目的基因轉(zhuǎn)移到靶細胞中的方法有很多，目前應(yīng)用的基因載體分為兩大類：非 病毒載體和病毒載體。非病毒載體主要包括脂質(zhì)體、聚合物等，這類載體的優(yōu)點是可以大量 生產(chǎn)，毒性反應(yīng)及免疫抑制方面也相對較安全，但其轉(zhuǎn)染效率低、表達量低、體內(nèi)應(yīng)用較困 難。病毒載體主要有3種：反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和腺病毒。反轉(zhuǎn)錄病毒載體的缺點是負載容 量小、整合的隨機性有潛在的危險性、只能感染分裂期細胞，有臨床試驗結(jié)果表明，反轉(zhuǎn)錄 病毒有誘發(fā)白血病的風險，其生物安全性受到廣泛地質(zhì)疑。腺病毒載體和慢病毒載體是現(xiàn) 在使用最為廣泛的兩種方法。腺病毒載體可以感染分裂期及分裂期細胞，但是不能將目的 基因整合到靶細胞的基因組中，因此不能持續(xù)穩(wěn)定的表達外源基因。慢病毒載體是由人類 免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV)改造獲得的，慢病毒載體系統(tǒng)包括表 達載體及包裝質(zhì)粒。目前，還沒有使用低氧誘導因子la重組慢病毒感染骨髓間充質(zhì)干細 胞表達成骨基因的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種骨髓間充質(zhì)干細胞表達成骨基因的構(gòu)建方法，旨在提 供一種利用攜帶低氧誘導因子la的慢病毒感染骨髓充質(zhì)干細胞、構(gòu)建感染骨髓間充質(zhì)干 細胞珠、表達成骨基因的問題。
[0007] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種骨髓間充質(zhì)干細胞表達成骨基因的構(gòu)建方法，所述方 法利用攜帶低氧誘導因子la的慢病毒感染骨髓充質(zhì)干細胞、表達成骨基因，具體包括下 述步驟：
[0008] 構(gòu)建慢病毒表達載體Lenti-HIF-1a-eGFP:從Hela細胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄 成cDNA，分別設(shè)計含酶切位點BamHI的引物HIF-la-F和含酶切位點和PspXI的引 物HIF-la-R，利用上述引物對cDNA進行PCR擴增獲得擴增基因片段一低氧誘導因子 la基因；將慢病毒包裝質(zhì)粒載體Lenti-eGFP與所述擴增基因片段分別進行酶切處理， 將酶切處理產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化處理，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物擴增后進行質(zhì)粒抽提，得到慢病毒表達載體 Lenti-HIF-1a-eGFP;
[0009] 攜帶低氧誘導因子1a的慢病毒載體Lenti-HIF-1a-eGFP的包裝：將慢病毒表達 載體1^拉1-11正-1€[-冗?？與病毒包裝質(zhì)粒1^1^1?&(3 111￥共轉(zhuǎn)染至293了&細胞中，進行病 毒包裝，獲得攜帶低氧誘導因子1a的慢病毒載體Lenti-HIF-1a-eGFP，收集病毒原液，并 對病毒滴度進行監(jiān)控；
[0010] 慢病毒載體Lenti-HIF-1a-eGFP感染骨髓間充質(zhì)干細胞：獲取骨髓間充質(zhì)干 細胞，當骨髓間充質(zhì)干細胞融合度達70%時，當病毒滴度以MOI為50時加入慢病毒載體Lenti-HIF-1a-eGFP進行慢病毒感染，獲得能夠表達成骨基因的感染骨髓間充質(zhì)干細胞。 [0011] 本發(fā)明提供的骨髓間充質(zhì)干細胞表達成骨基因的構(gòu)建方法，操作簡單，從Hela細 胞中擴增出低氧誘導因子la基因片段，然后利用慢病毒載體將低氧誘導因子la導入至 骨髓間充質(zhì)干細胞基因組DNA中，無明顯的毒性反應(yīng)，細胞生長良好；由于慢病毒載體自帶 增強型綠色熒光蛋白，熒光顯微鏡下可觀察見骨髓間充質(zhì)干細胞能大量表達低氧誘導因子 la(熒光強）。獲得的感染骨髓間充質(zhì)干細胞能夠很好地表達低氧誘導因子la基因，可 提高成骨因子的表達水平。
【附圖說明】
[0012] 圖1是本發(fā)明實施例提供的骨髓間充質(zhì)干細胞表達成骨基因的構(gòu)建方法流程示 意圖；
[0013] 圖2是本發(fā)明實施例提供的低氧誘導因子1 a基因瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖；
[0014] 圖3是本發(fā)明實施例提供的Lentil-eGFP-HIF-1 a重組載體瓊脂糖凝膠電泳鑒定 圖；
[0015] 圖4是本發(fā)明實施例提供的骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)學觀察結(jié)果圖；
[0016] 圖5是本發(fā)明實施例提供的采用流式細胞儀檢測骨髓間充質(zhì)干細胞表面標記物 結(jié)果圖；
[0017] 圖6是本發(fā)明實施例提供的攜帶低氧誘導因子1 a的慢病毒感染48h時大鼠骨髓 間充質(zhì)干細胞形態(tài)圖；
[0018] 圖7是本發(fā)明實施例提供的RT-qPCR分析目的基因感染骨髓間充質(zhì)干細胞后在1， 4,7，14d成骨相關(guān)基因的表達結(jié)果統(tǒng)計圖。
【具體實施方式】
[0019] 為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合 附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用 以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0020] 慢病毒載體是由人類免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV)改造獲 得的，慢病毒載體系統(tǒng)包括表達載體及包裝質(zhì)粒，慢病毒表達載體即通常所說的穿梭載體， 包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。在HIV的基礎(chǔ)上刪除了vif、vpr、vpu和 nef4個輔助基因，同時用表達水皰性口炎病毒（VSV)糖蛋白G的質(zhì)粒和雙嗜性小鼠白血 病病毒（MLV)包膜蛋白Env的質(zhì)粒，分別取代表達HIV本身包膜蛋白Env的質(zhì)粒，使HIV-1 載體顆粒包上了VSV或雙嗜性MLV的包膜。包膜的更換進一步降低了慢病毒載體恢復成野 生型病毒的可能，使HIV載體感染宿主的范圍不再僅限于CD4+細胞，而擴大到幾乎能感染 所有組織來源的細胞。VSV的包膜賦予慢病毒載體顆粒高度的穩(wěn)定性，使其能夠通過超速離 心而濃縮，達到高滴度。慢病毒包裝質(zhì)粒可提供所有的轉(zhuǎn)錄并包裝RNA到重組的假病毒載 體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質(zhì)粒同時 共轉(zhuǎn)染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，離 心取得上清液后，可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn) 錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應(yīng)分子。
[0021] 慢病毒載體是應(yīng)用最廣泛的轉(zhuǎn)基因載體之一，具有下列優(yōu)點：（1)可實現(xiàn)目的基 因高效轉(zhuǎn)染靶細胞基因組DNA中并能長期穩(wěn)定表達；（2)能將目的基因插入到靶細胞基因 組DNA中構(gòu)建穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化細胞株從而實現(xiàn)長期表達；（3)慢病毒包裝工藝相對簡單；(4)慢 病毒載體經(jīng)改構(gòu)后，不在宿主細胞繁殖，不易誘發(fā)免疫反應(yīng)，不會導致宿主細胞死亡，被它 感染的細胞能連續(xù)傳代，生物安全性高；（5)可以感染分裂期細胞和非分裂期細胞；(6)可 轉(zhuǎn)移的基因片段容量大，最大可達到9kb。為了獲得穩(wěn)定的整合低氧誘導因子1a的種子細 胞株，本發(fā)明實施例選擇慢病毒載體作為基因轉(zhuǎn)染載體，將外源基因?qū)牍撬栝g充質(zhì)干細 胞中。
[0022] 本發(fā)明實施例提供了一種骨髓間充質(zhì)干細胞表達成骨基因的構(gòu)建方法，所述方法 利用攜帶低氧誘導因子1a的慢病毒感染骨髓充質(zhì)干細胞、表達成骨基因，具體包括下述 步驟，如附圖1所示：
[0023] S01.構(gòu)建慢病毒表達載體Lenti-HIF-1a-eGFP:從Hela細胞中提取總RNA，反 轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別設(shè)計含酶切位點BamHI的引物HIF-la-F和含酶切位點和PspXI的 引物HIF-la-R，利用上述引物對cDNA進行PCR擴增獲得擴增基因片段一低氧誘導因子 la基因；將慢病毒包裝質(zhì)粒載體Lenti-eGFP與所述擴增基因片段分別進行酶切處理， 將酶切處理產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化處理，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物擴增后進行質(zhì)粒抽提，得到慢病毒表達載體 Lenti-HIF-1a-eGFP;
[0024] S02.攜帶低氧誘導因子1a的慢病毒載體Lenti-HIF-1a-eGFP的包裝：將慢病 毒表達載體1^1^丨-11正-1(1-冗?？與病毒包裝質(zhì)粒1^1^1?3(3 111￥共轉(zhuǎn)染至293了3細胞中， 進行病毒包裝，獲得攜帶低氧誘導因子1a的慢病毒載體Lenti-HIF-1a-eGFP，收集病毒 原液，并對病毒滴度進行監(jiān)控；
[0025] S03.慢病毒載體Lenti-HIF-1a-eGFP感染骨髓間充質(zhì)干細胞：獲取骨髓間充質(zhì) 干細胞，當骨髓間充質(zhì)干細胞融合度達70%時，當病毒滴度以