是一種簡(jiǎn)單并免標(biāo)記的基于G-四 鏈體DNA酶的探針，其可以通過目標(biāo)蛋白質(zhì)催化上述發(fā)夾自組裝，并在外切酶III輔助下達(dá) 到信號(hào)擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的明顯放大，進(jìn)而大幅的提高了檢測(cè)的靈敏性，使用凝血酶作為 概念驗(yàn)證分析，該傳感系統(tǒng)能夠高特異性地檢測(cè)凝血酶，檢測(cè)限低至0. 92pM，并且由于其在 檢測(cè)過程中不依賴于模板復(fù)制，避免了在檢測(cè)過程中出現(xiàn)交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而導(dǎo)致假陽 性出現(xiàn)的問題，有效的防止了假陽性信號(hào)的產(chǎn)生，大大減小了背景噪聲，極大的提升了檢測(cè) 的靈敏度；
[0027] (2)本發(fā)明所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針，第一莖干區(qū)（II )和第 二莖干區(qū)（III)的3'端為不易被外切酶剪切的穩(wěn)定序列，保證在反應(yīng)體系中不存在目標(biāo)物 時(shí)，第一發(fā)夾、第二發(fā)夾能夠保持發(fā)夾結(jié)構(gòu)，保持穩(wěn)定狀態(tài)，不產(chǎn)生信號(hào)，有效的防止了假陽 性信號(hào)的產(chǎn)生，大大減小了背景噪聲；
[0028] (3)本發(fā)明所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針，第一莖干區(qū)（II )的5' 端位于所述環(huán)狀區(qū)的部分為從3'端開始的第1-4堿基為T-T-T-T的序列，保證在反應(yīng)體系 中不存在目標(biāo)物時(shí)，第一發(fā)夾能夠保持發(fā)夾結(jié)構(gòu)，保持穩(wěn)定狀態(tài)；
[0029] (4)本發(fā)明所述的檢測(cè)蛋白質(zhì)分子的方法，利用所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào) 擴(kuò)增的探針檢測(cè)蛋白質(zhì)分子，與需要熒光標(biāo)記的發(fā)夾探針檢測(cè)蛋白質(zhì)分子的方法相比，本 發(fā)明的探針不需要任何的化學(xué)修飾，同時(shí)整個(gè)反應(yīng)可以在等溫的均相溶液中進(jìn)行，使得該 檢測(cè)方法非常簡(jiǎn)單并且經(jīng)濟(jì)高效，更為重要的是，由于多種識(shí)別單元可以融入探針，可以用 來特異性地檢測(cè)多種能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，并可在生物化學(xué)領(lǐng)域探索出更為廣泛的應(yīng) 用。
[0030] (5)本發(fā)明所述的檢測(cè)蛋白質(zhì)分子的方法，將基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探 針和外切酶III加入到待測(cè)溶液中，20-40°C下孵育80-100分鐘，隨后向其中加入氯化血紅 素和HEPES緩沖液，20-40°C下孵育50-70分鐘，然后向其中加入魯米諾和H 202即可，上述方 法檢測(cè)操作簡(jiǎn)單、條件易于控制且耗時(shí)較短。
【附圖說明】
[0031] 為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例并結(jié)合 附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，其中
[0032] 圖1為實(shí)施例1的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針的檢測(cè)原理示意圖；其中， 圖中附圖標(biāo)記表示為：I _適配體區(qū)；II _第一莖干區(qū)；I 第一堿基互補(bǔ)區(qū)；II' _第二 堿基互補(bǔ)區(qū)；III-第二莖干區(qū)；III' _第三堿基互補(bǔ)區(qū)；IV-G-四鏈體序列區(qū)。
[0033] 圖2為實(shí)施例2中檢測(cè)的發(fā)光強(qiáng)度與目標(biāo)凝血酶濃度之間的變化關(guān)系圖；
[0034] 圖3為實(shí)施例2中檢測(cè)的發(fā)光強(qiáng)度與目標(biāo)凝血酶濃度之間的指數(shù)曲線圖；
[0035] 圖4為實(shí)施例3的測(cè)定法的原理圖；
[0036] 圖5為實(shí)施例4中對(duì)傳感系統(tǒng)的比色反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果示意圖；
[0037] 圖6為實(shí)施例5中的發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果圖；
[0038] 圖7為實(shí)施例6中的發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果圖；
[0039] 圖8為實(shí)施例7中的發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果圖；
[0040] 圖9為實(shí)施例8中的發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果圖
【具體實(shí)施方式】
[0041] 本發(fā)明下述實(shí)施例中所使用的材料和試劑均為市售產(chǎn)品，采用不同型號(hào)和生產(chǎn)廠 家的下述材料和試劑對(duì)于本發(fā)明的效果并無差異：
[0042] PAGE純的寡核苷酸購(gòu)買于Genscript公司（寡核苷酸序列在下表1中列出）；
[0043] 人a -凝血酶、人免疫球白蛋白G(IgG)、人血清白蛋白和牛血清白蛋白購(gòu)買于 Sigma-Aldrich公司（美國(guó)，康斯坦丁，圣路易斯）；
[0044] 外切酶III和氯化血紅素購(gòu)買于生工生物工程（上海）股份有限公司（中國(guó)，上 海）；
[0045]N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（HEPES)，三（羥甲基）氨基甲烷（Tris)，魯米諾 和過氧化氫購(gòu)買于阿拉丁試劑（上海）有限公司（中國(guó)，上海）；
[0046] 其他化學(xué)試劑購(gòu)買于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（中國(guó)，上海）；
[0047] 重蒸水由電阻率18MDcm的Milli-Q純化系統(tǒng)（美國(guó)，馬塞諸塞州，比爾利卡）制 備而得。
[0048] 實(shí)施例1基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針設(shè)計(jì)
[0049] 本實(shí)施例中所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針包括：第一發(fā)夾H1、第二 發(fā)夾H2和第三發(fā)夾H3,各組成序列如下表1所示；待檢測(cè)的目標(biāo)蛋白質(zhì)為人的凝血酶。
[0050] 表1基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針序列
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針，其特征在于，包括第一發(fā)夾、第二發(fā)夾和 第三發(fā)夾；所述第一發(fā)夾、第二發(fā)夾以及第三發(fā)夾均為單鏈線形分子自身回折后，折疊區(qū)域 內(nèi)的互補(bǔ)堿基配對(duì)雜交而成，其局部區(qū)域形成雙鏈結(jié)構(gòu)的部分為莖干區(qū)，未形成雙鏈結(jié)構(gòu) 并回折的部分為環(huán)狀區(qū)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針，其特征在于， 所述第一發(fā)夾包括：可特異性識(shí)別目標(biāo)蛋白質(zhì)的適配體區(qū)（I)以及與所述適配體區(qū)(I)部分雜交形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的第一莖干區(qū)（II); 所述第二發(fā)夾包括：可與所述第一發(fā)夾的適配體區(qū)（I)部分雜交的第一堿基互補(bǔ)區(qū)(I'）、可與所述第一莖干區(qū)（II)雜交的第二堿基互補(bǔ)區(qū)（II'），以及與所述第一堿基互 補(bǔ)區(qū)（I'）和第二堿基互補(bǔ)區(qū)（II'）部分雜交形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的第二莖干區(qū)（III); 所述第三發(fā)夾包括：可與所述第二莖干區(qū)（in)部分雜交的第三堿基互補(bǔ)區(qū)（nr)以 及與所述第三堿基互補(bǔ)區(qū)（nr)部分雜交形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的G-四鏈體序列區(qū)（IV)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針，其特征在于，所述 第一莖干區(qū)（II)和所述第二莖干區(qū)（III)的3'末端為不易被外切酶剪切的穩(wěn)定序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針，其特征在于， 所述第一莖干區(qū)（II )的3'末端為從3'端開始的第1-4堿基為T-T-T-T ;所述第二莖干 區(qū)（II )的3'末端為從3'端開始的第1-4堿基為T-T-A-A的序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針，其特征在于， 所述第一莖干區(qū)（II)的5'端部分序列與所述適配體區(qū)（I)3'端連接形成所述第一發(fā) 夾的環(huán)狀區(qū)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針，其特征在于， 所述第一莖干區(qū)（II)的5'端位于所述環(huán)狀區(qū)的部分為從3'端開始的第1-4堿基為 T-T-T-T的序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針，其特征在于， 所述G-四鏈體序列區(qū)（IV)具有如SEQIDNo. 1所示的序列結(jié)構(gòu)。
8. -種檢測(cè)蛋白質(zhì)分子的方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1-7中任一所述的基于目 標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針進(jìn)行檢測(cè)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，包括如下步驟： 分別取所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針和外切酶III加入到待測(cè)溶液中， 20-40°C下孵育80-100分鐘，隨后向其中加入氯化血紅素和N-2-羥乙基哌嗪-N' -2-乙磺 酸緩沖液，20-40°C下孵育50-70分鐘，然后向其中加入魯米諾和H2O2，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測(cè)量， 觀察或檢測(cè)混合液的發(fā)光或變色情況。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于，分別取所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重 信號(hào)擴(kuò)增的探針和外切酶III加入到待測(cè)溶液中，37°C下孵育90分鐘，隨后向其中加入氯化 血紅素和N-2-羥乙基哌嗪-N' -2-乙磺酸緩沖液，30°C下孵育60分鐘，然后向其中加入魯 米諾和H2O2，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測(cè)量，觀察或檢測(cè)混合液的發(fā)光或變色情況。
11. 權(quán)利要求1-7中任一所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針在檢測(cè)蛋白質(zhì)分 子或光電檢測(cè)系統(tǒng)領(lǐng)域的用途。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其特征在于，所述蛋白質(zhì)分子為能與DNA結(jié)合的蛋白
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針，所述探針包括第一發(fā)夾、第二發(fā)夾和第三發(fā)夾，第一發(fā)夾、第二發(fā)夾以及第三發(fā)夾均為單鏈線形分子自身回折后，折疊區(qū)域內(nèi)的互補(bǔ)堿基配對(duì)雜交而成，其局部區(qū)域形成雙鏈結(jié)構(gòu)的部分為莖干區(qū)，未形成雙鏈結(jié)構(gòu)并回折的部分為環(huán)狀區(qū)。本發(fā)明的探針通過目標(biāo)蛋白質(zhì)催化上述發(fā)夾自組裝，并在外切酶Ⅲ輔助下達(dá)到信號(hào)擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的明顯放大，進(jìn)而大幅的提高了檢測(cè)的靈敏性，并且由于其在檢測(cè)過程中不依賴于模板復(fù)制，避免了在檢測(cè)過程中出現(xiàn)交叉污染，進(jìn)而導(dǎo)致假陽性出現(xiàn)的問題，有效的防止了假陽性信號(hào)的產(chǎn)生，大大減小了背景噪聲。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號(hào)】CN104789674
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510175491
【發(fā)明人】吳昊, 鄒霈, 諸飛帆, 劉婭靈, 王洪勇, 吳軍
【申請(qǐng)人】江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所
【公開日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年4月14日