一種提高γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶催化合成L-茶氨酸的補(bǔ)料策略的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]采用分批補(bǔ)料策略提高利用枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)的Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-茶氨酸的產(chǎn)量，屬于酶工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域。
技術(shù)背景
[0002]L-茶氨酸(N-乙基-L谷氨酸)，是最初由茶葉中提取獲得的一種天然氨基酸，對(duì)機(jī)體具有多種健康療效。L-茶氨酸已經(jīng)被美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局(FAD)認(rèn)證為一種安全的食品添加劑。鑒于茶氨酸上訴諸多功效，其需求量日益增加。
[0003]γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶廣泛應(yīng)用于茶氨酸的酶法生產(chǎn)，該酶催化γ -谷氨酰類(lèi)化合物的γ-谷氨酰胺鍵的水解，同時(shí)將水解生成的γ-谷氨酰分子轉(zhuǎn)移給受體分子。當(dāng)選用L-谷氨酰胺作為供體，乙胺為受體，γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶催化轉(zhuǎn)肽反應(yīng)時(shí)，即可生成茶氨酸。
[0004]發(fā)明人前期公開(kāi)了一株能夠高效分泌表達(dá)可溶性γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的重組Bacillus subtilis/pMA5_ggt (專利號(hào):201410747714.9)，但是批次催化合成L-茶氨酸的產(chǎn)量還比較低，不能滿足工業(yè)化需求，因此本發(fā)明通過(guò)在前期利用γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶批次轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-茶氨酸的基礎(chǔ)上，采用分批補(bǔ)料添加雙底物的方法，不僅可以解決供體L-谷氨酰胺的低溶解度和其對(duì)酶的抑制作用，同時(shí)可以解決其他學(xué)者僅流加供體L-谷氨酰胺時(shí)出現(xiàn)的過(guò)高濃度的乙胺受體引發(fā)的過(guò)低的供體受體比例問(wèn)題和pH難以控制對(duì)反應(yīng)的不利影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，取濃縮酶液作為反應(yīng)體系，每隔兩個(gè)小時(shí)向其中添加底物谷氨酰胺和乙胺，谷氨酰胺的添加量固定在20mM，供體受體比例控制在1:12時(shí)，每次均將pH調(diào)整為10，18小時(shí)后可得到茶氨酸164.2mM，谷氨酰胺轉(zhuǎn)化率達(dá)到91.2%。是目前報(bào)道的提高酶法合成L-茶氨酸產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率最有效高的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供:對(duì)γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶催化底物供體L-谷氨酰胺和受體乙胺生成茶氨酸的催化流加工藝進(jìn)行優(yōu)化，在已經(jīng)實(shí)踐的單純分批添加谷氨酰胺的基礎(chǔ)上，提出同時(shí)流加谷氨酰胺和乙胺的思路。該思路可以在解決谷氨酰胺低溶解度和對(duì)酶的抑制作用的基礎(chǔ)上，同時(shí)有效避免過(guò)高的乙胺濃度造成的底物比例失調(diào)以及對(duì)反應(yīng)體系pH的不利影響。實(shí)驗(yàn)取得較好的茶氨酸產(chǎn)量和高供體濃度條件下的最好的谷氨酰胺轉(zhuǎn)化率，為茶氨酸的高效工業(yè)生化產(chǎn)提供很好的思路和基礎(chǔ)。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:在發(fā)酵罐水平上培養(yǎng)前期構(gòu)建的具有高效分泌γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶能力的Bacillus subtilis/pMA5_ggt，發(fā)酵液中粗酶液經(jīng)濃縮去鹽后，將酶初步應(yīng)用于催化L-谷氨酰胺和乙胺生成L-茶氨酸。HPLC方法檢測(cè)轉(zhuǎn)化體系中產(chǎn)物的生成量，并通過(guò)質(zhì)譜分析進(jìn)一步對(duì)反應(yīng)體系中生成物進(jìn)行鑒定。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)分批添加雙底物L(fēng)-谷氨酰胺和乙胺，對(duì)反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行更好的控制，獲得較高的茶氨酸產(chǎn)量和高供體濃度下的最好的底物轉(zhuǎn)化率。
[0007]主要試劑:L_谷氨酰胺和乙胺購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，L-茶氨酸購(gòu)自生工生物工程有限公司
[0008]重組菌株的發(fā)酵罐培養(yǎng):
[0009](I)種子培養(yǎng)及配方及培養(yǎng)條件
[0010]200mL的培養(yǎng)基中含有:100g/L蔗糖，20g/L胰蛋白胨，60g/L玉米漿，2g/LMgSO4.7H20和4g/L K2HPO4.3H20，添加卡那霉素至終濃度為50 μ g/ml，調(diào)節(jié)pH為7.2，37 °C，200rpm條件下培養(yǎng)16h作為種子接種。
[0011](2)發(fā)酵培養(yǎng)基
[0012]5L的發(fā)酵罐中裝液量為1.8L，培養(yǎng)基成分和種子培養(yǎng)基類(lèi)似，控制發(fā)酵條件為:pH7.2-7.5，培養(yǎng)溫度為37 °C，轉(zhuǎn)速和通氣速率分別為:350rpm，0.67vvm。培養(yǎng)48h后收獲上清粗酶液，70%的硫酸銨沉淀蛋白，透析袋過(guò)夜透析除鹽，溶解于50mM Tris-HCl緩沖液中(pH 8.0)，即得酶濃縮液。
[0013]濃縮酶液(BsGGT)合成茶氨酸能力的初步鑒定及進(jìn)一步底物流加優(yōu)化
[0014](I)最小的轉(zhuǎn)化體系為:10mL的反應(yīng)液中包含:谷氨酰胺(20mM)，乙胺(20mM)，GGT(60U/ml),不加酶液的混合體系作為對(duì)照，37°C孵育5h后添加同體積的10%三氯乙胺終止反應(yīng)。所得到的反應(yīng)混合物過(guò)濾膜(0.45 μπι ;Millipore)進(jìn)行HPLC分析。同時(shí)對(duì)生成的茶氨酸進(jìn)行質(zhì)譜分析。
[0015](2)反應(yīng)體系的流加策略:
[0016]取濃縮后的酶液40mL，每隔兩個(gè)小時(shí)向其中添加底物谷氨酰胺和乙胺，谷氨酰胺的添加量固定在20mM，供體受體比例在(1:1-1:20)波動(dòng)以尋找最合適的底物比例，每次底物添加前取樣分析，添加后用稀釋的HCl調(diào)節(jié)pH為10，茶氨酸產(chǎn)量不再增加時(shí)即終止反應(yīng)。
[0017]本發(fā)明的有益效果:在Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶催化供體L-谷氨酰胺和受體乙胺發(fā)生轉(zhuǎn)肽反應(yīng)生成L-茶氨酸的工藝過(guò)程中，提出同時(shí)添加谷氨酰胺和乙胺的思路，可以同時(shí)解決谷氨酰胺低溶解度和對(duì)酶的抑制作用，以及過(guò)高的乙胺濃度造成的底物比例失調(diào)以及對(duì)引起反應(yīng)體系pH的改變。以濃縮酶液作為反應(yīng)體系，每隔兩個(gè)小時(shí)向其中添加底物谷氨酰胺和乙胺，谷氨酰胺的添加量固定在20mM，供體受體比例控制在1:12時(shí)，pH調(diào)整為10，18小時(shí)后可得到茶氨酸164.2mM，谷氨酰胺轉(zhuǎn)化率達(dá)到91.2%。獲得較高的茶氨酸產(chǎn)量以及高濃度供體L-谷氨酰胺條件下的最高轉(zhuǎn)化率。為茶氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供很好的基礎(chǔ)和理論指導(dǎo)。
[0018]L-茶氨酸具有重要的生理及醫(yī)學(xué)作用，同時(shí)是一種安全的食品添加劑；酶法高效催化谷氨酰胺合成茶氨酸，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
[0019]具體實(shí)施方法
[0020]實(shí)施例1:重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵罐培養(yǎng)以及粗酶液濃縮
[0021]將重組菌枯草芽孢桿菌B.subtilis/pMA5_ggt在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h后，按6-10% (體積比)的接種量接種于含有1.8L發(fā)酵液的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)48h后離心獲得上清酶液，加入70%的硫酸銨沉淀后，透析袋過(guò)夜透析除鹽，溶解于50mM Tris-HCl緩沖液中(pH 8.0)，即得酶濃縮液。
[0022]實(shí)施例2:濃縮酶液(BsGGT)合成茶氨酸能力的初步鑒定
[0023]最小的轉(zhuǎn)化體系為:10mL的反應(yīng)液中包含:谷氨酰胺(20mM)，乙胺(20mM)，GGT(60U/ml)，不加酶液的混合體系作為對(duì)照，37°C催化反應(yīng)5h后添加同體積的10%三氯乙胺終止反應(yīng)。所得到的反應(yīng)混合物過(guò)濾膜(0.45 μ?? ;Millipore)進(jìn)行HPLC分析。同時(shí)對(duì)生成的茶氨酸進(jìn)行質(zhì)譜分析
[0024]實(shí)施例3:進(jìn)一步通過(guò)底物流加策略優(yōu)化酶催化體系
[0025]取濃縮后的酶液，酶含量60U/mL，每隔兩個(gè)小時(shí)向其中添加底物谷氨酰胺和乙胺，谷氨酰胺的添加量固定在20mM，供體受體比例在(1:4-1:12)波動(dòng)以尋找最合適的底物比例，每次底物添加前取樣分析，添加后用稀釋的HCl調(diào)節(jié)pH為10，茶氨酸產(chǎn)量不再增加時(shí)即終止反應(yīng)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶液及其濃縮液，其特征是:將重組枯草芽孢桿菌B.subtilis/pMA5-ggt發(fā)酵培養(yǎng)后，即獲得含有γ_谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的酶液，在酶液中加入1-100% (w/v)硫酸錢(qián)進(jìn)行沉淀，優(yōu)選70%的硫酸錢(qián)進(jìn)行沉淀；隨后將沉淀轉(zhuǎn)入透析袋中過(guò)夜透析除鹽后，加入適量體積的40-80mM pH 6-9的Tris-HCl緩沖液中，優(yōu)選50mM pH8.0的Tris-HCl緩沖液；使上清酶液γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活力濃縮至5U/mL以上，優(yōu)選γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活力20-100U/mL的酶液，最優(yōu)選酶活力50_60U/mL的酶液。
2.一種催化合成L-茶氨酸的補(bǔ)料策略，其特征是，利權(quán)利要求1所述的γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶液或其濃縮液或濃縮液的稀釋液作為反應(yīng)體系，每隔一段時(shí)間同時(shí)補(bǔ)料添加底物L(fēng)-谷氨酰胺和乙胺，補(bǔ)料后用鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH至9-11，優(yōu)選pH1，在200rpm的搖床中反應(yīng)，當(dāng)茶氨酸產(chǎn)量開(kāi)始降低時(shí)，停止底物添加。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，谷氨酰胺每次添加量為5-50禮，優(yōu)選20禮，乙胺的添加濃度與谷氨酰胺添加濃度比例為1:1-1:20，優(yōu)選1:10 - 1:13。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，補(bǔ)料流加間隔為l_5h，優(yōu)選2h。
5.權(quán)利要求1至權(quán)利要求2所述的催化合成L-茶氨酸的方法，同樣適用于利用其它來(lái)源的或通過(guò)基因工程改造的γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶催化合成L-茶氨酸。
【專利摘要】一種利用分批添加雙底物的方法對(duì)重組pMA5-ggt/Bacillus.subtilis分泌的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶催化L-谷氨酰胺和乙胺生成L-茶氨酸的工藝進(jìn)一步優(yōu)化，屬于發(fā)酵工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明采用前期工作構(gòu)建的分泌γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的枯草芽孢桿菌，對(duì)菌株進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)。濃縮上清粗酶液，應(yīng)用于茶氨酸的轉(zhuǎn)化。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)分批添加底物實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程的進(jìn)一步調(diào)控，在含60U/mL酶液的反應(yīng)體系中，每隔2個(gè)小時(shí)向其中添加底物谷氨酰胺和乙胺，谷氨酰胺的添加量固定在20mM，供體受體比例控制在1：12時(shí)，pH調(diào)整為10，18小時(shí)后可得到茶氨酸164.2mM，谷氨酰胺轉(zhuǎn)化率達(dá)到91.2％。該方法具有操作簡(jiǎn)單，成本低，茶氨酸產(chǎn)量高，底物轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)，有利于工業(yè)放大生產(chǎn)。
【IPC分類(lèi)】C12P13-04, C12R1-125, C12N9-10
【公開(kāi)號(hào)】CN104789538
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510146329
【發(fā)明人】饒志明, 楊套偉, 張顯, 徐美娟, 貝納, 和斐
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年3月30日