0030] 圖4 ;產(chǎn)氣霉ZJLQ024固體發(fā)酵產(chǎn)物和菌株在PDA上的抑菌活性；
[003U圖4中，從左至右的每列分別代表ck、5mm鳳陽產(chǎn)氣霉菌餅、化及一粒生長了鳳陽 產(chǎn)氣霉的麥粒對不同病原菌的對時(shí)生長照片；
[0032]圖5;在不同基質(zhì)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)鳳陽產(chǎn)氣霉ZJLQ0246d的核酸A值；
[003引圖6 ;各因素水平對核酸A值的影響；
[0034] 圖7;鳳陽產(chǎn)氣霉ZJLQ024生物制劑保存方案；
[0035] 圖8 ;初始含水量（含水率）8%各處理4°C保存不同時(shí)間的存活率；
[0036] 圖9 ;初始含水量8%各處理10°C保存不同時(shí)間的存活率；
[0037] 圖10 ;初始含水量8%各處理25°C保存不同時(shí)間的存活率；
[003引圖11 ;初始含水量6%各處理25°C保存不同時(shí)間的存活率；
[0039] 圖12;初始含水量10%各處理25°C保存不同時(shí)間的存活率；
[0040] 圖13;初始含水量6% 4°C保存不同時(shí)間的存活率；
[0041] 圖14;初始含水量10% 4°C保存不同時(shí)間的存活率；
[0042] 圖15 ;保存3個(gè)月的制劑有效成分含量；
[0043] 圖15中，每組從左至右依次為；0.1 %黃原膠水溶液、0.2%黃原膠水溶液、3%海 藻酸鋼水溶液、5%海藻酸鋼水溶液、3%海藻糖水溶液、5%海藻糖水溶液、水；
[0044] 圖16;鳳陽產(chǎn)氣霉ZJLQ024熏蒸防治蘋果青霉病。
【具體實(shí)施方式】
[0045]材料；
[0046] 供試菌株為鳳陽產(chǎn)氣霉Muscodor.fengyangensisZJLQ024。鳳陽產(chǎn)氣霉 Muscodor.fengyangensisZJLQ024 在專利號(hào)為 200910153512. 0 的發(fā)明《Muscodorsp.屬植 物內(nèi)生真菌ZJLQ024及其用途和殺菌劑》中有明確告知，保藏號(hào)為CGMCCNo. 2863。
[0047] 病原指不菌包括；K服青霉菌PeniciIliumexpansum;MH10草替炭痘菌 Colletotrichumfragariae;TZ01 桃子褐腐菌Moniliniafructicola;WJ0101 灰霉菌 Bot巧tiscinerea;ZAU05 立枯絲核菌化izoctoniasolani;ZAU22 終極腐霉菌Pythium ultimum。
[0048] 試劑包括海藻糖、海藻酸鋼、、黃原膠、5%S氯己酸等。
[0049] 本發(fā)明所設(shè)及的儀器包括超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、抑計(jì)、烘箱、 電磁爐、微波爐、冰箱、真空干燥箱、GRT-20D型50L固體發(fā)酵罐、超聲波儀、Agi1ent 6890N-5975B型GC-MS儀、MLS3750型高壓滅菌鍋、BS233S型分析天平、頂空固相微萃取裝 置等。
[0化日]本發(fā)明設(shè)及五種培養(yǎng)基，分別為PDA培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、冷凍保存培 養(yǎng)基和麥粒固體發(fā)酵培養(yǎng)基，其配制方法分別如下：
[0化^PDA培養(yǎng)基（馬鈴馨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）；±豆200肖，葡萄糖20g，1.5%的瓊脂 (即，瓊脂15g)，自來水1000血。取定量±豆切成均勻小塊，加水煮沸至±豆用玻璃椿一戳 擊破，8層紗布過濾，加入20g葡萄糖，冷卻，加自來水定容至lOOOmL，S角瓶裝1. 5 %的瓊 月旨，加入液體，封裝，12rC、15min高壓滅菌。
[0化2]PDB培養(yǎng)基（馬鈴馨葡萄糖培養(yǎng)基）；±豆200g，葡萄糖20g，自來水1000血。取定 量±豆切成均勻小塊，加水煮沸至±豆用玻璃椿一戳擊破，8層紗布過濾，加入20g葡萄糖， 冷卻，加自來水定容至lOOOmU封裝，121°C、15min高壓滅菌。
[0化3] 察氏培養(yǎng)基；硝酸鋼3g，磯酸氨二鐘Ig，硫酸儀（M拆04. 7肥0)0. 5g，氯化鐘0. 5g， 硫酸亞鐵0.Olg，庶糖30g，瓊脂20g，蒸饋水lOOOmL。將離子化合物硝酸鋼、磯酸氨二鐘、硫 酸儀、氯化鐘及硫酸亞鐵加離子水配成母液，用無菌過濾器過濾液體。其余如庶糖，瓊脂，蒸 饋水按比例裝瓶，121°C、15min高壓滅菌。將其溶解后倒在培養(yǎng)皿前，將無機(jī)離子化合物混 合液按比例與培養(yǎng)基混合。
[0化4] 冷凍保存培養(yǎng)基（液體）；葡萄糖lOg，酵母提取物Ig，酸水解酪蛋白0. 5g，丙S醇 (甘油）180mL。用蒸饋水將葡萄糖、酵母提取物、酸水解酪蛋白溶解后，再加入甘油、最后用 蒸饋水定容至1000血，12TC、滅菌20min。
[0化5] 麥粒固體發(fā)酵培養(yǎng)基：取一定量麥粒加自來水浸泡過夜，浸泡時(shí)間7-化左右。 倒掉麥粒多余的水分，lOOg麥粒裝至1L的S角瓶，于12rC、l. 1個(gè)大氣壓連續(xù)高壓滅菌 40min。
[0056] 實(shí)施例1、菌株的保存和活化培養(yǎng)（屬于常規(guī)技術(shù)）
[0化7] 1、菌株的常溫或低溫保存
[0化引在超凈工作臺(tái)，于2ml無菌冷凍保存管加入不超過1. 5ml融化的PDA培養(yǎng)基，蓋 蓋，傾斜放置。待凝固后，將保存的菌株（鳳陽產(chǎn)氣霉Muscodor.fengyangensisZ化Q024) 接種到斜面培養(yǎng)基，數(shù)天后，菌絲成功定殖于斜面，可見新鮮的菌絲長出，加入經(jīng)3次高壓 滅菌的石蠟將菌絲淹沒，蓋蓋，于常溫下或l0°C冰箱保存。使用時(shí)，用無菌牙簽挑取菌組織， 接種于平板PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化。
[0化9] 2、菌株的冷凍保存
[0060] 于超凈工作臺(tái)，在PDA上的菌落挖取4-5塊菌塊，置于2ml無菌冷凍保存管，加入 高壓滅菌的冷凍保存液，將菌塊淹沒。蓋蓋，將冷凍保存管依次于4°C和-20°C下放置比后， 轉(zhuǎn)移至-80°C超低溫冰箱中進(jìn)行長期保存。使用時(shí)，于室溫中自然解凍，挑取其中的菌塊接 種于平板PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化。
[0061] 3、菌株的活化
[0062] 用牙簽從保存菌株的冷凍保存管中取得菌塊，將其接種到PDA培養(yǎng)基，封口膜封 口于25 °C，黑暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0063] 實(shí)施例2、制劑發(fā)酵工藝優(yōu)化
[0064] 1、一級發(fā)酵種子接種種齡優(yōu)化
[0065] 本發(fā)明采用一級發(fā)酵種子用于發(fā)酵接種，優(yōu)選搖瓶發(fā)酵接種，而接種種齡一定程 度決定了發(fā)酵效率的高低，本發(fā)明先優(yōu)化接種種齡；3塊5mm的ZJL024菌餅于100mlPDB 培養(yǎng)液中，200r/min，黑暗25°C培養(yǎng)。定時(shí)間取發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲液過濾，于烘箱（60°C)烘 至恒重，稱重量記錄數(shù)據(jù)，繪制生長曲線。發(fā)現(xiàn)在搖床2(K)r/min液體發(fā)酵鳳陽產(chǎn)氣霉ZJLQ 024,培養(yǎng)6d發(fā)酵種子活性最強(qiáng)（圖1)。6d后菌絲量緩慢增加至第7d達(dá)到平臺(tái)期。
[0066] 因此，WZJL024菌餅于PDB培養(yǎng)液中，200r/min，黑暗25°C培養(yǎng)6天所得，作為一 級發(fā)酵種子。
[0067] 2、接種體積和發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化
[0068] 分別接種5ml，6ml，8ml，10ml，15ml，20ml，25ml-級發(fā)酵種子到裝有l(wèi)OOg滅菌后 的麥粒（即，麥粒固體發(fā)酵培養(yǎng)基角瓶（容量IL)中，定時(shí)間觀察結(jié)果，測菌落形成單 位（CFU，Colony-FormingUnits),選取最佳的接種體積。
[0069] 菌落形成單位（CFU，Colony-Forming化its)指單位體積中的活菌個(gè)數(shù)。在活菌 培養(yǎng)計(jì)數(shù)時(shí)，由單個(gè)菌體或聚集成團(tuán)的多個(gè)菌體在固體培養(yǎng)基上生長繁殖所形成的集落， 稱為菌落形成單位，W其表達(dá)活菌的數(shù)量。
[0070] 測CFU;將不同體積接種液的固體發(fā)酵產(chǎn)物在超凈工作臺(tái)取20粒（大小均勻）于 已滅菌的研鉢加20ml無菌水，研椿研磨成均勻溶液，取lOOul溶液加900ul水，混合均勻后 取lOOul涂PDA平板，雙層Parafilm封口膜封口，25°C黑暗靜止培養(yǎng)，待菌落長出計(jì)數(shù)。
[0071] 無論是菌株平皿培養(yǎng)還是發(fā)酵培養(yǎng)，菌株都會(huì)達(dá)到老齡化的階段，而本發(fā)明需要 發(fā)酵產(chǎn)物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，更傾向于選擇活菌數(shù)量最多的發(fā)酵產(chǎn)物。最佳的培養(yǎng)時(shí)間即為得 到的發(fā)酵產(chǎn)物活性強(qiáng)、數(shù)量多。本實(shí)施例通過C即來得到最佳的優(yōu)化時(shí)間