一株在低磷環(huán)境下促進千年桐光合作用的內(nèi)生真菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一株在低磯環(huán)境下促進千年桐光合作用的內(nèi)生真菌。
【背景技術(shù)】 植物內(nèi)生菌的研究始于19世紀末，Vogl從黑麥草LoliumtemulentumL.種子中分離 出第一株內(nèi)生菌。但真正開始大量研究植株中的內(nèi)生菌起始于上世紀八十年代，主要是在 溫帶地區(qū)、亞熱帶地區(qū)和熱帶地區(qū)的植被中開展研究。 植物內(nèi)生真菌的分布廣、種類多，前人研究表明從絕大多數(shù)植物體內(nèi)都能分離得到內(nèi) 生真菌，由此可見內(nèi)生真菌普遍存在于植物體內(nèi)。在全世界范圍內(nèi)至少在80多個屬290多 種的禾本科農(nóng)作物中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生菌。目前從植物中分離的內(nèi)生菌根據(jù)其具有的獨特功能可 W分為；固氮菌、固鐘菌、固磯菌等植物促生菌、具有抗病蟲害的生防菌和具有促進植物對 不良環(huán)境的修復(fù)能力的抗性菌。 目前，有關(guān)內(nèi)生真菌對千年桐生長的影響研究還存在空白。

【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明的目的在于提供一株在低磯環(huán)境下促進千年桐光合作用的內(nèi)生真菌。
[0002] 該真菌為嗜熱真菌屬（巧巧7. )SY1，已于2015年1月30日在中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、登記保藏，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3 號，保藏號為CGMCCNo. 10469。 該菌的分離、純化包括： A、 材料；將采集得到不同年份的根、枝莖、葉分成=個部分，用自來水清洗干凈，分裝到 自封袋內(nèi)，于4°C冰箱保存； B、 消毒；75%酒精漂洗30s-無菌水沖洗3-4次一 15%的次氯酸鋼漂洗(根7min，莖 5min，葉3min)-無菌水沖洗4-5次。當樣品最后一次浸洗后的水盛于滅菌的小燒杯中，在 平板上劃線作為對照，W檢驗樣品的消毒是否徹底，若干天后如有菌落生成，則表明樣品表 面消毒不徹底，需繼續(xù)調(diào)整消毒方法； C、 接種部位的選擇；葉片；葉尖部、葉中部和葉基部3個處理；枝莖；上中下分為3部 位，其中第3部位為枝莖交接處；根部；分為根尖和根基2個部分； D、 接種；將消毒后的外植體用接種刀切開，鋪放在培養(yǎng)基表面，于28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi) 培養(yǎng)5-7天后觀察菌落生長狀況。有的菌株繁殖迅速，可先將其產(chǎn)生的菌株進行分離純 化；生長緩慢且數(shù)量較少的菌株可延長觀察時間，直到其生長穩(wěn)定后純化； 固體培養(yǎng)；使用改良馬了固體培養(yǎng)基，配方為蛋白腺5.Og/L、酵母浸出粉2.Og/L、 葡萄糖20.0g/L、磯酸氨二鐘l.Og/L、硫酸儀0.5g/L、瓊脂14.0g/L、其它為無菌水，抑值 6. 4 + 0. 2,培養(yǎng)溫度為28 °C，培養(yǎng)方式為平板培養(yǎng)； E、 將分離繁殖出的不同種類的內(nèi)生真菌接入平板培養(yǎng)基進行純化，經(jīng)過2-3次點接純 化、轉(zhuǎn)接后得到單一菌種的上述的巧er皿?功能菌株； 上述的一種在低磯環(huán)境下促進千年桐光合作用的內(nèi)生真菌應(yīng)用菌液的制備方法，是將 上述的菌株接入液體培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時間48~72h，利用血 球計數(shù)板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9. 0X106c化/ml即為成品備用；液體 培養(yǎng)基：為改良馬了培養(yǎng)基，其中蛋白腺5.Og/L、酵母浸出粉2.Og/L、葡萄糖20.Og/L、磯 酸氨二鐘1.Og/L、硫酸儀0. 5g/L、其它為無菌水、抑值6. 4 + 0. 2。 上述的一種在低磯環(huán)境下促進千年桐光合作用的內(nèi)生真菌應(yīng)用菌液的應(yīng)用方法，是應(yīng) 用該菌株的菌液誘施于千年桐苗木根際±壤或苗木直接接種。 本發(fā)明設(shè)及的菌株是從千年桐植株中分離純化得到的，經(jīng)接種于千年桐±培苗，根據(jù) 各項指標綜合評判，進一步證實其對植株生長具有緩解低磯脅迫促進千年桐生物量增長的 作用，尋找到對促進植株生物量增長的有益的功能內(nèi)生真菌可應(yīng)用于生產(chǎn)。
[0003] 通過菌液誘施的方法接種于千年桐幼苗，并在接種15天后進行低磯脅迫試驗，在 脅迫15d時、30d時、45d時、60d時測定植株的葉綠素巧光參數(shù)。根據(jù)測得的各項指標綜合 評判，進一步證實其在低磯脅迫下具有促進植株光合作用的功用，尋找到對促進植株生長 有益的功能內(nèi)生真菌可應(yīng)用于生產(chǎn)。通過對植株的葉綠素巧光參數(shù)的測定，得出接種該菌 株的處理的Fv/Fm和Fv/F。均較大程度高于對照，表明其對于促進植株光合作用效能的提 升具有很大功用，從而進一步證實得到該株內(nèi)生真菌能在低磯環(huán)境下促進千年桐植株光合 作用的增強。
【附圖說明】
[0004] 圖1為不同低磯脅迫條件下不同處理對千年桐幼苗Fv/Fm的影響。
[0005] 圖2為不同低磯脅迫條件下不同處理對千年桐幼苗Fv/F。的影響。
【具體實施方式】
[0006] -、根際±壤誘施與苗木直接接種應(yīng)用 試驗材料為千年桐幼苗為建陽市林業(yè)局提供的千年桐一年生苗。本試驗采用±培盆栽 試驗，選擇長勢一致的苗木于2014年5月定植于直徑15畑1，高10cm的塑料盆中。每盆放入 相等質(zhì)量的3kg黃屯、±，為了保證后期苗木接菌的準確性，往每盆±壤中滴入10-15滴甲醒 (福爾馬林）消毒液，并用塑料薄膜封蓋盆口，消毒時間為2化。待±壤內(nèi)甲醒滲透消毒完 全，除去塑料薄膜，將剩余的甲醒蒸發(fā)，W免影響幼苗的移植成活率。將苗木植入，經(jīng)過一個 月的恢復(fù)性生長，在千年桐幼苗根際施入菌株濃度為5. 5X106c化/ml的菌液100ml，連續(xù)S 天誘施，用蒸饋水溶液處理作為空白對照。
[0007] 菌液制備：將供試菌株接入50mL的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為改良馬了培養(yǎng)基，其中 蛋白腺5.Og/L、酵母浸出粉2.Og/L、葡萄糖20.Og/L、磯酸氨二鐘1.Og/L、硫酸儀0. 5g/L、 其它為無菌水、抑值6. 4 + 0. 2,在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中經(jīng)過72h的培養(yǎng)。用無菌生理鹽水按 十倍稀釋法將菌液稀釋，利用血球計數(shù)板計算菌液濃度配制成5. 5X106c化/血。
[0008] 二、低磯脅迫試驗設(shè)計 盆栽試驗±壤的基質(zhì)為黃屯、±。經(jīng)測定該±壤中各養(yǎng)分物質(zhì)見表1。接種15天后進行 低磯脅迫試驗處理，該段時間主要是讓接種菌株侵入植株。
[0009] 表1基質(zhì)±壤養(yǎng)分情況 Table1Nutrientcontentofbasicsoil單位；mg/g
【主權(quán)項】
1. 一株在低磷環(huán)境下促進千年桐光合作用的內(nèi)生真菌，其特征在于：該真菌為嗜熱真 菌屬（5/7. )SY1，已于2015年1月30日在中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心登記保藏，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏號為CGMCCNo. 10469。
2. -種如權(quán)利要求1所述的一株在低磷環(huán)境下促進千年桐光合作用的內(nèi)生真菌的應(yīng) 用菌液，其特征在于：所述應(yīng)用菌液的制備方法，將所述的嗜熱真菌屬（5/7.) SYl菌株接入液體培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時間48~72h，利用血球 計數(shù)板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.OX106cfu/ml，備用；液體培養(yǎng)基：為 改良馬丁培養(yǎng)基，其中蛋白胨5. Og/L、酵母浸出粉2. Og/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氫二鉀 I. 〇g/L、硫酸鎂0. 5g/L、其它為無菌水、pH值6.4±0. 2。
3. -種如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用菌液的用途，其特征在于：所述應(yīng)用菌液用于千年桐 苗木根際土壤澆施或苗木直接接種。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株在低磷環(huán)境下促進千年桐光合作用的內(nèi)生真菌。所述內(nèi)生真菌為嗜熱真菌屬（Thermomyces sp.）SY1，已于2015年1月30日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏號為CGMCC No. 10469。通過對植株的葉綠素熒光參數(shù)的測定，得出接種該菌株的處理的Fv/Fm和Fv/F0均較大程度高于對照，表明其對于促進植株光合作用效能的提升具有很大功用，從而進一步證實得到該株內(nèi)生真菌能在低磷環(huán)境下促進千年桐植株光合作用的增強。CGMCC No.1046920150130
【IPC分類】A01P21-00, C12R1-645, A01N63-04, A01G7-06, C12N1-14
【公開號】CN104774771
【申請?zhí)枴緾N201510174389
【發(fā)明人】洪滔, 劉劍斌, 吳承禎, 林晗, 謝安強, 洪陳潔
【申請人】福建農(nóng)林大學(xué)
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年4月14日