后，移栽至溫室，得到T0代轉(zhuǎn)ZmDWF4玉米。
[0076] 本實(shí)施例中的預(yù)侵染培養(yǎng)基為添加了 1. 5mg/L 2, 4-D的MS培養(yǎng)基（Murashige and Skoog，1962)，篩選培養(yǎng)基為添加了 2. Omg/L 2, 4-D的N6培養(yǎng)基（朱志清等，1974)，其 中的2, 4-D為2, 4-二氯苯氧乙酸。
[0077] 二、候選轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)
[0078] 1、候選轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)
[0079] 采用CTAB法（Sambrook and Russell，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，2001)提取T0代轉(zhuǎn) ZmDWF4玉米植株基因組DNA，分別設(shè)計(jì)引物檢測(cè)標(biāo)記基因NPT II和目的基因ZmDWF4，引物對(duì) 序列如下：
[0080] 標(biāo)記基因BAR基因引物對(duì)如下：
[0081] 上游引物：5' -GGCGGTCTGCACCATCGTCAACCACTAC-3'，如序列 6 所示；
[0082] 下游引物：5' -AGTCCAGCTGCCAGAAACCCACGTCATG-3'，如序列 7 所示；
[0083] 標(biāo)記基因BAR擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為650bp，擴(kuò)增條件：擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性5分鐘； 94°C變性1分鐘，59°C退火1分鐘，72°C延伸50秒，循環(huán)35次；72°C延伸10分鐘。
[0084] 啟動(dòng)子與ZmDWF4基因融合片段引物對(duì)如下：
[0085] 上游引物：5' -TITTAGCCCTGCCTTCATACG-3'，如序列 8 所示；
[0086] 下游引物：5' -CGCTTGACTTCTCCCTGCTCATC-3'，如序列 9 所示；
[0087] 擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為934bp，擴(kuò)增條件：擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性1分 鐘，61°C退火1分鐘，72°C延伸50秒，循環(huán)35次；72°C延伸10分鐘
[0088] 結(jié)果如圖 2, PC 為 pUBI: : ZmDWF4 質(zhì)粒 DNA、CK 為野生型玉米、L678、L857、L943 為 T0代轉(zhuǎn)ZmDWF4玉米株系，轉(zhuǎn)基因植株的篩選標(biāo)記基因BAR基因和啟動(dòng)子與ZmDWF4基因融 合片段的檢測(cè)結(jié)果，擴(kuò)增序列長(zhǎng)度分別為650bp和934bp，得到上述對(duì)應(yīng)片段的為陽(yáng)性T0代 轉(zhuǎn) ZmDWF4 玉米株系 L678、L857、L943。
[0089] 采用同樣的方法將空載體pCAMBIA3300-Ubi (pUB)轉(zhuǎn)入野生型玉米中，得到T0代 轉(zhuǎn)pUB玉米。采用同樣的方法檢測(cè)，其結(jié)果與野生型玉米無(wú)顯著差異。
[0090] 將T0代植株播種，培養(yǎng)，得到T1代植株。
[0091] 觀察T1代陽(yáng)性T0代轉(zhuǎn)ZmDWF4玉米株系L678、L857、L943與野生型玉米根系，結(jié) 果如圖3,可以看出，與野生型玉米相比，T1代陽(yáng)性T0代轉(zhuǎn)ZmDWF4玉米株系L678、L857、 L943根長(zhǎng)增加。
[0092] 實(shí)施例3、轉(zhuǎn)ZmDWF4玉米氮吸收效率的測(cè)定
[0093] 將T1代轉(zhuǎn)ZmDWF4玉米、T1代轉(zhuǎn)pUBI: : ZmDWF4玉米和野生型玉米籽粒在正常條 件下萌發(fā)，后點(diǎn)播于珍珠巖中，于完全營(yíng)養(yǎng)液條件下生長(zhǎng)至3葉期。小心將根洗凈并將玉米 籽粒去除，挑選長(zhǎng)勢(shì)較為一致的材料重新植于珍珠巖中，以液體的琥珀酸銨培養(yǎng)基作為氮 源和碳源供應(yīng)，使材料生長(zhǎng)到需要測(cè)定的時(shí)期（4-5葉期）。將材料從珍珠巖中洗出，吸干溶 液后將材料根浸于硝酸鉀水溶液中，按照預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)（〇分鐘、5分鐘、15分鐘、半小時(shí)、1小 時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)等）處理材料。時(shí)間到時(shí)將材料取出，蒸餾水沖洗后吸干，取材根 部并迅速冷凍于液氮中。測(cè)定材料中的硝態(tài)氮的含量。
[0094] 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
[0095] (1)吸取500mg/L硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液（準(zhǔn)確稱取烘至恒重的KN030. 7221g溶于ddH20 中，定容至 200ml) 0? lml，0? 2ml，0? 3ml，0? 4ml，0? 6ml，0? 8ml，lml，1. 2ml 分別放入 12ml 離心 管中，用ddH20定容至5ml，使之成為10, 20, 30, 40, 60, 80, 100, 120mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0096] (2)吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0. 1ml，分別放入12ml離心管中，以0. lmlddH20代替標(biāo)準(zhǔn) 溶液做空白，再分別加入0. 4ml 5 %水楊酸-硫酸溶液（稱取5g水楊酸溶于100ml濃硫酸 中。（一般在棕色試劑瓶中稱取lg SA溶于20ml濃硫酸）），搖勾，在室溫下放置20min后， 再加入8 % NaOH溶液9. 5ml，搖勻冷卻至室溫。顯色液總體積為10ml。
[0097] (3)標(biāo)準(zhǔn)去曲線的獲得：以空白做參比，在410nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度。以硝態(tài)氮濃 度為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出回歸方程。
[0098] 在植物營(yíng)養(yǎng)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室分光光度計(jì)下得到的回歸方程：c(ug/ml)= 140. 63*0D410-1. 1636
[0099] 2、樣品中硝態(tài)氮的測(cè)定 [0100] (1)硝態(tài)氮的提取
[0101] 取所需要測(cè)定的植物材料于1. 5ml離心管中，去皮稱重后液氮研磨，然后加入 lmlddH20,100°C煮沸20min，13000rpm離心10min，上清液為所需要測(cè)定的樣品液。
[0102] (2)硝態(tài)氮的測(cè)定
[0103] 吸取樣品液0. 1ml分別于2-3支12ml離心管中，然后加入0. 4ml5%水楊酸-硫酸 溶液，混勻后置室溫下反應(yīng)20min再加入9. 5ml8% NaOH溶液，待冷卻至室溫后，以空白（加 0.11111(1(11120與0.411115%水楊酸-硫酸反應(yīng)20111111，再加入9.511118%似011溶液，冷卻至 室溫）做參比，在410nm波長(zhǎng)下測(cè)其光密度。在回歸方程中計(jì)算出硝態(tài)氮濃度，再用以下公 式計(jì)算其含量。
[0104] NCV-N 含量=C*V/W
[0105] 式中：C一回歸方程計(jì)算得N03 -N濃度；
[0106] V 一提取樣品液總量；
[0107] w-樣品鮮重
[0108] 結(jié)果如圖4所示，可以看出，轉(zhuǎn)基因株系L678、L857和L943在相同時(shí)間氮素含量 高于對(duì)照（CK)，表明轉(zhuǎn)基因株系比對(duì)照具有較高的氮吸收效率。。
[0109] 實(shí)施例4、轉(zhuǎn)ZmDWF4玉米與自交系雜交得到雜交子代
[0110] 1、雜交
[0111] 將T0代轉(zhuǎn)ZmDWF4玉米株系L678、L857、L943播種，培育，直到得到T2代轉(zhuǎn)ZmDWF4 玉米株系L678、L857、L943純合系；
[0112] 將T2代轉(zhuǎn)ZmDWF4玉米株系L678、L857、L943純合系作為母本分別與四個(gè)來(lái)自 不同群體的自交系Lx9801 (孟昭東，玉米結(jié)實(shí)習(xí)性遺傳規(guī)律及其在育種中的應(yīng)用，[D]， 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006 ;公眾可從山東農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得）、3841(由『（PANAR31X黃早四）X 昌7-2』雜交后代為材料經(jīng)多代自交、回交選育而來(lái)，于2010年育成。其中，PANAR31為 非洲外引材料。）、3848(由『(PANAR31X黃早四）X昌7-2』雜交后代為材料經(jīng)多代自 交、回交選育而來(lái)，于2010年育成。其中，PANAR31為非洲外引材料。）、17(由『（黃早 四XBLS71)XCMTR5-1』雜交后代為材料經(jīng)多代自交、回交選育而來(lái)，于1998年育成。其 中，BLS71為外引材料，CMTR5-1為自選系。）、原早3-1(由『（PANAR31X黃早四）X昌7-2』 雜交后代為材料經(jīng)多代自交、回交選育而來(lái)，于2010年育成。其中，PANAR31為非洲外引材 料。）、V3H1 (由CMBL144XSD388雜交后代為材料，經(jīng)多代回交、自交選育，于2005年育 成。其中CMBL144為外引系，SD388為自選系。）、S1620(由Moty - 9XSD388雜交后代 為材料，經(jīng)多代回交、自交選育，于2007年育成。Moty -9為外引系、SD388為自選系，于 2005年育成。）、zheng58 (張發(fā)林，玉米優(yōu)良自交系鄭58的育成和應(yīng)用，作物雜志，2001 (4): 21 ;公眾可從山東農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得）和S415(由掖『（478X178)X5003』雜交后代經(jīng)多代自 交、回交選育而來(lái)，于1998年育成。）（作為父本）雜交，得到雜交子代1、雜交子代2和雜 交子代3,具體如下：
[0113] 雜交子代1 :L678、L857、L943分別為母本、Lx9801為父本雜交得到雜交子代 卩山678/1^9801、L857/Lx9801、L943/Lx9801 ;
[0114] 雜交子代2 :L678、L857、L943分別為母本、3841為父本雜交得到雜交子代 F1L678/384U L857/384U L943/3841 ；
[0115] 雜交子代3 :L678、L857、L943分別為母本、3848為父本雜交得到雜交子代 F1L678/3848, L857/3848, L943/3848 ；
[0116] 雜交子代4 :L678、L857、L943分別為母本、17為父本雜交得到雜交子代FiL678/ T7、L857/T7、L943/T7 ;
[0117] 雜交子代5 :L678、L857、L943分別為母本、原早3-1為父本雜交得到雜交子代 FA678/ 原早 3-1、L857/ 原早 3-1、L943/ 原早 3-1 ;
[0118] 雜交子代6 :L678、L857、L943分別為母本、V3H1為父本雜交得到雜交子代FA678/ V3HU L857/V3HU L943/V3H1 ；
[0119] 雜交子代7 :L678、L857、L943分別為母本、S1620為父本雜交得到雜交子代 F1L678/S1620, L857/S1620,L943/S1620