一種以冬凌草為原料制備高純度冬凌草甲素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，尤其涉及一種利用濟(jì)源冬凌草為原料制備高純度冬凌草甲素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]冬凌草是一種唇型科香茶菜屬的草本植物，其莖和葉可以作為藥用。該植物廣泛分布在黃河流域以南省區(qū)，其中河南濟(jì)源是該植物主要產(chǎn)地。冬凌草具有清熱解毒、消炎止痛，健胃活血及其抗腫瘤的功效。并且在1977年所出版的藥典中收錄了該植物，民間的醫(yī)療史料也曾證明了該植物可以用于治療食道癌等多種疾病并且藥用價值顯著。文獻(xiàn)中曾經(jīng)報道了，冬凌草的莖和葉中含有多種萜類物質(zhì)，其中包括:二萜、單萜、倍半萜以及三萜等。除萜類占主要成分外，還有其他天然化合物存在冬凌草這種植物中，如揮發(fā)油、甙類、多糖、黃酮等等。根據(jù)當(dāng)前的藥理活性研宄結(jié)果表明，冬凌草中發(fā)揮臨床治療效果的主要化合物成分是冬凌草甲素。
[0003]冬凌草甲素，其分子式為C2tlH28O6，分子量不大，值為364.42。其化合物骨架如圖1.前人文獻(xiàn)報道該化合物易溶解于甲醇和丙酮，不溶于苯，醚和氯仿，以往的冬凌草生產(chǎn)工藝中集中于報道用有機(jī)溶劑萃取除雜的思路來提高目標(biāo)產(chǎn)物的純度，有機(jī)溶劑(石油醚及氯仿等)消耗量過大，不易于天然活性成分的大規(guī)模生產(chǎn)，并且相關(guān)的工藝生產(chǎn)粗糙，產(chǎn)品質(zhì)量不高。
[0004]天然化合物分離提取工藝設(shè)計首先考慮目標(biāo)化合物及雜質(zhì)間的相似性，然后根據(jù)目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)來選擇提取的溶劑、柱層析分離過程中的洗脫溶劑、萃取的溶劑及結(jié)晶溶劑。工藝中各操作單元間的耦合設(shè)計取決于目標(biāo)產(chǎn)物及雜質(zhì)的相似性，而分離體系中所有化合物結(jié)構(gòu)的相似性又是由最初的提取操作單元決定的。除此之外，乙酸乙酯-甲醇-水組成的三相萃取未見報道用于冬凌草甲素的提純工藝中來提純脫色，該步驟為超聲輔助結(jié)晶的最后純化的進(jìn)行做了保證晶體色澤的準(zhǔn)備。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種利用冬凌草制備冬凌草甲素的方法，以解決上述問題。本發(fā)明的實施例提供了一種利用濟(jì)源冬凌草制備冬凌草甲素的方法，包括如下步驟:
[0006]一種利用冬凌草來制備高純度冬凌草甲素的方法，其特征在于包括如下步驟:
[0007]I)冬凌草甲素的兩次提取工藝
[0008]用于該工藝設(shè)計中的冬凌草莖和葉首先要經(jīng)過粉碎，其粉碎物進(jìn)行兩種溶劑提取，首先，無水乙醇回流提取，提取時間為l_3h，提取原料質(zhì)量與提取溶劑的體積比為1:10-13，該量度的單位為g/mL。提取溫度為80°C，提取兩次后合并提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至提取液體積是原提取液體積的1/100。向提取器中加水，其體積為乙醇所用量的一半，100°C下，回流提取l-3h。
[0009]2) HP-20大孔吸附樹脂工業(yè)預(yù)純化實驗設(shè)計
[0010]該專利中準(zhǔn)確提供了兩種規(guī)模的大孔樹脂柱層析實驗，即冬凌草甲素的小試規(guī)模實驗和中試規(guī)模實驗。具體列舉如下:
[0011]用于小試規(guī)模的玻璃填充柱的直徑和高度分別為3cm和100cm，HP-20型號大孔樹脂的填充體積為300mL，上樣濃度為0.5-0.65mg/mL,流速2_3.5mL/min,上樣體積為5-6L。洗脫流速為2-3.5mL/min，水洗1500_2000mL后，用體積含量為20%的乙醇洗脫，前1500-2000mL用于除雜，隨后接7000_9000mL含有冬凌草甲素的洗脫液。
[0012]中試規(guī)模的層析柱的直徑和高度分別為12cm和2m。將40L的HP-20大孔樹脂填充入柱子中，控制上樣液濃度范圍為1-1.5mg/mL，上樣的流速范圍300_350mL/min，上樣時間為ll-13h。洗脫步驟中流速為300-400mL/min，用200-280L的水洗脫后，在用200-280L的體積含量為20%乙醇水溶液除雜，最后，用900-1200L的體積含量為20%無水乙醇溶液用于洗脫冬凌草甲素。
[0013]3)三種溶劑(乙酸乙酯-甲醇-水溶液)萃取脫色并進(jìn)一步除雜
[0014]首先，配置體積含量為29%的甲醇水溶液，然后將乙酸乙酯和該甲醇水溶液等體積混合后形成三種溶液兩相體系。單相萃取液體體積與樹脂預(yù)純化得到浸膏中含有的純的冬凌草甲素質(zhì)量比為1:9-15，該量度的單位為17^。萃取后，收集乙酸乙酯相，旋轉(zhuǎn)蒸干后得到冬凌草甲素浸膏。
[0015]4)超聲波輔助冷卻結(jié)晶得到冬凌草甲素的晶體
[0016]配置體積含量為33%的甲醇水溶液，將萃取后得到的浸膏溶解于該甲醇水溶液中，控制冬凌草甲素的濃度為45-53mg/mL，隨后超聲波清洗器中超聲，超聲溫度為25°C，超聲時間為15-20min，白色的大粒晶核析出，4_6°C冰箱保存2天，后_8°C結(jié)晶10-12小時。離心得到固體結(jié)晶產(chǎn)品，用2L的水洗滌產(chǎn)品兩次，每次分別靜置于_8°C的結(jié)晶器中2小時后離心得到白色粉末，烘干機(jī)烘干得到冬凌草甲素粉末。
[0017]進(jìn)一步，步驟I)提取原料質(zhì)量與提取溶劑的體積比為1:11，該量度的單位為g/mL,乙醇的提取時間為2h，水的提取時間也為2h。
[0018]進(jìn)一步，步驟2)小試規(guī)模的工藝中，上樣液濃度為0.55mg/mL,流速為2.5mL/min,上樣體積為6L。洗脫流速為2mL/min，水洗液的體積為1800mL，用2000mL體積含量為20%乙醇水溶液體積為除雜，隨后用9000mL的體積含量為20%乙醇水溶液收集預(yù)純化得到的冬凌草甲素產(chǎn)品。步驟2)中試規(guī)模工藝中，上樣液濃度為lmg/mL，上樣流速為300mL/min，上樣時間為12h，洗脫流速為300mL/min。水洗液的體積200L，用240L體積含量為20 %乙醇水溶液用于除雜，隨后，用1200L的體積含量為20%乙醇水溶液收集預(yù)純化得到的冬凌草甲素產(chǎn)品。
[0019]進(jìn)一步，步驟3)單相萃取液體體積與樹脂預(yù)純化得到浸膏中含有的純的冬凌草甲素質(zhì)量比為1:10，該量度的單位為L/g。
[0020]進(jìn)一步，步驟4)將萃取后得到的浸膏溶解于33%的甲醇48mg/mL的冬凌草甲素溶液，超聲時間20min，可看到有白色的大粒晶核析出，4°C冰箱保存2天，后_8°C結(jié)晶12h。
[0021]與現(xiàn)有文獻(xiàn)中的冬凌草甲素生產(chǎn)工藝相比，本發(fā)明有益的效果是:本工藝中所用的試劑主要是水，無水乙醇，雖然在關(guān)鍵萃取和結(jié)晶單元中也有用到乙酸乙酯和少量的甲醇，但是這兩種試劑相對于水和乙醇用量微量。全套工藝回避了已有的冬凌草甲素純化文獻(xiàn)中所提到的石油醚、氯仿、丙酮及乙醚等多種毒性大的有機(jī)試劑。本工藝引入了大孔樹脂柱層析分離操作單元，該單元工藝操作條件溫和，不存在環(huán)境污染，萃取中引入三相萃取技術(shù)充分利用了溶劑極性表中三種高等極性的試劑調(diào)節(jié)配比實現(xiàn)了脫色提純的效果，最后超聲波輔助結(jié)晶技術(shù)得到了 98%的冬凌草甲素產(chǎn)品，并且該工藝成本低廉，工藝簡單，產(chǎn)率高，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0022]圖1是冬凌草水粗提取液的色譜圖以及該化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)圖
[0023]圖2是一種利用濟(jì)源冬凌草制備高純度冬凌草甲素的工藝流程圖
[0024]圖3是本發(fā)明實施例1利用分析型高效液相色譜測定冬凌草甲素的純度的分析圖
[0025]圖4是本發(fā)明實施例1利用質(zhì)譜對產(chǎn)品進(jìn)行鑒定的鑒定圖
【具體實施方式】
[0026]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定發(fā)明。
[0027]參圖1至參圖4所示，圖1是冬凌草甲素的化合分子結(jié)構(gòu)圖；圖2是本發(fā)明一種利用濟(jì)源冬凌草制備冬凌草甲素的方法的流程圖；圖3是本發(fā)明實施例1利用分析型高效液相色譜測定冬凌草甲素純度的分析圖；圖4是本發(fā)明實施例1利用質(zhì)譜對產(chǎn)品進(jìn)行鑒定的鑒定圖。
[0028]本發(fā)明的實施方式提供了利用冬凌草制備冬凌草甲素的方法，包括以下步驟:
[0029]I)冬凌草甲素的兩次提取工藝
[0030]用于該工藝設(shè)計中的冬凌草莖和葉首先要經(jīng)過粉碎，其粉碎物進(jìn)行兩種溶劑提取，首先，無水乙醇回流提取，提取時間為l_3h(可以為lh、2h、3h)，提取原料質(zhì)量與提取溶劑的體積比為1:10-13(可以為1:10、1:11、1:12、1:13)，該量度的單位為g/mL。提取溫度為80°C，提取兩次后合并提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至提取液體積是原提取液體積的1/20。向提取器中加水，其體積為乙醇所用量的一半，100°c下，回流提取l-3h(可以為lh、2h、3h)。
[0031]2) HP-20大孔吸附樹脂工業(yè)預(yù)純化實驗設(shè)計
[0032]大孔樹脂作為一種有機(jī)聚合物球狀介質(zhì)是一種很好工業(yè)柱層析填充介質(zhì)。在天然化合物的預(yù)純化工業(yè)生產(chǎn)中，這種大孔樹脂填充柱能夠很好地發(fā)揮其高效富集化合物的效果取決于樹脂本身聚合物對天然化合物的吸附作用和柱層析這個操作單元能夠?qū)崿F(xiàn)動態(tài)生產(chǎn)。在該專利中，我們充分考慮了冬凌草甲素這一三萜類化合物的性質(zhì)后選擇了 HP-20大孔吸附樹脂作為柱子的填充介質(zhì)，進(jìn)行了兩種規(guī)模的大孔樹脂柱層析實驗:
[0033]用于小試規(guī)模的玻璃填充柱的直徑和高度分別為3cm和100cm，HP-20型號大孔樹脂的填充體積為300mL，上樣濃度為0.5-0.65mg/mL(可以為0.5mg/mL、0.55mg/mL、0.6mg/mL、0.65mg/mL)，流速 2-3.5mL/min(可以為 2mL/min、2.5mL/min、3mL/min、3.5mL/min)，上樣體積為 5-6L(可以為 5L、5.2L、5.4L、5.6L、5.8L、6L)。洗脫流速為 2-3.5mL/min(可以為 2mL/min、2.5mL/min、3mL