一株釀酒酵母及其在黃酒釀造中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一株釀酒酵母及其在黃酒釀造中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 發(fā)酵是用來(lái)保持和提高食物風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最古老的方法。在我國(guó)，以谷物（南 方主要是糯米，北方主要是黍米、黑米和玉米）為原料，經(jīng)麥曲和酒母經(jīng)糖化和發(fā)酵制成的 黃酒，作為我國(guó)最古老的酒種，與啤酒、葡萄酒一起并稱為世界三大古酒。黃酒的發(fā)酵是利 用酒藥和麥曲等所含有的多種微生物，進(jìn)行開(kāi)放式的"雙邊發(fā)酵"，將原料中的淀粉糖化。酵 母利用糖生成的酒精，蛋白質(zhì)和脂肪等成分經(jīng)微生物作用后變成了有機(jī)酸、氨基酸、酯及雜 醇油，使得黃酒富含豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此，素有"液體蛋糕"的美稱。
[0003] 黃酒釀造過(guò)程中，酵母作為關(guān)鍵微生物，是發(fā)酵重要的動(dòng)力源，優(yōu)良的酵母菌種是 釀制高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)黃酒的前提。酵母菌不僅對(duì)發(fā)酵醪內(nèi)的糖進(jìn)行分解或同化淀粉和糊精，產(chǎn)生 乙醇，同時(shí)，酵母發(fā)酵性能的優(yōu)劣，代謝產(chǎn)物的差異直接影響到黃酒的風(fēng)味、口感和出酒率。
[0004] 在所有釀制酒中，要數(shù)黃酒的酒精含量（14-20% )最高，比起葡萄酒的8% -18% 和啤酒的3% -6%都高，同時(shí)釀造過(guò)程中發(fā)酵液存在高滲透壓、高鹽、高酸等不利環(huán)境。酵 母抵御不良環(huán)境的能力對(duì)于黃酒發(fā)酵過(guò)程的順利進(jìn)行和生產(chǎn)效率的高低密切相關(guān)。為避免 發(fā)酵過(guò)程發(fā)生阻遏或遲滯現(xiàn)象，要求酵母菌種須具備足夠的脅迫應(yīng)答能力來(lái)抵御其所造 成的影響。因此篩選出起酵速度快、產(chǎn)酒能力強(qiáng)、優(yōu)良發(fā)酵性能，同時(shí)耐高滲透壓、耐高酒精 以及耐酸的抗逆性優(yōu)良的酵母菌株作為理想的發(fā)酵劑用于優(yōu)質(zhì)黃酒的釀造生產(chǎn)，對(duì)于黃酒 發(fā)酵工業(yè)具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明為解決上述問(wèn)題而進(jìn)行的，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中缺乏抗逆性優(yōu)良、發(fā)酵效率高 的黃酒釀酒酵母的不足，提供一株抗逆性優(yōu)良、發(fā)酵效率高的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)及其在黃酒釀造中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株，已保藏于中 國(guó)普通微生物保藏中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 9445。
[0008] 進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株的篩選 方法，具有這樣的特征，包括以下步驟：步驟一，采用濃度梯度稀釋法稀釋黃酒釀造主液，取 稀釋液IOOuL涂布于培養(yǎng)基平板上，而后進(jìn)行劃線分離純化，得到分離菌株；步驟二，將步 驟一中的分離菌株，采用TTC顯色平板、杜氏管發(fā)酵、C02失重法進(jìn)行初步篩選，得到初步篩 選菌株；步驟三，將步驟二中的初步篩選菌株通過(guò)酒精耐受性、乳酸耐受性以及高滲耐受性 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行復(fù)篩，得到BR20菌株。
[0009] 本發(fā)明提供的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株的篩選方法，還可 以具有這樣的特征：步驟一中的培養(yǎng)基平板為Yro培養(yǎng)基平板。
[0010] 本發(fā)明提供的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株的篩選方法，還可 以具有這樣的特征：BR20菌株通過(guò)18SrDNA序列對(duì)比分析，確定種屬。
[0011] 進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BR20菌 株進(jìn)行黃酒釀造的方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟一，將BR20菌株從斜面上轉(zhuǎn)接 并進(jìn)行預(yù)活化，得到預(yù)定濃度的接種液；步驟二，向滅過(guò)菌的容器中投入發(fā)酵原料米飯，并 向發(fā)酵原料米飯中接入5-15% (v/v)的所述接種液以及加入2%-20% (v/v)的麥曲，在 20-35°C條件下靜置開(kāi)始進(jìn)行主發(fā)酵；步驟三，步驟二中的主發(fā)酵進(jìn)行10-30天后，將發(fā)酵 醪液進(jìn)行過(guò)濾壓榨，得到的濾液進(jìn)行過(guò)夜澄清后得到黃酒。
[0012] 本發(fā)明還提供的利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株進(jìn)行黃酒 釀造的方法，還可以具有這樣的特征：步驟一中的菌株的預(yù)活化方法為：將BR20菌株接種 于麥芽汁培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度為30°C的條件下振蕩培養(yǎng)16h，得到一級(jí)種子液，一級(jí)種子 液以同樣的條件進(jìn)行二次擴(kuò)大培養(yǎng)，得到二級(jí)種子液，二級(jí)種子液以4000rpm的條件離心 8min后，收集菌體，菌體用生理鹽水懸浮，得到菌體濃度為108cfu/mL的接種液。
[0013] 本發(fā)明還提供的利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株進(jìn)行黃 酒釀造的方法，還可以具有這樣的特征：發(fā)酵原料米飯的制備方法為：將從市面上購(gòu)得的 糯米洗凈后加入水進(jìn)行浸米，待浸米水酸度達(dá)到2-10g/L，結(jié)束浸米，而后常壓條件下蒸煮 20min〇
[0014] 發(fā)明作用與效果
[0015] 本發(fā)明提供了一株抗逆性優(yōu)良、發(fā)酵效率高的釀酒酵母（Saccharomyces Cer eviSiae)BR20菌株，從傳統(tǒng)的黃酒釀造主液篩選得到，可耐受高達(dá)18% vol酒精濃度 的發(fā)酵環(huán)境，在I. 6mol/L的氯化鈉濃度的高滲透壓條件下有較好的適應(yīng)性，在54g/L的 乳酸濃度下仍有較好的生長(zhǎng)狀況；利用該菌株進(jìn)行黃酒釀造，可以使酵液酒精含量達(dá)到 30. 58g/100mL，同時(shí)具有良好的風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1是本發(fā)明的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BR20的生長(zhǎng)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 以下結(jié)合附圖來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】。對(duì)于實(shí)施例中所用到的具體方法或 材料，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā)明技術(shù)思路的基礎(chǔ)上，根據(jù)已有的技術(shù)進(jìn)行常規(guī)的替換 選擇，而不僅限于本發(fā)明實(shí)施例的具體記載。
[0018] 實(shí)施實(shí)例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑 等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0019] Yro培養(yǎng)基：10g酵母浸粉，20g蛋白胨，20g葡萄糖，加水至1000mL，2%瓊脂， 121°C高壓滅菌20min，冷卻后備用。
[0020] 麥芽汁培養(yǎng)基：取200g麥芽，分別加入0.6g的1%。糖化酶與液化酶，加水至 1000 mL，在55-65 °C條件下糖化3-4h，調(diào)整糖度為12-15 ° Bx，2 %瓊脂，121 °C高壓滅菌 20min，冷卻后備用。
[0021] 實(shí)施例一、釀酒酵母菌株的篩選與鑒定
[0022] I. 1樣品稀釋液制備及菌株分離
[0023] 采集來(lái)自浙江、上海地區(qū)傳統(tǒng)方法釀造的黃酒主酵樣品2g，加入15mL無(wú)菌水，劇 烈震蕩20min。采用濃度梯度稀釋法（KT 1-KT4)，取稀釋液IOOuL涂布于YH)瓊脂培養(yǎng)基平 板上，28°C靜置培養(yǎng)48h，挑選菌落大、生長(zhǎng)快的菌株，進(jìn)一步劃線分離純化。
[0024] L 2菌株初篩
[0025] 將步驟I. 1中的菌株以點(diǎn)植法利用TTC顯色平板、杜氏管發(fā)酵、CO2失重法進(jìn)行初 步篩選。記錄產(chǎn)氣時(shí)間、最終產(chǎn)氣量以及〇) 2總失重量，選擇出四株菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1 所示：
[0026] 表1酵母菌的初篩結(jié)果
[0027]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)BR20菌株，已保藏于中國(guó)普通微生物保藏 中心，保藏編號(hào)為CGMCCNO. 9445。
2. 釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)BR20菌株的篩選方法，其特征在于，包括以 下步驟： 步驟一，采用濃度梯度稀釋法稀釋黃酒釀造主液，取稀釋液IOOuL涂布于培養(yǎng)基平板 上，而后進(jìn)行劃線分離純化，得到分離菌株； 步驟二，將所述步驟一中的分離菌株，采用TTC顯色平板、杜氏管發(fā)酵、C02失重法進(jìn)行 初步篩選，得到初步篩選菌株； 步驟三，將所述步驟二中的初步篩選菌株通過(guò)酒精耐受性、乳酸耐受性以及高滲耐受 性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行復(fù)篩，得到所述BR20菌株。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)BR20菌株的篩選方 法，其特征在于： 其中，所述步驟一中的培養(yǎng)基平板為Yro培養(yǎng)基平板。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)BR20菌株的篩選方 法，其特征在于： 其中，所述BR20菌株通過(guò)18SrDNA序列對(duì)比分析，確定種屬。
5. 利用釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)BR20菌株進(jìn)行黃酒釀造的方法，其特 征在于，包括以下步驟： 步驟一，將BR20菌株從斜面上轉(zhuǎn)接并進(jìn)行預(yù)活化，得到預(yù)定濃度的接種液； 步驟二，向滅過(guò)菌的容器中投入發(fā)酵原料米飯，并向所述發(fā)酵原料米飯中接入5-15% (v/V)的所述接種液以及加入2%-20% (v/v)的麥曲，在20-35°C條件下靜置，開(kāi)始進(jìn)行主 發(fā)酵； 步驟三，所述步驟二中的主發(fā)酵進(jìn)行10-30天后，將發(fā)酵醪液進(jìn)行過(guò)濾壓榨，得到濾 液，將所述濾液進(jìn)行過(guò)夜澄清后得到所述黃酒。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)BR20菌株進(jìn)行 黃酒釀造的方法，其特征在于： 其中，所述步驟一中的菌株的預(yù)活化方法為：將所述釀酒酵母（Saccharomyces CereviSiae)BR20菌株接種于麥芽汁培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度為30°C的條件下振蕩培養(yǎng)16h， 得到一級(jí)種子液，所述一級(jí)種子液以同樣的條件進(jìn)行二次擴(kuò)大培養(yǎng)，得到二級(jí)種子液， 所述二級(jí)種子液以4000rpm的條件離心8min后，收集菌體，將所述菌體用生理鹽水制 成懸浮液，得到菌體濃度為108cfu/mL的接種液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)BR20菌株進(jìn)行 黃酒釀造的方法，其特征在于： 其中，所述發(fā)酵原料米飯的制備方法為：將糯米洗凈后加入水，進(jìn)行浸米，待浸米水酸 度達(dá)到2-10g/L，結(jié)束浸米，而后常壓條件下蒸煮20min。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一株抗逆性優(yōu)良、發(fā)酵效率高的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株，從傳統(tǒng)的黃酒釀造主液篩選得到，可耐受高達(dá)18％(vol)酒精濃度的發(fā)酵環(huán)境，在1.6mol/L的氯化鈉濃度的高滲透壓條件下有較好的適應(yīng)性，在54g/L的乳酸濃度下仍有較好的生長(zhǎng)狀況；利用該菌株進(jìn)行黃酒釀造，得到的黃酒中酒精含量高，還原糖含量低，底物利用較完全，產(chǎn)品具有獨(dú)特風(fēng)味，口感及較高的營(yíng)養(yǎng)。CGMCC NO.944520140711
【IPC分類】C12N1-16, C12G3-02, C12R1-865
【公開(kāi)號(hào)】CN104726352
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510031501
【發(fā)明人】艾連中, 楊昳津, 夏永軍, 王光強(qiáng), 俞劍燊, 方逸群
【申請(qǐng)人】上海理工大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2015年1月22日