一種2,4-二乙?；g苯三酚的分離純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請(qǐng)涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是生物活性物質(zhì)分離純化領(lǐng)域。具體而言，本申請(qǐng)涉及發(fā)酵液中2，4- 二乙?；g苯三酚的分離純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]2，4-DAPG作為一種廣譜生物活性產(chǎn)物,對(duì)小麥全蝕病、番茄黑根病、小麥根腐病和甜菜猝倒病等植物病害有防治效果，是一種已被證實(shí)的對(duì)于農(nóng)作物生長(zhǎng)和生產(chǎn)有著重要作用的生物活性產(chǎn)物。
[0003]目前對(duì)于2，4-DAPG的研究主要集中在實(shí)驗(yàn)室，還沒有工業(yè)化生產(chǎn)的相關(guān)研究。主要研究集中證2，4-DAPG能夠防治多種植物病害，通過分子生物學(xué)手段對(duì)2，4-DAPG的代謝途徑進(jìn)行了相關(guān)研究；而針對(duì)發(fā)酵液中的2，4-DAPG的分離研究主要是用HPLC的定性分離鑒定，缺乏2，4-DAPG工業(yè)化生產(chǎn)的分離、制備的技術(shù)和工藝，無法實(shí)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物規(guī)?；姆蛛x純化制備。通過分子生物學(xué)的改造手段，雖然可以提高發(fā)酵產(chǎn)生2，4-DAPG的產(chǎn)量，但是如果沒有良好的制備工藝，仍然無法將此生物活性產(chǎn)物投入到規(guī)?；a(chǎn)以及實(shí)際應(yīng)用中去。
[0004]因此，本領(lǐng)域中迫切需要開發(fā)從發(fā)酵產(chǎn)物中分離并且進(jìn)行進(jìn)一步純化2，4-DAPG的方法，再將其投入實(shí)際應(yīng)用，使生物活性產(chǎn)物2，4-DAPG在防治植物病害中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種從發(fā)酵液中分離純化2，4-二乙?；g苯三酚(也稱2，4-DAPG)的方法。該方法具有工藝簡(jiǎn)單、品質(zhì)穩(wěn)定、產(chǎn)品收率高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0006](I)發(fā)酵液預(yù)處理:將含有2，4- 二乙?；g苯三酚的發(fā)酵液，離心取上清液，備用；
[0007](2)上清液處理:將步驟(I)中處理后的上清液微孔濾膜過濾，再用超濾膜超濾，獲得濾液，用稀HCl調(diào)節(jié)濾液pH至2-4 ；
[0008](3)大孔樹脂吸附:將步驟⑵的濾液上大孔樹脂柱至飽和，控制柱溫和上樣流速；
[0009](4)將步驟(3)中上樣好的大孔樹脂柱，用兩倍柱床體積的純水進(jìn)行洗脫，控制柱溫和流速；
[0010](5)大孔樹脂解吸附:將步驟(4)中純水洗脫過的樹脂柱，用50% -70%乙醇水溶液3倍柱床體積進(jìn)行洗脫，控制柱溫和洗脫流速，收集洗脫液；
[0011](6)將步驟(5)中收集到的洗脫液，減壓干燥，回收溶劑，獲得粗結(jié)晶；
[0012](7)將步驟(6)中獲得的粗結(jié)晶，用90%乙醇水溶液重結(jié)晶，獲得高純度的2，4-DAPG ；
[0013]優(yōu)選步驟(I)中離心采用連續(xù)流離心，4000-5000rmp轉(zhuǎn)速；
[0014]優(yōu)選步驟(2)中所述的微孔濾膜孔徑為0.22-0.6um，材質(zhì)為聚四氟乙烯、聚醚砜或混合纖維素酯；所述的超濾膜的截留分子量為2000-5000，材質(zhì)為聚醚砜、聚酰胺或聚碳酸酯；
[0015]優(yōu)選步驟(3)、(4)、(5)中的柱溫為25-35 °C，流速為3_5BV/h ；
[0016]優(yōu)選步驟(3)、(4)、(5)中的大孔樹脂可以是HZ801、AB-8、HZ806、DlOl、DKl 10、D113、HZ802、HZ803、HZ816、HZ818中的一種或幾種混合樹脂，優(yōu)先選用HZ801、HZ802、HZ803、HZ806、HZ816、HZ818 ；
[0017]優(yōu)選步驟(6)中減壓干燥的溫度在50_70°C ；
[0018]優(yōu)選步驟(6)中重結(jié)晶的溫度在50_70°C。
【附圖說明】
[0019]沒有。
【具體實(shí)施方式】
[0020]以下結(jié)合實(shí)例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施案例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。
[0021]實(shí)施例1
[0022](I)發(fā)酵液預(yù)處理:將含有2，4- 二乙酰基間苯三酚的發(fā)酵液，碟片式離心機(jī)連續(xù)流離心，離心轉(zhuǎn)速為4000rmp，取上清液，備用；
[0023](2)上清液處理:將步驟(I)中處理后的上清液先經(jīng)過0.22um聚醚砜材質(zhì)的微孔濾膜過濾，再用截留分子量為2000的聚醚砜材質(zhì)的超濾膜超濾，獲得濾液，用5M HCl調(diào)節(jié)pH 至 2-4，；
[0024](3)大孔樹脂吸附:將步驟(2)的濾液上大孔樹脂柱至飽和，樹脂裝柱高度為150cm、直徑20cm、柱溫28 °C，上樣流速為5BV/h ；
[0025](4)將步驟(3)中上樣好的大孔樹脂柱，用兩倍柱床體積的純水進(jìn)行洗脫，柱溫28°C，流速為 5BV/h ；
[0026](5)大孔樹脂解吸附:將步驟⑷中純水洗脫過的樹脂柱，用65%乙醇水溶液3倍柱床體積進(jìn)行洗脫，柱溫28 °C，上樣流速為5BV/h，收集洗脫液；
[0027](6)將步驟(5)中收集到的洗脫液，55 °C真空干燥，獲得2，4-DAPG的粗結(jié)晶；
[0028](7)將步驟(6)中獲得的粗結(jié)晶，用90%乙醇水溶液重結(jié)晶，獲得高純度的2，4-DAPG。
[0029]實(shí)施例2
[0030](I)發(fā)酵液預(yù)處理:將含有2，4-二乙?；g苯三酚的發(fā)酵液，碟片式離心機(jī)5000rmp連續(xù)流離心，取上清液，備用；
[0031](2)上清液處理:將步驟(I)中處理后的上清液先經(jīng)過0.45um聚醚砜材質(zhì)的微孔濾膜過濾，再用截留分子量為5000的聚醚砜材質(zhì)的超濾膜超濾，獲得濾液，用5M HCl調(diào)節(jié)pH 至 2 ;
[0032](3)大孔樹脂吸附:將步驟(2)的濾液上大孔樹脂柱至飽和，樹脂裝柱高度為200cm、直徑20cm、柱溫25 °C，上樣流速為4BV/h ；
[0033](4)將步驟(3)中上樣好的大孔樹脂柱，用兩倍柱床體積的純水進(jìn)行洗脫，柱溫25°C，流速為 4BV/h ；
[0034](5)大孔樹脂解吸附:將步驟⑷中純水洗脫過的樹脂柱，用60%乙醇水溶液3倍柱床體積進(jìn)行洗脫，柱溫25 °C，上樣流速為4BV/h，收集洗脫液；
[0035](6)將步驟(5)中收集到的洗脫液，60°C真空干燥，獲得2，4-DAPG粗結(jié)晶；
[0036](7)將步驟(6)中獲得的粗結(jié)晶，用90%乙醇水溶液重結(jié)晶，獲得高純度的2，
4-DAPG。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種從發(fā)酵液中分離純化2，4-二乙?；g苯三酚(也稱2，4-DAPG)的方法，其特征在于它，該方法包括以下步驟， (1)發(fā)酵液預(yù)處理:將含有2，4-二乙?；g苯三酚的發(fā)酵液，離心取上清液，備用； (2)上清液處理:將步驟(I)中處理后的上清液微孔濾膜過濾，再用超濾膜超濾，獲得濾液，用稀HCl調(diào)節(jié)濾液pH至2-4 ； (3)大孔樹脂吸附:將步驟(2)的濾液上大孔樹脂柱至飽和，控制柱溫和上樣流速； (4)將步驟(3)中上樣好的大孔樹脂柱，用兩倍柱床體積的純水進(jìn)行洗脫，控制柱溫和流速； (5)大孔樹脂解吸附:將步驟(4)中純水洗脫過的樹脂柱，用50%-70%乙醇水溶液3倍柱床體積進(jìn)行洗脫，控制柱溫和洗脫流速，收集洗脫液； (6)將步驟(5)中收集到的洗脫液，減壓干燥，回收溶劑，獲得粗結(jié)晶； (7)將步驟(6)中獲得的粗結(jié)晶，用90%乙醇水溶液重結(jié)晶，獲得高純度的2，4-DAPG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于:在步驟(I)中離心采用連續(xù)流離心，4000-5000rmp 轉(zhuǎn)速。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于:在步驟(2)中所述的微孔濾膜孔徑為0.22-0.6um，材質(zhì)為聚四氟乙烯、聚醚砜或混合纖維素酯；所述的超濾膜的截留分子量為2000-5000，材質(zhì)為聚醚砜、聚酰胺或聚碳酸酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于:樹脂柱的高徑比為7-16，在步驟(3)、(4)、(5)中的柱溫為25-35 °C，流速為3-6BV/h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于:大孔樹脂可以是HZ801、AB-8、HZ806、D101、DK110、D113、HZ802、HZ803、HZ816、HZ818 中的一種或幾種混合樹脂，優(yōu)先選用 HZ801、HZ802、HZ803、HZ806、HZ816、HZ818。
6.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于:在步驟￠)中減壓干燥的溫度在50-70。。。
7.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于:在步驟(J)中重結(jié)晶的溫度在50-70。。。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種從發(fā)酵液中使用大孔吸附樹脂分離純化2，4-二乙酰基間苯三酚(也稱2，4-DAPG)的方法。本發(fā)明還提供了從發(fā)酵液中分離提取代謝產(chǎn)物2，4-DAPG的工藝流程。本發(fā)明整個(gè)操作流程中，能夠較快的得到濃縮產(chǎn)物，而且大孔吸附樹脂的可再生的特性使得樹脂能夠反復(fù)使用，節(jié)約成本。
【IPC分類】C07C45-78, C07C49-825
【公開號(hào)】CN104725208
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310698092
【發(fā)明人】郭少華
【申請(qǐng)人】上海塞恩泰恩生物科技有限公司
【公開日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2013年12月18日