解淀粉芽孢桿菌植物亞種zfh-3及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于水果保鮮、采后病害防治領域，涉及一種解淀粉芽孢桿菌植物亞種 ZFH-3及其應用，尤其是在水果如柑橘、香蕉、草莓采后主要病害防治與保鮮中的應用。
【背景技術】
[0002] 水果采后病害是影響水果產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要因素，也是水果采后貯運研宄的重 點。柑桔米后病害主要有青霉病、綠霉病、蒂腐病、酸腐病和炭疽病。香蕉米后病害主要是 軸腐?。ü诟。?、炭疽病，草莓采后不耐貯，易腐爛，主要是灰霉病、軟腐病。大部分的水果 采后病害為侵染性病害，大多從臍部、蒂部和傷口入侵，并可通過病果接觸交叉?zhèn)魅?，造?采后果實在貯運期內(nèi)的腐爛變質(zhì)，失去食用價值，腐爛率一般為10 %~30 %，會造成嚴重 的經(jīng)濟損失。
[0003] 為提高水果采后病害防治技術水平、減少化學殺菌劑使用、減少環(huán)境污染、降低抗 藥性，保證食品安全，開發(fā)有效、安全、生態(tài)的生物防治保鮮產(chǎn)品具有重要意義。
[0004] 我國水果采后病害的生物防治研宄起步較晚、基礎較差，現(xiàn)有的研宄也大部分還 是基礎理論研宄，從生防菌篩選鑒定、果蔬適應性、生物防治機理、基因誘變改進等方面進 行了系列研宄與報道，應用性研宄較少，較少能實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。另一方面，我國在水果采前的 生物防治的基礎理論及應用研宄較深入，發(fā)酵工藝、產(chǎn)品生產(chǎn)等工業(yè)化條件較成熟，已有產(chǎn) 業(yè)化產(chǎn)品，為采后生物防治技術的產(chǎn)業(yè)化提供了可能。
[0005] 解淀粉芽孢桿菌是重要的植物病害拮抗菌，普遍存在于土壤、果蔬與植物的表面 及組織內(nèi)，是動植物的有益菌，生態(tài)、環(huán)保，對人無毒、安全，較多研宄及專利報道了其在農(nóng) 作物病害、土壤微生物及促植物生長、土壤肥力改良，水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面的應用，應用范圍廣、 生長適應性強，易在任何介質(zhì)定殖、繁殖，易大量培養(yǎng)、生產(chǎn)工藝簡單，產(chǎn)業(yè)化可行性高。
[0006] 目前解淀粉芽孢桿菌用于采后病害生物防治報道較少，更未有市場化的果蔬采后 病害生物防治解淀粉芽胞桿菌類產(chǎn)品，為此開發(fā)含解淀粉芽孢桿菌用于水果采后病害防治 保鮮的生物產(chǎn)品具重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的第一個目的在于提供一種可有效防治水果采后病害的生物防治菌。
[0008] 本發(fā)明的上述發(fā)明目的是通過以下技術方案達到的：
[0009] 一種解淀粉芽孢桿菌植物亞種ZFH-3菌株，該亞種菌株的分類命名為解淀粉芽孢 桿菌植物亞種（Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarum)，其保藏編號為：CGMCC No. 9884,保藏日為2014年10月30日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研宄所。
[0010] 本發(fā)明的第二個發(fā)明目的是提供一種上述解淀粉芽孢桿菌植物亞種ZFH-3原粉 的制備方法。
[0011] 本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案達到的：
[0012] 一種解淀粉芽孢桿菌植物亞種ZFH-3原粉的制備方法，包括如下步驟：
[0013] (1)、活化菌種
[0014] 活化解淀粉芽孢桿菌植物亞種ZFH-3菌株，待解淀粉芽孢桿菌植物亞種ZFH-3在 LB固體培養(yǎng)基上的菌落乳白色，圓形，明顯突起，表面光滑，不透明，邊緣整齊；
[0015] (2)、一級種子液的制備
[0016] 選取LB固體培養(yǎng)基上的單菌落，接種于一級種子搖瓶中，將一級種子搖瓶在 32°C、180r/min下培養(yǎng)14小時，得到一級種子液；
[0017] (3)、二級種子液的制備
[0018] 種子罐中的培養(yǎng)基仍為LB液體培養(yǎng)基，121°C下，滅菌20min，將一級種子液接入 種子罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束時得到二級種子液；
[0019](4)、解淀粉芽孢桿菌植物亞種ZFH-3菌液發(fā)酵
[0020] 將步驟⑶所得解淀粉芽孢桿菌植物亞種ZFH-3的二級種子液，按照接種量為1 % 接入發(fā)酵罐中，在發(fā)酵培養(yǎng)基下培養(yǎng)，得到發(fā)酵成熟菌劑（主要為芽孢）；
[0021] (5)、解淀粉芽孢桿菌植物亞種ZFH-3菌原粉
[0022] 步驟（4)所得的發(fā)酵成熟菌劑經(jīng)碟片離心機或微濾設備濃縮后，加入輕質(zhì)碳酸 鈣，濃縮成熟菌劑與輕質(zhì)碳酸鈣的重量比為100:3,得到液固混合物，將該液固混合物攪拌 30min后，利用輸料泵將液固混合物送入離心式噴霧塔中干燥，得到解淀粉芽孢桿菌植物亞 種ZH1-3原粉。
[0023] 所述步驟⑴中所述LB培養(yǎng)基配方（g/L):蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，溶 劑為水，pH7. 0-7. 2,固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加2%瓊脂；
[0024] 所述步驟⑶中所述種子罐的接種量為0. 5-1% (V/V);培養(yǎng)條件為：通氣比1 :1， 攪拌轉(zhuǎn)速為250-400r/min，培養(yǎng)溫度32°C，罐壓0. 05Mpa，培養(yǎng)12小時；所述二級種子液的 活菌含量為1-3X108cfu/mL，0D值 0.85 ;
[0025]所述步驟⑷中所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方（重量百分比）：玉米淀粉3%，豆柏 粉3 %，酵母膏0. 9 %，氯化鈉0. 25 %，碳酸鈣0. 25 %，硫酸鎂0. 4 %，磷酸氫二鉀0. 3 %， pH7. 2-7. 5，121°C滅菌30min;培養(yǎng)條件為：通氣比為1 :0. 7,攪拌轉(zhuǎn)速為180r/min、罐壓 0. 05MPa、培養(yǎng)溫度32°C、培養(yǎng)時間為48h，發(fā)酵過程中根據(jù)泡沫情況流加消泡劑；下罐時間 以取樣鏡檢芽孢90%以上釋放為準，成熟發(fā)酵液中解淀粉芽孢桿菌植物亞種ZFH-3活芽孢 含量為 30 ~40X108cfu/mL;
[0026] 所述步驟（5)中所述離心式噴霧塔的干燥條件為：進風口溫度為180_200°C，出風 口溫度為80-85°C，菌原粉中含水量小于5% (W/W)，活芽孢含量2000X108cfu/g。
[0027] 本發(fā)明所述的可有效防治水果采后貯藏病害的物質(zhì)主要指解淀粉芽孢桿菌植物 亞種ZFH-3菌株本身及其產(chǎn)生的所有物質(zhì)。
[0028] 本發(fā)明的第三個目的在于提供一種解淀粉芽孢桿菌植物亞種ZFH-3在防治水果 米后病害中的應用。
[0029]本發(fā)明的上述發(fā)明目的是通過以下技術方案達到的：
[0030] 一種解淀粉芽孢桿菌植物亞種ZFH-3在防治水果采后病害中的應用。
[0031] 其中，所述病害為青霉病、綠霉病、蒂腐病、酸腐病、炭疽病，炭疽病、軸腐病，灰霉 病或軟腐病。
[0032] 其中，所述水果為柑桔，所述病害為柑桔青霉病、柑桔綠霉病、柑桔酸腐病、柑桔炭 疽病或柑桔蒂腐病。
[0033] 其中，所述水果為香蕉，所述病害為香蕉炭疽病或軸腐病。
[0034] 其中，所述水果為草莓，所述病害為草莓灰霉病或軟腐病。
[0035] 本發(fā)明具有下列優(yōu)點和效果：
[0036] 解淀粉芽孢桿菌植物亞種ZFH-3是珠海真綠色技術有限公司從食用真菌根部分 離篩選到的對多種植物病原菌具抑菌作用的菌株，通過獲得的16SrDNA和gyrB基因片段， 在NCBI上BLAST搜索和比對，并結(jié)合菌的形態(tài)、生理生化，判定為一新的解淀粉芽孢桿菌植 物亞種菌株，并于2014年10月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心，保藏編號為CGMCCNo. 9884。
[0037] 本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌植物亞種ZFH-3是從食用真菌類根中部分離篩選到的 對多種植物病原菌具抑菌作用的生防菌，取自自然。解淀粉芽孢桿菌植物亞種ZFH-3是動 植物的有益菌，較多研宄及專利已報道了其在農(nóng)作物病害、土壤微生物及促植物生長、土壤 肥力改良，水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面的應用，生態(tài)、環(huán)保，對人無毒、安全，應用范圍廣、生長適應性 強，在任何介質(zhì)都易于定殖、繁殖，易大量培養(yǎng)、生產(chǎn)工藝簡單，產(chǎn)業(yè)化可行性高。關于在 農(nóng)產(chǎn)品采后病害防治即采后水果保鮮應用研宄報道較少，鑒于解淀粉芽孢桿菌植物亞種 ZFH-3對水果采后病害的有效抑制作用，對人無毒、有利于環(huán)境，安全、生態(tài)、環(huán)保等優(yōu)點，用 于水果采后病害防治，能減少化學藥劑保鮮帶來的食品安全、藥物殘留、環(huán)境污染等問題， 減少化學藥劑使用量，確保食品安全、環(huán)境友好、生態(tài)安全。
[0038] 下面通過附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步說明，但并不意味著對本發(fā)明保 護范圍的限制。
[0039] 保藏信息：
[0040] 解淀粉芽孢桿菌植物亞種ZFH-3菌株，該菌株的分類命名為解淀粉芽孢桿菌植物 亞種（Bacillusamyloliquefacienssubsp.plant