一種日本囊對(duì)蝦g642a單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的篩選及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及日本囊對(duì)蝦，尤其是涉及一種日本囊對(duì)蝦G642A單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn) 的篩選及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 日本囊對(duì)奸（Marsupenaeus japonicus)分布于印度、西太平洋地區(qū)，在我國(guó)主 要分布在長(zhǎng)江口以南近海。其肉質(zhì)鮮嫩可口，可活體運(yùn)輸，且銷(xiāo)售價(jià)格高，是我國(guó)主要的 養(yǎng)殖蝦類之一。目前我國(guó)用于養(yǎng)殖的日本囊對(duì)蝦苗種基本是未經(jīng)選育的海捕野生親蝦 的后代，苗種的生長(zhǎng)速度、抗病能力參差不齊，養(yǎng)殖戶經(jīng)常因?yàn)槊绶N質(zhì)量問(wèn)題導(dǎo)致養(yǎng)殖失 敗。開(kāi)展日本囊對(duì)蝦的品種選育有利于其產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)和健康發(fā)展。日本囊對(duì)蝦因?yàn)樘?殊的納精囊結(jié)構(gòu)，精莢移植技術(shù)至今未能有效突破，選育個(gè)體和家系系譜需要大量的DNA 分子標(biāo)記才能準(zhǔn)確鑒定。Jerry等人曾開(kāi)展過(guò)日本囊對(duì)蝦譜系鑒定工作，因?yàn)椴捎玫奈⑿l(wèi) 星標(biāo)記數(shù)量有限且無(wú)效等位基因等因素導(dǎo)致譜系鑒定準(zhǔn)確率不到50% (Moore S S，Whan V,Davis G P, et al. The development and application of genetic markers for the Kuruma prawn Penaeus japonicus[J].Aquaculture, 1999, 173(1): 19-32)?？梢?jiàn)足夠 數(shù)量DNA分子標(biāo)記是日本囊對(duì)蝦個(gè)體識(shí)別、系譜鑒定的重要前提保障。然而，與其他養(yǎng)殖 對(duì)蝦種類相比，目前日本囊對(duì)蝦雖然已有隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記和微衛(wèi)星DNA標(biāo)記開(kāi) 發(fā)的報(bào)道，但標(biāo)記的數(shù)量和質(zhì)量尚不能滿足系譜鑒定、遺傳連鎖圖譜等研究的需求（宋林 生，相建海，李晨曦，等.日本對(duì)蝦野生種群和養(yǎng)殖種群遺傳結(jié)構(gòu)的RAH)標(biāo)記研究[J].海 洋與湖沼，1999(3) :261-266 ;莊志猛，孔杰，石拓，等.日本對(duì)蝦野生和養(yǎng)殖群體遺傳多 樣性的 RAPD 分析[J]·自然科學(xué)進(jìn)展，2001 (3):28-33 ;Zhao Y, Li Q.Characterization of expressed sequence tag - derived microsatellites from the kuruma prawn, Marsupenaeus japonicus[J]. Molecular ecology notes,2007,7 (6):1248-1250)〇
[0003] 作為新一代的DNA分子標(biāo)記，單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記是基因組中含量最豐富的 分子標(biāo)記，并且遺傳穩(wěn)定性高、分型準(zhǔn)確，易于實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化的檢測(cè)，是當(dāng)前日本 囊對(duì)蝦選育群體遺傳背景調(diào)查、個(gè)體選育、家系系譜鑒定和高密度遺傳連鎖圖譜構(gòu)建的 首選DNA分子標(biāo)記之一。但日本囊對(duì)蝦基因組DNA信息匱乏，有關(guān)其單核苷酸多態(tài)性 標(biāo)記開(kāi)發(fā)、應(yīng)用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。在對(duì)奸科中，Yang Yu等人和Matthew Baranski等 人分別報(bào)道 了凡納濱對(duì)奸（Litopenaeus vannamei) (Yu Y, Wei J, Zhang X，et al. SNP Discovery in the Transcriptome of White Pacific Shrimp Litopenaeus vannamei by Next Generation Sequencing [J]· PloS one, 2014, 9(1) :e87218)和斑節(jié)對(duì)蟲(chóng)下（Penaeus monodon) (Baranski M, Gopikrishna G, Robinson N A, et al. The Development of a High Density Linkage Map for Black Tiger Shrimp(Penaeus monodon)Based on cSNPs[J]. PloS one，2014, 9(1) :e85413)的SNP標(biāo)記篩選，所采用的檢測(cè)分型方法分別是重新測(cè)序分 型和基因芯片分型，標(biāo)記篩選、驗(yàn)證及應(yīng)用的成本較高，并且由于對(duì)蝦種類的不同，二位學(xué) 者所篩選的標(biāo)記不能直接應(yīng)用于日本囊對(duì)蝦的相關(guān)研究中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種日本囊對(duì)蝦G642A單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的篩選及檢 測(cè)方法。
[0005] 本發(fā)明包括以下步驟：
[0006] 1)提取20個(gè)日本囊對(duì)蝦個(gè)體的肝胰腺總RNA，混合樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，拼接日 本囊對(duì)蝦肝胰腺參考轉(zhuǎn)錄本，比對(duì)定位測(cè)序讀端（reads)到參考轉(zhuǎn)錄本篩查單核苷酸多態(tài) 性位點(diǎn)，并篩選比對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于40、次要等位基因頻數(shù)在200以上、次要等位基因頻率高 于20%的位點(diǎn)為候選序列；
[0007] 2)其候選complll69的基因序列為：
[0008] GATGTCGTATTAATGTCTTTATCCAATTAAAAAATCATCATTTATAATTCTAAGCATCTGACGACTATA ATATGTAGGTATAACATTGTACTTATACATGGAGAGTCGAAATCTTGAATCATTTAACCTGTTCCTACAATATCACA AGAGACAAGTAATTGAACCAATCACAATCACAAAAGTAAAGGAAAGAAAGATAGAAAAAAAAAGCAAGCGAAGGAGA AATACATATAAATGTTTCCAACTCTTCCCAACCGCCTTTTAGAAGCGCGCCATTTTTTTTACTTCCTGCGCGCGCAT TCGCTGGCGTACAAATTGTTAATCTGGTTGGCGTCGCTCTGCTCCATGTGATCCTTGTCGTAGGCCTCGACGAGAAT CACGTTAGGATCCGTGGGCACGATGGTTTCGGCGACGCCCCAGTTCACGGAGAAGGAGTAGGTGCCGTAGTGCATGA TGCTCTCGTAGTTGTATCCTTCGCCCACGTACTGCCAGTAGGAGTCCTTGTTGAACTGGGACTCCATGCCAGGCTGC ACATTTTCGAAGTGAATAGTGACGTAGTAGTCGCGGTCGTTACGGGTGTGCTCGTGGTAGAAGCCGACAGCGTGCAT GAGCTCGTGGATGGCCGTGCCCTTGTAGATGCAGCCGTTGCTGTCTAGAGAGACCCTCTGCTTGCCTCCAATGGTGC CTACGTATGACCAGCATCCGCTGTCGTTCGTGACGATTTCGATGTAGTTGCCCTGAGTGGTTCTCTCGACGAAGCGG ATGCAGGTGCGGGCGTGGAAGTCGTCCATCGCGGAGAGGATGAGGGACCTCTGGTAGCTGGTGACAGAACTGCCAAA CACATAGGGAACGACTCCACCGGGCCACAAGTACTGCTCCCCAAGGATGGCAGCGCGTTCCTTCCCTGGTTCCTGTC CTGCAATACCCTTAATGTCACCCTGGAAGAGGTCAGGGTTGTACATGGCCTGAGCCGCCCTTGGGACAACAGGGGTC GCGCCGGCCACGGCCACGACTGCAAGTAAGGCAACGAGCAACATGCTGGTGCGAAGATGAAGGAGAAAGAGAGGAAA CGTGT，其中加粗、加下劃線的堿基為候選G642A_SNP位點(diǎn)；
[0009] 3)米用PAMSA(PCR amplification of multiple specific alleles)方法設(shè)計(jì)特 異性引物為：
[0010] 正鏈引物一 ：5, -TAAAACGTGCCCTTGTAGATGAAG-3,；
[0011] 正鏈引物二：5 ' -AAAACCCCTAAAACGTGCCCTTGTAGATTCAA-3 ' ；
[0012] 負(fù)鏈引物：5' -TTCGTCGAGAGAACCACT-3' ；
[0013] 4)提取日本囊對(duì)蝦背部肌肉的基因組DNA，將其稀釋為50ng/yL;
[0014] 5) PCR 擴(kuò)增；
[0015] 在步驟5)中，所述PCR擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系為30 μ L，包括50ng/μ L日本囊對(duì)蝦 基因組DNA溶液lμL，10XPCRbuf?er3μL，2·5mMdNTPMixs2·4μL，25mMMgCl 24μL， 5U/μ L Taq DNA聚合酶0.15 μ L，IOuM正鏈引物一、正鏈引物二及反鏈引物各0.5 μ L，加 CldH2O 至 30yL;其 PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C變性 IOmin ;94°C 30sec，6(TC 30sec，72°C 30sec， 40個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保存。
[0016] 6)聚丙酰胺凝膠電泳檢測(cè)分型：將PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行6%變性聚丙酰胺凝膠 電泳，并使用銀染進(jìn)行檢測(cè)分型，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，若某一個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在 不同的個(gè)體中可以擴(kuò)增出長(zhǎng)度差異為8個(gè)堿基大小的2種片段，則可認(rèn)為該位點(diǎn)為多態(tài)位 點(diǎn)，其中單個(gè)條帶的個(gè)體為純合體，兩個(gè)條帶的個(gè)體為雜合體，可根據(jù)片段長(zhǎng)度準(zhǔn)確判定個(gè) 體的基因型。
[0017] 本發(fā)明米用 PAMSA(PCR amplification of multiple specific alleles)方法 設(shè)計(jì)特異性引物，可方便、快捷通過(guò)聚丙酰胺凝膠電泳進(jìn)行日本囊對(duì)蝦單核苷酸多態(tài)性標(biāo) 記驗(yàn)證及基因分型，并具有篩選檢測(cè)費(fèi)用低、操作簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，填補(bǔ)了日本囊對(duì)蝦在單 核苷酸多態(tài)性標(biāo)記篩選及應(yīng)用等研究上的空白，有利于日本囊對(duì)蝦系譜鑒定、遺傳連鎖圖 譜構(gòu)建等研究開(kāi)展。另外，本發(fā)明可以在沒(méi)有已知的日本囊對(duì)蝦基因組DNA單核苷酸多態(tài) 性位點(diǎn)的信息下，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組混合樣測(cè)序，利用生物信息學(xué)分析篩選G642A單核苷酸多態(tài) 性位點(diǎn)；并采用PAMSA方法設(shè)計(jì)特異性引物，不僅可便捷的通過(guò)聚丙酰胺凝膠電泳完成日 本囊對(duì)蝦G642A單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)、驗(yàn)證及基因分型，而且篩選檢測(cè)費(fèi)用低、操作簡(jiǎn)便快 速。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1提供的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)G642A_SNP對(duì)日本囊對(duì)蝦24個(gè) 個(gè)體的檢測(cè)圖譜（編號(hào)1?24是日本囊對(duì)蝦24個(gè)個(gè)體，AA、AG、GG是不同個(gè)體的基因型， 100bp、150bp是Marker不同片段的長(zhǎng)度）
[0019] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例2提供的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)G642A_SNP對(duì)日本囊對(duì)蝦G642A_ SNP GG型個(gè)體測(cè)序峰圖。
[0020] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例2提供的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)G642A_SNP對(duì)日本囊對(duì)蝦G642A_ SNP AG型個(gè)體測(cè)序峰圖。
[0021] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例2提供的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)G642A_SNP對(duì)日本囊對(duì)蝦G642A_ SNP AA型個(gè)體測(cè)序峰圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0023] 首先提取日本囊對(duì)蝦肝胰腺的混合樣的總RNA，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，拼接日本囊對(duì)蝦肝胰 腺參考轉(zhuǎn)錄本，比對(duì)定位測(cè)序讀端（reads)到參考轉(zhuǎn)錄本篩查單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，并篩 選比對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于40、次要等位基因頻數(shù)在200以上、次要等位基因頻率高于20%的位 點(diǎn)為候選序列；米用 PAMSA(PCR amplification of multiple specific alleles)方法來(lái) 設(shè)計(jì)候選序列的特異性引物；提取日本囊對(duì)蝦背部肌肉基因組DNA并稀釋備用，使用設(shè)計(jì) 的特異性引物對(duì)不同個(gè)體的日本囊對(duì)蝦基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行6 %的變 性聚丙烯酰胺凝膠電泳，并根據(jù)電泳片段長(zhǎng)度不同確定不同個(gè)體的基因型。
[0024] 實(shí)施例1 :
[0025] 1、利用生物信息學(xué)分析，獲得含有候選單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的拼接序列，具體過(guò)程 如下：首先進(jìn)行混合樣品的日本囊對(duì)蝦肝胰腺的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并使用trinity軟件按默認(rèn) 參數(shù)拼接肝胰腺參考轉(zhuǎn)錄本，使用BWA軟件按默認(rèn)參數(shù)比對(duì)定位轉(zhuǎn)錄組測(cè)序