一種檢測藍狐物種成分的特異性引物及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測藍狐物種成分的特異性引物及其應用，屬于動物源性成分特 異性檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 藍狐也稱北極狐，是屬于犬科、北極狐屬的毛皮動物，在我國作為特種養(yǎng)殖動物已 有幾十年的歷史。藍狐皮張性能優(yōu)良，深受裘皮市場的青睞。近年來，藍狐的毛皮制品市場 需求量很大，養(yǎng)殖數(shù)量也不斷擴大。冬季取皮后，藍狐肉作為副產(chǎn)物，往往被添加到動物飼 料甚至是食品中。目前我國畜牧業(yè)行業(yè)中針對于毛皮動物肉的檢驗檢疫相關管理規(guī)定仍處 于空白階段，對于毛皮動物肉營養(yǎng)價值的研宄很少，并且人們對于食用毛皮動物藍狐肉存 在認識上的誤區(qū)，有些地區(qū)受到風俗習慣的影響，從心理上很難接受。
[0003] 藍狐養(yǎng)殖每年產(chǎn)出皮張數(shù)量達4000萬張，藍狐胴體重量達20萬噸，有的經(jīng)酸化等 處理用作飼料，由于藍狐胴體價格較便宜，受到利益驅使，常有不法商販將藍狐肉摻雜在羊 肉等其他肉制品中銷售，這樣不僅侵害了消費者的利益，而且極有可能傳播疾病，對人類健 康造成危害。因此，提供一種能夠快速準確檢測藍狐源性成分的方法十分必要。傳統(tǒng)感官方 法鑒定藍狐等畜產(chǎn)品源性成分，依據(jù)色澤、氣味、組織性狀等進行判斷，受到很多條件的限 制。一旦是添加了色素、芳香劑以及受到深度加工的制品，增加了鑒定難度以及監(jiān)控監(jiān)管的 風險性?；赑CR技術建立起來的方法已經(jīng)成功應用在一些常見家畜、家禽物種中，如牛， 馬，雞等源性成分的鑒定，技術條件成熟，已有檢測試劑盒問世。目前，仍然沒有從分子水平 對藍狐物種源性成分進行快速鑒別、鑒定的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種檢測藍狐物種成分的特異性引物及其應用， 所采取的技術方案如下：
[0005] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種檢測藍狐物種成分的特異性引物，該引物是以赤 狐物種的線粒體全基因組序列為參考序列，篩選出藍狐線粒體基因組中進化速率較快的區(qū) 段，根據(jù)相應區(qū)段設計引物，最后對引物進行特異性驗證后篩選出的引物。
[0006] 優(yōu)選地，所述引物是以GENBANK:GQ374180. 1區(qū)段為模板設計得到的特異性引物。
[0007] 所述引物的正向引物和反向引物的核苷酸序列如下：
[0008] 正向引物：5,-ACATTCATACTATTCATACTGACG-3' ；
[0009] 反向引物：5' -GACAACAATTATATCATTTTTTGTTAG-3'。
[0010] 所述引物通過PCR特異性擴增藍狐線粒體基因片段產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示。
[0011] 所述引物用于檢測肉制品、飼料和毛皮產(chǎn)品中的藍狐物種成分。
[0012] 所述引物擴增的條件為：預變性：94°C，3min ;進入循環(huán)：94°C變性30s，58°C退火 30s，72°C延伸30s，35次循環(huán)；終止延伸：72°C，IOmin ;4°C保存反應產(chǎn)物。
[0013] 本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種含有所述特異性引物的試劑盒，該試劑盒包 括 10 X PCR 緩沖液、I Oumo I /L 正向引物、I Oumo I /L 反向引物、I Oumo I /L dNTP 和 5U/uLTaqDNA 聚合酶。
[0014] 優(yōu)選地，所述試劑盒包括10 XPCR緩沖液、lOumol/L正向引物、lOumol/L反向引 物、lOumol/L dNTP 和 5U/uLTaqDNA 聚合酶；
[0015] 其中，正向引物：5' -ACATTCATACTATTCATACTGACG-3'
[0016] 反向引物：5' -GACAACAATTATATCATTTTTTGTTAG-3'。
[0017] 所述試劑盒用于檢測肉制品、飼料和毛皮產(chǎn)品中的藍狐物種成分。
[0018] 所述引物擴增的條件為：預變性：94°C，3min ;進入循環(huán)：94°C變性30s，58°C退火 30s，72°C延伸30s，35次循環(huán)；終止延伸：72°C，IOmin ;4°C保存反應產(chǎn)物。
[0019] 線粒體基因組作為動物細胞核外遺傳物質(zhì)，具有進化快，結構簡單，母性遺傳等特 點，常常被用作分子進化分析的手段。本發(fā)明針對線粒體基因組序列進行分析比對，從NCBI 查找與藍狐同屬不同種的其他動物的線粒體基因組，獲得遺傳物質(zhì)DNA信息序列，利用軟 件ClustalX進行序列比對，尋找藍狐的特異性片段序列，在此基礎上設計引物，目標是該 引物只能擴增出藍狐的特異性條帶，不能擴增出其他動物的成分，利用電泳圖譜比對，從而 將藍狐成分檢測出來。從藍狐肝臟組織中提取線粒體基因組，利用設計好的引物，摸索適宜 的PCR反應條件，檢測結果用電泳驗證，同時將擴增條帶進行測序分析，與已知相近物種序 列進行比對來驗證擴增條帶的正確性。
[0020] 本發(fā)明獲得的有益效果如下：
[0021] (1)操作簡單：根據(jù)藍狐相近種屬赤狐的物種線粒體基因組特異基因序列設計用 于PCR檢測的引物，動物線粒體基因組提取對樣本組織進行了前處理、優(yōu)化了 PCR擴增體系 條件。
[0022] (2)特異性強：提供了一種藍狐源性成分的PCR檢測方法，可準確、快速鑒定藍狐 源性成分，能夠有效抵御假冒動物源性成分產(chǎn)品摻假，在食品、飼料以及皮毛類產(chǎn)品的鑒定 上具有很大的實用價值。同時能有效阻止藍狐傳播的某些疾病病原的傳播與蔓延。
[0023] (3)檢測條件要求低：本方法只需要具備普通的PCR擴增儀器及常規(guī)的化學試劑 藥品即可完成。
[0024] (4)本發(fā)明優(yōu)化了肝臟樣品前處理方法，可以快速提取線粒體DNA，有效減少了樣 本基因組DNA中核基因組的影響，DNA純度高，提高了檢測的靈敏度，針對引物序列采取的 PCR擴增體系也保證了檢測的特異性與靈敏度。
[0025] (5)本發(fā)明針對藍狐的物種特異性遺傳物質(zhì)DNA的PCR分子鑒定技術，具有特異性 高、針對性強、靈敏度高、簡便快速、對檢測樣品要求低的特點，能夠準確客觀的提供實驗證 據(jù)。
【附圖說明】
[0026] 圖1為藍狐肝臟組織線粒體基因組DNA電泳檢測圖；
[0027] (1、2、3、4均是藍狐線粒體基因組，M為Marker2000)。
[0028] 圖2為藍狐樣本PCR擴增電泳圖片；
[0029] (M，Marker2000 ;1，藍狐特異性引物擴增條帶）。
[0030] 圖3為檢測方法特異性驗證電泳圖；
[0031] (1，貉；2,水貂；3,犬；4,豬；5,牛；6,羊；7,藍狐；M，Marker2000)。
【具體實施方式】
[0032] 下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。
[0033] 實施例1特異性引物的設計及應用
[0034] (I) PCR檢測方法特異性引物的設計
[0035] 下載GenBank中公布的犬科狐屬、北極狐屬、絡屬等動物線粒體全基因組序列，最 終選定與藍狐種屬關系最近、線粒體基因組序列信息較為豐富的赤狐物種的線粒體全基因 組序列，作為本實驗設計引物的參考序列，應用生物分析軟件CLUSTAL X對16723bp進行細 化比對分析，我們發(fā)現(xiàn)在約I. 6kb長度的藍狐線粒體全基因組序列中有10處進化速率較快 的區(qū)段，變異性強的位點初步確定適于設計特異性擴增引物；針對這10個區(qū)段周圍的基因 序列進行引物設計之前的分析篩選，排除易于產(chǎn)生引物二聚體以及退火溫度區(qū)間不適宜等 因素干擾的位置，第二輪篩選確定4個區(qū)段作為設計引物位點，進一步開展PCR及電泳實驗 進行驗證，篩選出區(qū)段GENBANK:GQ374180. 1用于設計特異性引物，其余區(qū)段均不適合設計 特異性引物。根據(jù)引物設計規(guī)律和堿基配對原則，采用Primer5. 0軟件根據(jù)GQ374180. 1設 計了特異性引物。4對引物如表1所示：
[0036] 表1設計的4對特異性引物序列
[0037]
【主權項】
1. 一種檢測藍狐物種成分的特異性引物，其特征在于，以赤狐物種的線粒體全基因組 序列為參考序列，篩選出藍狐線粒體基因組中進化速率較快的區(qū)段，根據(jù)相應區(qū)段設計引 物，最后對引物進行特異性驗證后篩選出的引物。
2. 權利要求1所述引物，其特征在于，是以GENBANK:GQ374180. 1區(qū)段為模板設計得到 的特異性引物。
3. 權利要求2所述引物，其特征在于，正向引物和反向引物的核苷酸序列如下： 正向引物：5'-ACAITCATACTAITCATACTGACG-3' ； 反向引物：5'-GACAACAATTATATCAiriTITGTTAG-3'。
4. 權利要求2所述引物，其特征在于，通過PCR特異性擴增藍狐線粒體基因片段產(chǎn)物的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示。
5. 權利要求2所述引物用于檢測肉制品、飼料和毛皮產(chǎn)品中的藍狐物種成分。
6. 權利要求5所述方法，其特征在于，所述引物擴增的條件為：預變性：94°C，3min ;進 入循環(huán)：94°0變性3〇8,581：退火3〇8,721：延伸3〇8,35次循環(huán)；終止延伸 ：721：，1〇111111;4°〇 保存反應產(chǎn)物。
7. 含有權利要求1所述特異性引物的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括10XPCR緩 沖液、10umol/L 正向引物、10umol/L 反向引物、10umol/L dNTP 和 5U/uLTaqDNA 聚合酶。
8. 權利要求7所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括10 X PCR緩沖液、10umol/L正 向引物、l〇umol/L 反向引物、10umol/L dNTP 和 5U/uLTaqDNA 聚合酶； 其中，正向引物：5' -ACAITCATACTAITCATACTGACG-3' 反向引物：5'-GACAACAATTATATCAiriTITGTTAG-3'。
9. 權利要求7所述試劑盒用于檢測肉制品、飼料和毛皮產(chǎn)品中的藍狐物種成分。
10. 權利要求9所述方法，其特征在于，所述引物擴增的條件為：預變性：94°C，3min ; 進入循環(huán)：94°0變性3〇8,581：退火3〇8,721：延伸3〇8,35次循環(huán) ；終止延伸：721：，1〇111111; 4°C保存反應產(chǎn)物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測藍狐物種成分的特異性引物及其應用，屬于動物源性成分特異性檢測技術領域。本發(fā)明所提供的檢測藍狐物質(zhì)成分的特異性引物的正向引物和反向引物分別為：正向引物：5'-ACATTCATACTATTCATACTGACG-3'，反向引物：5'-GACAACAATTATATCATTTTTTGTTAG-3'。本發(fā)明還提供了含有特異性引物的試劑盒以及利用特異性引物檢測肉制品和飼料中藍狐物種成分的方法。本發(fā)明所提供的方法具有操作方便快速、特異性強、檢測條件要求低、靈敏度高的特定，適用于肉制品、飼料和毛皮類產(chǎn)品中藍狐物種成分的檢測。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104611456
【申請?zhí)枴緾N201510092862
【發(fā)明人】孫偉麗, 李光玉, 王卓, 劉晗璐, 張鐵濤, 楊雅涵
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年3月2日