一種林蛙油抗氧化多肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白多肽領(lǐng)域，具體涉及了一種林蛙油抗氧化多肽。
【背景技術(shù)】
[0002] 林蛙油，俗稱蛤蟆油或雪蛤膏，《本草綱目》記載：哈士蟆，《本草綱目》中稱之"山 哈"，別名哈士蟆、雪蛤。現(xiàn)今被命名為中國(guó)林蛙。主要生長(zhǎng)在中國(guó)東北山區(qū)，包括長(zhǎng)白山脈， 小興安嶺大部，張廣才嶺腹地，純野生動(dòng)物，亦被稱為哈什螞（哈士?。?，是東北地區(qū)特有的 蛙種，其雌蛙輸卵管的干燥物稱之為"雪蛤油"，具有補(bǔ)虛潤(rùn)肺、強(qiáng)身健體的功效，自古在民 間就被譽(yù)為與東北三寶齊名的傳世滋補(bǔ)佳品。千百年來(lái)廣為人們應(yīng)用，其藥理作用亦早已 為人所知。林蛙油是雌蛙懷卵成熟期的輸卵管，其含有大量氨基酸、無(wú)機(jī)元素、維生素和多 種復(fù)合多肽等生物活性因子，特別富含三種性激素，即雌二醇、睪酮、孕酮，具有在醫(yī)學(xué)上有 "軟黃金"之稱，具有顯著的滋陰強(qiáng)腎激發(fā)免疫功能和調(diào)節(jié)機(jī)理作用，廣泛用于食品、保健品 和化妝品等領(lǐng)域。
[0003]目前，以林蛙油為原料加工而成的護(hù)膚產(chǎn)品，由于蛋白的分子量過(guò)大而不易被人 體吸收。采用常規(guī)的一步酶解法進(jìn)行酶解后，得到的多肽分子量不均一，且小分子量的多肽 含量少，依然無(wú)法實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的高效利用。因此，亟需提供一種能夠被人體吸收的、抗氧 化效果好的林蛙油多肽。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種以林蛙油為原料提取而成的抗氧 化多肽，該所述多肽的分子量小，且擁有優(yōu)異抗氧化活性，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0005] 本發(fā)明提供了一種林蛙油抗氧化多肽，所述抗氧化多肽以林蛙油為原料，由包括 以下步驟的方法制備而成：
[0006] 1)取林蛙油，去除筋膜，加入2?10倍于林蛙油體積的水，置于2?4°C泡發(fā)8? 12h，得林蛙油溶液；
[0007]2)調(diào)節(jié)步驟1)所得林蛙油溶液的pH值為1. 6?1. 8,加入0. 1?0. 3g/ml胃蛋 白酶，在35?40°C下充分酶解，得胃蛋白酶解液；
[0008] 3)調(diào)節(jié)將步驟2)所得胃蛋白酶解液的pH值為6. 0?7. 0,加入0. 2?0. 4g/ml 中性蛋白酶，在45?55°C下充分酶解，得中性蛋白酶解液；
[0009] 4)調(diào)節(jié)步驟3)所得中性蛋白酶酶解液的pH值為7. 0?8. 0,加入0. 2?0. 4g/ml 菠蘿蛋白酶，在55?60°C下充分酶解，得菠蘿酶解液；
[0010] 5)將步驟4)所得菠蘿酶解液加熱至70?75°C，靜置10?15min，使酶滅活，得酶 解液；
[0011] 6)取步驟5)所得酶解液，使用0.3?0.4i!m的濾膜過(guò)濾，收集濾液，再使用截留 分子量為4?5kD的超濾膜過(guò)濾，收集濾液，加入活性炭室溫低速攪拌1?3h后，過(guò)濾除去 活性炭，真空濃縮，噴霧干燥，即得林蛙油抗氧化多肽。
[0012] 本發(fā)明使用的林蛙油可為市售的林蛙油，優(yōu)選為新鮮的林蛙油。為了使林硅油中 的蛋白充分分解成小分子多肽，本發(fā)明采用胃蛋白酶-中性蛋白酶-菠蘿蛋白酶的多步酶 解，具體而言：
[0013] 本發(fā)明步驟2)中，所述胃蛋白酶的比活為3000?5000U/g，加入量?jī)?yōu)選為0. 2g/ ml，酶解溫度優(yōu)選為38°C;酶解應(yīng)充分，但若時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)對(duì)多肽活性產(chǎn)生影響，酶解時(shí)間 優(yōu)選為4?5h，進(jìn)一步優(yōu)選為4. 5h;
[0014] 本發(fā)明步驟3)中，所述中性蛋白酶的比活為40000?70000U/g，加入量?jī)?yōu)選為 0. 3g/ml，酶解溫度優(yōu)選為50°C;酶解應(yīng)充分，但若時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)對(duì)多肽活性產(chǎn)生影響，酶解 時(shí)間優(yōu)選為3?4h，進(jìn)一步優(yōu)選為3. 5h;
[0015] 本發(fā)明步驟4)中，所述菠蘿蛋白酶的比活為600000?900000U/g，加入量?jī)?yōu)選為 0. 3g/ml，酶解溫度優(yōu)選為58°C;酶解應(yīng)充分，但若時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)對(duì)多肽活性產(chǎn)生影響，酶解 時(shí)間優(yōu)選為2?3h，進(jìn)一步優(yōu)選為2. 5h。
[0016] 作為優(yōu)選方案，本發(fā)明所述林蛙油抗氧化多肽由包括以下步驟的方法制備而成：
[0017] 1)取林蛙油，去除筋膜，加入2?10倍于林蛙油體積的水，置于2?4°C泡發(fā)8? 12h，得林蛙油溶液；
[0018] 2)調(diào)節(jié)步驟1)所得林蛙油溶液的pH值為1.6?1.8,加入酶的比活為3000? 5000U/g的0. 1?0. 3g/ml胃蛋白酶，在35?40°C下酶解4?5h，得胃蛋白酶解液；
[0019] 3)調(diào)節(jié)將步驟2)所得胃蛋白酶解液的pH值為6.0?7.0,加入酶的比活為 40000?70000U/g的0. 2?0. 4g/ml中性蛋白酶，在45?55°C下酶解3?4h，得中性蛋白 酶解液；
[0020] 4)調(diào)節(jié)步驟3)所得中性蛋白酶酶解液的pH值為7.0?8.0,加入酶的比活為 600000?900000U/g的0. 2?0. 4g/ml菠蘿蛋白酶，在55?60°C下酶解2?3h，得菠蘿酶 解液；
[0021] 5)將步驟4)所得菠蘿酶解液加熱至70?75°C，靜置10?15min，使酶滅活，得酶 解液；
[0022] 6)取步驟5)所得酶解液，使用0. 3?0. 4iim的濾膜過(guò)濾，收集濾液，再使用截留 分子量為4?5kD的超濾膜過(guò)濾，收集濾液，加入活性炭室溫低速攪拌1?3h后，過(guò)濾除去 活性炭，真空濃縮，噴霧干燥，即得林蛙油抗氧化多肽。
[0023] 為了保證制備得到的林蛙油抗氧化多肽的活性，除了酶解反應(yīng)對(duì)溫度的特別要求 夕卜，本發(fā)明各個(gè)步驟的操作溫度均優(yōu)選為〇?4°C。
[0024] 本發(fā)明進(jìn)一步保護(hù)所述林蛙油抗氧化多肽在制備化妝品、食品、保健品、藥品中的 應(yīng)用。
[0025] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案克服了林蛙油中的蛋白、多肽分子量大 或不均一，從而導(dǎo)致難以被人體吸收的缺陷。本發(fā)明提供的林蛙油多肽中，含有豐富的、分 子量均一的小分子多肽，經(jīng)檢測(cè)，所述林蛙油抗氧化多肽具有良好的抗氧化效果。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 按照以下步驟制備林蛙油抗氧化多肽：
[0029] 1)取林蛙油200ml，去除筋膜，加入1600ml水，置于3°C泡發(fā)10h，得林蛙油溶液；
[0030] 2)調(diào)節(jié)步驟1)所得林蛙油溶液的pH值為1. 7,加入酶的比活為4000U/g的0. 2g/ ml胃蛋白酶，在38 °C下酶解4. 5h，得胃蛋白酶解液；
[0031] 3)調(diào)節(jié)將步驟2)所得胃蛋白酶解液的pH值為6. 5,加入酶的比活為60000U/g的 0. 3g/ml中性蛋白酶，在50°C下酶解3. 5h，得中性蛋白酶解液；
[0032] 4)調(diào)節(jié)步驟3)所得中性蛋白酶酶解液的pH值為7. 5,加入酶的比活為800000U/ g的0. 3g/ml菠蘿蛋白酶，在58°C下酶解2. 5h，得菠蘿酶解液；
[0033] 5)將步驟4)所得菠蘿酶解液加熱至72 °C，靜置12min，使酶滅活，得酶解液；
[0034] 6)取步驟5)所得酶解液，使用0. 35ym的濾膜過(guò)濾，收集濾液，再使用截留分子量 為4kD的超濾膜過(guò)濾，收集濾液，加入活性炭室溫低速攪拌2h后，過(guò)濾除去活性炭，真空濃 縮，噴霧干燥，即得林蛙油抗氧化多肽。
[0035] 實(shí)施例2
[0036] 按照以下步驟制備林蛙油抗氧化多肽：
[0037] 1)取林蛙油200ml，去除筋膜，加入400ml7jC，置于2°C泡發(fā)8h，得林蛙油溶液；
[0038] 2)調(diào)節(jié)步驟1)所得林蛙油溶液的pH值為1. 6,加入酶的比活為3000U/g的0.lg/ ml胃蛋白酶，在35°C下酶解4h，得胃蛋白酶解液；
[0039] 3)調(diào)節(jié)將步驟2)所得胃蛋白酶解液的pH值為6. 0,加入酶的比活為40000U/g的 0. 2g/ml中性蛋白酶，在45°C下酶解3h，得中性蛋白酶解液；
[0040] 4)調(diào)節(jié)步驟3)所得中性蛋白酶酶解液的pH值為7. 0,加入酶的比活為600000U/ g的0. 2g/ml菠蘿蛋白酶，在55°C下酶解2h，得菠蘿酶解液；
[0041] 5)將步驟4)所得菠蘿酶解液加熱至70°C，靜置lOmin，使酶滅活，得酶解液；
[0042] 6)取步驟5)所得酶解液，使用0. 3ym的濾膜過(guò)濾，收集濾液，再使用截留分子量 為4kD的超濾膜過(guò)濾，收集濾液，加入活性炭室溫低速攪拌lh后，過(guò)濾除去活性炭，真空濃 縮，噴霧干燥，即得林蛙油抗氧化多肽。
[0043] 實(shí)