產(chǎn)酶溶桿菌oh11中一種抗真菌和卵菌活性的代謝產(chǎn)物及其分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及來(lái)源于產(chǎn)酶溶桿菌OH11的一種抗真菌和卵菌活性代謝產(chǎn)物及其分離 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 溶桿菌（Lysobacterspp.)屬于黃單胞科（Xanthomonadaceae)、溶桿菌屬 (Lysobacter)。1978年，溶桿菌屬正式建立。近年來(lái)，通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分類學(xué)方法完善了溶桿 菌屬的分類地位，截止2014年7月，國(guó)際上已鑒定的溶桿菌屬細(xì)菌有32個(gè)種。該屬細(xì)菌無(wú) 鞭毛但有滑移性，對(duì)許多微生物，如真菌、卵菌、酵母、細(xì)菌、單細(xì)胞藻類和線蟲都有較好的 拮抗活性，是一類具有重要生防和藥用潛力的革蘭氏陰性菌。其作用機(jī)理為：（1)產(chǎn)生小分 子抗菌次生代謝產(chǎn)物；（2)分泌產(chǎn)生大量胞外酶，包括幾丁質(zhì)酶、0-1，3-葡聚糖、蛋白酶和 纖維素酶；（3)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性；(4)較好的定殖能力。
[0003] 產(chǎn)酶溶桿菌（Lysobacterenzymogenes)0H11是本實(shí)驗(yàn)室自主分離的一個(gè)菌株。 室內(nèi)抑菌試驗(yàn)表明，該菌對(duì)多種植物病原真菌、卵菌和細(xì)菌均有較強(qiáng)的拮抗活性；溫室防 病試驗(yàn)表明，該菌對(duì)植物真菌、卵菌和細(xì)菌病害的總體防治效果為50% - 70% (見專利 ZL200710190998.6)。進(jìn)一步研宄表明：0H11能產(chǎn)生多種抗菌小分子代謝產(chǎn)物和胞外酶，而 且這些小分子代謝產(chǎn)物是其具有抗菌活性的主要原因，因此，分離鑒定對(duì)真菌和卵菌具有 拮抗作用的小分子化合物對(duì)于闡明溶桿菌作用機(jī)制，開發(fā)新型殺菌劑或農(nóng)藥先導(dǎo)化合物具 有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對(duì)上述問(wèn)題提供產(chǎn)酶溶桿菌0H11中一種抗真菌和卵菌活性代 謝產(chǎn)物及其衍生物。
[0005] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供產(chǎn)酶溶桿菌0H11的一種抗真菌和卵菌活性代謝產(chǎn)物 的制備方法及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] 一種從產(chǎn)酶溶桿菌0H11發(fā)酵液中分離的抗真菌和卵菌活性代謝產(chǎn)物，該產(chǎn)物的 結(jié)構(gòu)式如式I:
[0008]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種從產(chǎn)酶溶桿菌OHll發(fā)酵液中分離的抗真菌和卵菌活性代謝產(chǎn)物，其特征在于： 該產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式如式I:
2. -種從產(chǎn)酶溶桿菌0H11發(fā)酵液中分離的抗真菌和卵菌活性代謝產(chǎn)物的衍生物，其 特征在于：該衍生物的結(jié)構(gòu)式如式II :
其中，Ri為 H、0H、F、C1、化、I 或 OR 3; R2為 H、OH、F、Cl、化、I 或 OR 4; R3, R4彼此獨(dú)立地為R 5C0-; Rs為H或C1-C4的燒基。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的從產(chǎn)酶溶桿菌0H11發(fā)酵液中分離的抗真菌和卵菌活性代謝 產(chǎn)物，其特征在于；Ri為H、0H、C1、化、I或0R3;R2為H、0H、C1、化、I或0R4;Rs為H或邸3。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的從產(chǎn)酶溶桿菌0H11發(fā)酵液中提取的抗真菌和卵菌活性代謝 產(chǎn)物，其特征在于；該產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式如式II -a?S ;


5. -種從產(chǎn)酶溶桿菌OHll發(fā)酵液中分離的抗真菌和卵菌活性代謝產(chǎn)物的方法，其特 征在于：該方法包括W下步驟： (1)挑取產(chǎn)酶溶桿菌0H11單菌落于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)得到種
子液，取種子液按0. 5?1. 5 %的接種量接種至5?15% TSB的培養(yǎng)基中，在攬拌的條件下 發(fā)酵50?10化，得到產(chǎn)酶溶桿菌OH11發(fā)酵液； (2) 調(diào)節(jié)產(chǎn)酶溶桿菌OH11發(fā)酵液抑值至2?4后用有機(jī)溶劑萃取，萃取后蒸干有機(jī)溶 劑后得粗提物； (3) 將粗提物采用有機(jī)溶劑溶解后，依次采用柱層析法和色譜法分離得到目標(biāo)產(chǎn)物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的從產(chǎn)酶溶桿菌OH11發(fā)酵液中分離的抗真菌和卵菌活性代謝 產(chǎn)物的方法，其特征在于：步驟1)中種子液按0. 9?1. 2 %的接種量接種至5?15 %的TSB 培養(yǎng)基中；發(fā)酵過(guò)程中保持溫度為25?30°C，攬拌的速度為180?220rpm，發(fā)酵的時(shí)間為 70 ?75h。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的從產(chǎn)酶溶桿菌OH11發(fā)酵液中分離的抗真菌和卵菌活性代謝 產(chǎn)物的方法，其特征在于：步驟2)中的萃取所用的有機(jī)溶劑為甲醇、己醇、丙酬、二氯甲燒、 S氯甲燒、己酸己醋和正了醇中的至少一種；優(yōu)選萃取所用的有機(jī)溶劑為己酸己醋。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的從產(chǎn)酶溶桿菌OH11發(fā)酵液中分離的抗真菌和卵菌活性代謝 產(chǎn)物的方法，其特征在于：步驟3)中先采用反相柱層析分離，分離過(guò)程中洗脫溶劑依次為： &0, 20 % MeOH-H2〇, 40 % MeOH-H2〇, 60 % MeOH-H2〇, 80 % MeOH-H2〇, 100 % MeOH，分份收集，收 集后義用HPLC法制備，其中HPLC法制備的條件如下； 柱子；Agilent XDB-C185]im 9. 4X250 ym 流速；4mL/min 流動(dòng)相；己膳與水的體積比為=55 ;45 檢測(cè)波長(zhǎng)；318皿。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的從產(chǎn)酶溶桿菌0H11發(fā)酵液中分離的抗真菌和卵菌活性代謝 產(chǎn)物的方法，其特征在于：步驟3)中先采用Se地adex LH-20柱層析分離，分離過(guò)程中的洗 脫溶劑為100% MeOH，分份收集，收集后采用HPLC法制備，合并洗脫液，烘干得到純品，其中 HPLC法制備的條件如下： 柱子；Agilent XDB-C185]im 9. 4X250 ym 流速；4mL/min 流動(dòng)相；己膳與水的體積比為=55 ;45 檢測(cè)波長(zhǎng)；318皿。
10. 權(quán)利要求1分離得到的代謝產(chǎn)物對(duì)真菌和卵菌具有括抗作用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了產(chǎn)酶溶桿菌OH11中一種抗真菌和卵菌活性的代謝產(chǎn)物及其分離方法。所述的分離方法是首先將產(chǎn)酶溶桿菌OH11接種至TSB培養(yǎng)液中，發(fā)酵50～100h后，得到產(chǎn)酶溶桿菌OH11發(fā)酵液；之后調(diào)節(jié)發(fā)酵液至酸性，依次經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑萃取，柱層析和色譜法分離制備得到目標(biāo)產(chǎn)物。采用高分辨率質(zhì)譜與核磁共振等技術(shù)，確定了該產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，它是一種含有四胺酸殘基的大環(huán)內(nèi)酰胺類化合物，分子式為C29H40O6N2。得到的代謝產(chǎn)物及其衍生物具有較好的抗真菌和卵菌活性。
【IPC分類】A01N43-90, C12R1-01, C12P17-18, A01P3-00, C07D487-08
【公開號(hào)】CN104592239
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410823196
【發(fā)明人】劉鳳權(quán), 錢國(guó)良, 沈艷
【申請(qǐng)人】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年5月6日
【申請(qǐng)日】2014年12月25日