GLP-1類似物和amylin類似物的融合蛋白制備及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領域，具體涉及一種新型融合蛋白的制備及其用途。
【背景技術】
[0002] 血糖的穩(wěn)態(tài)受胰島素和體內多種激素嚴密調節(jié)，對維持機體的正常功能具有重要 作用。然而，由于胰島素分泌缺陷和/或胰島素作用障礙將導致以高血糖為特征的代謝性 疾病。持續(xù)高血糖與長期代謝紊亂等可導致全身組織器官，特別是眼、腎、心血管及神經 系統(tǒng)的損害及其功能障礙和衰竭。其中體內天然存在的調節(jié)胰島素和血糖水平的激素有 GLP-I (glucagon-like peptide-1，GLP-1)和amylin，兩種激素的類似物已開發(fā)成臨床用 藥，如GLP-I類似物"百泌達"（Byetta，Amylin制藥）和"諾和力"（Victoza，諾和諾德制 藥）以及amylin類似物"普蘭林肽"（Pramlintide, Amylin制藥）。臨床藥物試驗表明，這 些藥物能調節(jié)胰島素的產生和作用以及其它相關激素水平，可控制體內血糖水平，從而達 到預防和治療以高血糖為特征的代謝性疾病。但是，3種藥物均需一日一次或多次注射給 藥，患者的依從性并不令人滿意，目前，已有多種長效制劑在開發(fā)中，如Amylin制藥公司的 長效注射劑Bydureon和禮來制藥公司的GLP-I類似物Dulaglutide (LY2189265)均為每周 1次注射，用于治療2型糖尿病。
[0003] GLP-I主要通過刺激胰島素分泌和抑制胰高血糖素分泌發(fā)揮調節(jié)血糖的作用，同 時，GLP-I也能抑制P細胞凋亡，促其再生；GLP-I也能減慢胃排空速度，并通過作用下丘 腦，抑制食欲。Amylin是一種由37個氨基酸殘基構成的多肽激素，與胰島素共分泌自胰腺 3細胞，主要生理功能為減緩胃排空和延遲葡萄糖吸收，還通過抑制胰高血糖素減少肝糖 的產生，減少食欲，輔助胰島素調節(jié)血糖水平。Amylin類似物"普蘭林肽"輔助胰島素治療 糖尿病的療效已得到證實；近年來，Amylin類似物的療效尤其對肥胖型糖尿病的療效備受 關注。GLP-I和Amylin在體內均能調節(jié)血糖水平，但二者在功能上有所不同，作用可以互 補。James L.Trevaskis(PLOS ONE ;0ctober2013，Volume8，Issuel0)等人以化學合成的方 式將二者融合，擬行使兩種激素的生理作用。動物實驗表明，融合肽優(yōu)于兩種肽類激素單獨 作用的效果，在降低體重的效果尤為顯著。由于該融合肽分子仍然偏小，易于被體內蛋白酶 降解或腎小球濾過，導致體內半衰期短，因而限制了其臨床應用的價值。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種GLP-I類似物和Amylin類似物的融合蛋白，該融合蛋白 針對現(xiàn)有技術中GLP-I類似物或Amylin類似物以及二者的化學融合其半衰期短，需每天 注射等缺陷而設計，該融合蛋白具有GLP-I和Amylin的雙重生理活性，且具有長效功能，可 實現(xiàn)協(xié)同降糖同時伴隨體重下降的作用。
[0005] 本發(fā)明提供的融合蛋白由DNA重組技術或基因工程手段實現(xiàn)，并由以下通式表 示：
[0006] X-連接肽-X-連接肽-IgG Fc片段-Y-連接肽-Y ;其中，X為GLP-I類似物；連接 肽為（GGGGS) n ;Y為Amylin類似物。
[0007] 本發(fā)明提供的融合蛋白，由GLP-I類似物、Amylin類似物與人免疫球蛋白Fc片段 連接形成融合蛋白，其具體序列如下：
[0008] GLP-I類似物的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO :1所述；
[0009] Amylin類似物的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO :3所述；
[0010] IgGlFc的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO :5所述；
[0011] IgG2Fc的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO :7所述；
[0012] IgG3Fc的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO :9所述；
[0013] IgG4Fc的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO :11所述。
[0014] 融合蛋白GIA的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO : 13所述
[0015] 編碼所述上述融合蛋白核苷酸序列如下：
[0016] GLP-I類似物的核苷酸如序列表中的SEQ ID NO :2所述；
[0017] Amylin類似物的核苷酸如序列表中的SEQ ID NO :4所述；
[0018] IgGlFc的核苷酸如序列表中的SEQ ID NO :6所述；
[0019] IgG2Fc的核苷酸如序列表中的SEQ ID NO :8所述；
[0020] IgG3Fc的核苷酸如序列表中的SEQ ID NO : 10所述；
[0021] IgG4Fc的核苷酸如序列表中的SEQ ID NO : 12所述；
[0022] 融合蛋白GIA核苷酸如序列表中的SEQ ID NO : 14所述。
[0023] 本發(fā)明同時提供了上述核酸序列的表達載體，其能在轉化的宿主細胞中復制表 達。
[0024] 本發(fā)明還提供了一種制備融合蛋白的方法，將上述表達載體引入合適的表達系 統(tǒng)，從而進行融合蛋白的表達。
[0025] 本發(fā)明進一步提供了一種藥物組合物，其由上述融合蛋白與藥學上可接受的載體 或賦形劑組成；所述藥物組合物的制劑形式優(yōu)選為注射劑、注射用凍干粉針。
[0026] 本發(fā)明還提供了上述融合蛋白在制備預防和治療高血糖癥、2型糖尿病、1型糖尿 病、葡萄糖耐量降低、肥胖癥、高血壓、代謝綜合癥、血脂障礙、認知障礙、心肌梗賽、冠心病 和其它心血管疾病、中風、消化不良等疾病藥物中的用途。
[0027] 本發(fā)明融合蛋白的表達載體，可以是重組真核表達載體，優(yōu)選哺乳動物細胞表達 載體；也可以是重組病毒表達載體，優(yōu)選腺相關病毒或腺病毒載體。
[0028] 含有表達上述融合蛋白的宿主細胞，可以為CHO細胞及其亞系或293細胞及其亞 系。
【附圖說明】
[0029] 圖I G/A融合蛋白對胰島RIN-5F細胞cAMP生成的影響
【具體實施方式】
[0030] 提供以下實施例對本發(fā)明作進一步闡釋。應當理解，這些實施例僅用于說明本發(fā) 明而非對本發(fā)明有任何限制。本領域技術人員在本說明書的啟示下對本發(fā)明實施中所作的 任何變動都將落在權利要求書的范圍內。
[0031] 實施例1融合蛋白的制備
[0032] 1、質粒構建
[0033] I. 1基因和引物合成
[0034] 表達序列通過下述合成的基因和引物重組至表達載體?；蚝鸵镉蓪I(yè)公司北 京金唯智公司合成，合成基因序列重組至質粒載體PUC19中。
[0035] 合成融合蛋白基因片段：
【主權項】
1. 一種GLP-I類似物和amylin類似物的融合蛋白，所述融合蛋白由以下通式表示： X-連接肽-X-連接肽-IgG Fc片段-Y-連接肽-Y ;其中，X為GLP-I類似物；連接肽為 (GGGGS)η ;Y 為 Amylin 類似物。
2. 根據(jù)權利要求1所述的融合蛋白，其中蛋白X為GLP-I類似物；其氨基酸序列為SEQ ID NO :1，或由在所述氨基酸序列中的任何一個中一個或幾個氨基酸被刪除，添加和/或取 代的氨基酸序列組成。
3. 根據(jù)權利要求1所述的融合蛋白，其中蛋白Y為Amylin類似物；其氨基酸序列為SEQ ID NO :3,或由在所述氨基酸序列中的任何一個中一個或幾個氨基酸被刪除，添加和/或取 代的氨基酸序列組成。
4. 根據(jù)權利要求1所述的融合蛋白，其中連接肽含有由式（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) η(式中，η是1?4的整數(shù)），表示的氨基酸序列。
5. 根據(jù)權利要求1所述的融合蛋白，其中IgG Fc片段為IgGlFc片段、IgG2Fc片段、 IgG3Fc片段和IgG4Fc片段，；其氨基酸序列為分別SEQ ID NO :5、7、9、11。
6. 權利要求1所述的融合蛋白，其中融合蛋白由SEQ ID N0:13的氨基酸序列組成，或 由在SEQ ID NO: 13的氨基酸序列中一個或幾個氨基酸被刪除，添加和/或取代的氨基酸序 列組成。
7. -種制備融合蛋白的方法，其特征在于將權利要求1所述的融合蛋白編碼DNA插入 表達載體，并將此載體引入合適的表達系統(tǒng)，并進行融合蛋白的表達。
8. -種藥物組合物，其特征在于由權利要求1中任一項所述融合蛋白與藥學上可接受 的載體或賦形劑組成。
9. 根據(jù)權利要求8所述的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物的制劑形式為注射 齊U、注射用凍干粉針。
10. 預防和治療高血糖癥、2型糖尿病、1型糖尿病、葡萄糖耐量降低、肥胖癥、高血壓、 代謝綜合癥、血脂障礙、認知障礙、心肌梗賽、冠心病和其它心血管疾病、中風、消化不良，其 特征在于，含有權利要求1的融合蛋白作為有效成分。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種GLP-1類似物和amylin類似物的融合蛋白制備方法及其應用。本發(fā)明所述的融合蛋白其通式表示為：X-連接肽-X-連接肽-IgG？Fc片段-Y-連接肽-Y；其中，X為GLP-1類似物；連接肽為(GGGGS)n；Y為Amylin類似物。本發(fā)明所提供的融合蛋白具有兩種蛋白生理活性，同時具有比單獨使用更好的穩(wěn)定性和持續(xù)性，使其在治療糖尿病、肥胖癥、代謝綜合癥以及心血管疾病等方面具有明顯的優(yōu)勢和良好的前景。
【IPC分類】A61K38-26, A61P3-04, A61P9-10, A61P25-00, A61P1-14, C07K19-00, A61P3-06, A61K38-22, A61P3-00, A61P3-10, A61P9-00, C12N15-63, A61P9-12
【公開號】CN104558198
【申請?zhí)枴緾N201410357012
【發(fā)明人】高小平, 李生偉, 付偉
【申請人】成都貝愛特生物科技有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年7月25日