一種用于鑒定少棘巨蜈蚣的引物對(duì)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于鑒定少棘巨蜈蚣的引物對(duì)及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)《中國(guó)藥典》（2010)年版一部記載，蜈蚣來源為蜈蚣科動(dòng)物少棘巨蜈蚣 ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch的干燥體。蜈蟻是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，具有 熄風(fēng)鎮(zhèn)痙、通絡(luò)止痛、攻毒散結(jié)的功效，用于肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)、痙攣抽搐、小兒驚風(fēng)、半身不遂、破傷 風(fēng)、風(fēng)濕頑痹、偏正頭痛、瘡瘍、瘰疬、蛇蟲咬傷等，主產(chǎn)于我國(guó)湖南、湖北、廣西以及云南等 地（王克勤，方紅，葉卯祥，等.蜈蚣藥源調(diào)查及商品鑒定，中藥材，1997, 20 (9) : 450)。
[0003] 近年來，蜈蚣養(yǎng)殖在我國(guó)逐漸興起，然而由于現(xiàn)在大部分蜈蚣產(chǎn)業(yè)的從業(yè)人員 素質(zhì)參差不齊，養(yǎng)殖戶對(duì)自己所養(yǎng)蜈蚣只知其俗稱，不知其具體品種（陳金印.我國(guó)蜈 蚣產(chǎn)業(yè)發(fā)展的現(xiàn)狀與思考，江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013, 25(1) :82)。導(dǎo)致一些蜈蚣混偽 品涌入藥材市場(chǎng)，如多棘蜈蟻S.multidensNewport、哈式蜈蟻S.subspinipesdehaani Brandt、赤娛蟲公S.morsitansLinnaeus、日本娛蟲公S.subspinipesjaponicaL.Koch等， 其中多棘蜈蚣最為常見（楊成俊，周偉慶.蜈蚣及其混偽品的鑒別研宄，安徽農(nóng)業(yè)科 學(xué)，2011，39(25) : 15402)。藥典中收載的少棘巨蜈蚣與混偽品的形態(tài)學(xué)特征相似，在日常用 藥中，因其混偽品也具有一定的藥效，常與正品少棘巨蜈蚣混淆用藥，但其藥用功效與正品 有很大差別。為確保藥材市場(chǎng)中蜈蚣的質(zhì)量及其臨床療效，需建立更加快速、準(zhǔn)確的方法來 鑒定蜈蚣與其混偽品。
[0004] 隨著分子鑒定技術(shù)的發(fā)展，DNA條形碼技術(shù)被應(yīng)用于少棘巨蜈蚣與多棘蜈蚣的 PCR鑒定（張紅印，陳俊，賈靜，等.中藥材蜈蚣及其混偽品DNA條形碼鑒別研宄，中國(guó)中藥 雜志，2014, 39 (12) : 2208)，但由于DNA條形碼方法用時(shí)較長(zhǎng)，而且需要測(cè)序，無(wú)法適應(yīng)當(dāng)前 中藥分子鑒定技術(shù)現(xiàn)場(chǎng)運(yùn)用的需要。而對(duì)少棘巨蜈蚣與多棘蜈蚣之間的分子特異性鑒別還 尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定少棘巨蜈蚣的引物對(duì)。
[0006] 本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定少棘巨蜈蚣的引物對(duì)，具體為由序列表中序 列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)。
[0007] 所述引物對(duì)中，兩條單鏈DNA分子既可以分別單獨(dú)包裝，也可以按照摩爾比為1:1 的比例混合后包裝在一起。
[0008] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定少棘巨蜈蚣的試劑盒。
[0009] 本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定少棘巨蜈蚣的試劑盒，具體可含有所述引物 對(duì)、dNTP和DNA聚合酶。
[0010] 根據(jù)需要，所述試劑盒中還可含有熒光染料SYBRGreenI。
[0011] 制備所述引物對(duì)的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0012] 制備所述引物對(duì)的方法，具體可包括將組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA分子分別 單獨(dú)包裝的步驟。
[0013] 制備所述試劑盒的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014] 制備所述試劑盒的方法，具體可包括如下A)或B)的步驟：
[0015] A)將組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA分子分別單獨(dú)包裝后，與分別單獨(dú)包裝的 dNTP和DNA聚合酶包裝于同一個(gè)試劑盒內(nèi)：
[0016] B)將組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA分子分別單獨(dú)包裝后，與分別單獨(dú)包裝的 dNTP、DNA聚合酶和SYBRGreenI包裝于同一個(gè)試劑盒內(nèi)。
[0017] 所述引物對(duì)，或所述試劑盒，在鑒定或輔助鑒定少棘巨蜈蚣中的應(yīng)用也屬于本發(fā) 明的保護(hù)范圍。
[0018] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種利用所述引物對(duì)或所述試劑盒鑒定或輔助鑒定 待測(cè)樣品中是否含有少棘巨蜈蚣的方法。
[0019] 本發(fā)明所提供的利用所述引物對(duì)或所述試劑盒鑒定或輔助鑒定待測(cè)樣品中是否 含有少棘巨蜈蚣的方法，具體可包括如下步驟：
[0020] (a)從待測(cè)樣品中提取基因組DNA作為模板，采用所述引物對(duì)（序列1和序列2) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0021] (b)為如下（bl)或（b2):
[0022] (bl)根據(jù)步驟（a)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定待測(cè)樣品中是否含 有少棘巨蜈蚣：若PCR產(chǎn)物中含有大小為250-500bp(如400-500bp)的DNA片段，則所 述待測(cè)樣品中含有或候選含有少棘巨蜈蚣；若PCR產(chǎn)物中不含有大小為250-500bp(如 400-500bp)的DNA片段，則所述待測(cè)樣品中不含有或候選不含有少棘巨蜈蚣；
[0023] (b2)向步驟（a)擴(kuò)增后的反應(yīng)體系中加入熒光染料SYBRGreenI，得到含有熒光 染料的體系，按照如下方法確定待測(cè)樣品中是否含有少棘巨蜈蚣：若觀察到所述含有熒光 染料的體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測(cè)樣品中含有或候選含有少棘巨蜈蚣；若觀察不到所 述含有熒光染料的體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測(cè)樣品不含有或候選不含有少棘巨蜈蚣。
[0024] 在上述方法中，所述少棘巨蜈蚣可為整個(gè)少棘巨蜈蚣，也可為來自于少棘巨蜈蚣 的中藥材蜈蚣。相應(yīng)的，所述待測(cè)樣品可為少棘巨蜈蚣或其他品種蜈蚣，如多棘蜈蚣的中藥 材。
[0025] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種利用所述引物對(duì)或所述試劑盒鑒定或輔助鑒定 待測(cè)蜈蚣為少棘巨蜈蚣還是多棘蜈蚣的方法。
[0026] 本發(fā)明所提供的利用所述引物對(duì)或所述試劑盒鑒定或輔助鑒定待測(cè)蜈蚣為少棘 巨蜈蚣還是多棘蜈蚣的方法，具體可包括如下步驟：
[0027] (a)從待測(cè)蜈蚣中提取基因組DNA作為模板，采用所述引物對(duì)（序列1和序列2) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0028] (b)為如下（bl)或（b2):
[0029] (bl)根據(jù)步驟（a)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測(cè)蜈蚣為少 棘巨蜈蚣還是多棘蜈蚣：若PCR產(chǎn)物中含有大小為250-500bp(如400-500bp)的DNA片 段，則所述待測(cè)蜈蚣為或候選為少棘巨蜈蚣；若PCR產(chǎn)物中不含有大小為250-500bp(如 400-500bp)的DNA片段，則所述待測(cè)蜈蚣為或候選為多棘蜈蚣；
[0030] (b2)向步驟（a)擴(kuò)增后的反應(yīng)體系中加入熒光染料SYBRGreenI，得到含有熒光 染料的體系，按照如下方法確定所述待測(cè)蜈蚣為少棘巨蜈蚣還是多棘蜈蚣：若觀察到所述 含有熒光染料的體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測(cè)蜈蚣為或候選為少棘巨蜈蚣；若觀察不到 所述含有熒光染料的體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測(cè)蜈蚣為或候選為多棘蜈蚣；
[0031] 所述待測(cè)蜈蚣為少棘巨蜈蚣或多棘蜈蚣。
[0032] 在上述兩種方法的步驟（a)中，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增時(shí)采用的退火溫度均可為58°C。
[0033] 在本發(fā)明中，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增時(shí)采用的具體反應(yīng)條件如下：88°Clmin;88°Cls， 58°C5s，28 個(gè)循環(huán)。
[0034] 在上述兩種方法的步驟（a)中，在進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體