專利名稱:一種共價活化的固定化酶載體的制作方法
本發(fā)明屬于生物化學領域，是一種經(jīng)共價活化的可制備固定化酶的蛋白質載體。
已知的共價活化法制備固定化酶的載體，多用合成載體，例如多糖類衍生物，氨基酸聚合物，聚丙烯酰胺，苯乙烯樹脂，多孔玻璃芳香胺衍生物等各種聚合物。由于共價化學鍵較穩(wěn)定，因此共價法制備的固定化酶，酶和載體之間的結合極其牢固，但上述一類載體的共價活化，控制條件苛刻，反應激烈，操作復雜。對于某些不能予先活化的載體，如果載體通過雙功能用試劑與酶共價偶聯(lián)的話，常引起酶蛋白的高級結構發(fā)生變化，并導致活性中心的破壞，使酶活力下降。
蛋白質載體提供了酶的天然環(huán)境，可予先接枝共價活化，使得固定化條件較溫和，有利于酶活性的保存和穩(wěn)定性的提高。已有人使用膠原蛋白作固定化酶的載體，但膠原蛋白的制備技術較復雜，是用牛皮、牛肋等組織經(jīng)處理而得，鋪膜的厚度難以均勻，特別是其機械強度和通透性較差，難于實現(xiàn)工業(yè)規(guī)模的酶反應過程。此外，用膠原蛋白作載體，所得的固定化酶的比活性較低。
本發(fā)明的目的是要尋找一種來源豐富，價格低廉，加工方便，機械強度與通透性好，能予先共價活化，適宜于酶生存的載體，用它制得的固定化酶不僅具有高的比活性，而且便于實現(xiàn)工業(yè)規(guī)模的酶反應過程。
本發(fā)明所指的固定化酶的載體是一種經(jīng)“共價活化的蠶絲蛋白”，其制備方法有二種1.蠶絲蛋白表面羥基的活化(重疊法)先使蠶絲蛋白在堿性條件下與對β-硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)反應，使成為具有芳香族氨基的非水溶性載體(對氨基苯磺酰乙基-蠶絲蛋白)，然后用鹽酸和亞硝酸鈉處理，生成重氮鹽化合物，即得到本發(fā)明所說的經(jīng)“共價活化的固定化酶載體”(共價活化的蠶絲蛋白)，再與酶發(fā)生重氮偶合反應，制得固定化酶。
2.蠶絲蛋白表面羧基的活化(酰代疊氮法)在室溫下，將蠶絲蛋白在甲醇-鹽酸混合液中浸泡數(shù)十小時，取出，用水漂洗后，在肼溶液中浸幾小時，得到蠶絲蛋白的酰肼衍生物，再用亞硝酸鈉-鹽酸溶液處理，便成為蠶絲蛋白-酰代疊氮衍生物，即得本發(fā)明所說的經(jīng)“共價活化的固定化酶載體”(共價活化的蠶絲蛋白)，再與酶發(fā)生重氮偶合反應，制得固定化酶。
本發(fā)明的載體-共價活化的蠶絲蛋白有一個最佳活化條件即將蠶絲蛋白浸入SESA-2%Na2CO3水溶液中，先在80℃左右保溫10分鐘，加入適量無水Na2CO3，在80℃下繼續(xù)保溫45分鐘，取出，用冰水充分漂洗，然后在0℃下用Na2NO2-HCl溶液處理3分鐘，取出后，再用冰水充分洗滌，即得本發(fā)明所說的固定化酶載體-共價活化的蠶絲蛋白載體。
經(jīng)共價活化的蠶絲蛋白，較膠原蛋白有如下顯著優(yōu)點(1)蠶絲蛋白的成份一般由18～20種氨基酸構成，表面帶有比膠原蛋白更多的-OH基團和-COOH基團，因此用它制得的固定化酶的活性和穩(wěn)定性均比膠原蛋白作載體制得的固定化酶的活性和穩(wěn)定性要高。例如用2.5Cm×1.5Cm蠶絲蛋白片料，經(jīng)共價活化制得的固定化酶(如固定葡萄糖氧化酶)，在20ml 1%葡萄糖溶液(作底物)中，pH5.5，溫度30℃下反應半小時，測得其比活性為59nmoles/min·Cm2;同樣條件下，用膠原蛋白固定葡萄糖氧化酶時，測得的比活性僅為17.8nmoles/min·Cm2。
(2)蠶絲蛋白來源豐富，一般市售的絲織物均可作為原料，加工成“共價活化的蠶絲蛋白”-固定化酶的載體，制備上比膠原蛋白要方便的多。
(3)蠶絲蛋白的機械強度和通透性要膠原蛋白好得多，蠶絲蛋白可以制成絲狀，線狀，纖維織物狀等，大大提高了固定化的表面積，這些都有利于工業(yè)規(guī)模的酶反應過程的進行，而膠原蛋白通常只能鋪成膜狀，其機械強度和通透性均較差。
由上可見，作為固定化酶的載體來說，本發(fā)明所述的共價活化的蠶絲蛋白無疑是一種有著廣泛發(fā)展前景的載體。
實施例1載體原料采用2.5×1.5Cm市售的縐絲片料(一種蠶絲蛋白織物，以下簡稱片料)酶用葡萄糖氧化酶，(以下簡稱酶)〔1〕固定化酶載體的制備-共價活化的蠶絲蛋白最佳活化條件稱取0.1gSESA溶解于6ml 2%Na2CO3的水溶液中，過濾去除不溶物，將片料浸入上述SESA溶液中，80℃左右保溫10分鐘，再加入0.2g無水Na2CO3，繼續(xù)在80℃下保溫45分鐘，取出，用冰水充分漂洗，然后在0℃下用Na2NO2-HCl溶液處理3分鐘，取出后再用冰水充分洗滌即得本發(fā)明所說的固定化酶載體-共價活化的蠶絲蛋白載體。
〔2〕固定化酶的制備將上述所得的共價活化的蠶絲蛋白浸入濃度為2mg/ml，溫度為0℃的酶溶液中2小時左右，取出后用0℃冰水充分洗滌，以除去被吸附的酶，得到一種有酶活性的蠶絲蛋白-固定化酶，貯存在4℃，pH5.5的醋酸緩沖溶液中。
〔3〕固定化酶比活性的測定(1)測定方法基于葡萄糖氧化酶(GOD)能催化如下反應
采用辣根過氧化物酶(POD)使反應產物H2O2還原，同時使還原型鄰-二茴香胺成為紅色的氧化型鄰一二茴香胺，測定436nm下氧化型鄰一二茴香胺的光密度(O·D)，求得GOD的活性。
(2)測定條件和結果將上述的固定化酶放入底物-20ml 1%葡萄糖溶液中，在30℃，pH5.5下反應半小時，測得O.D＝0.250，求得比活性為59nmoles/min·Cm2。
實施例2載體原料采用干絲，其余條件均同實施例1，測得OD＝0.470，求得固定化酶的比活性為8330nmoles/min·g(干絲)。
總之，本發(fā)明所說的載體確實是酶的固定化的理想載體。它不僅可以固定葡萄糖氧化酶，而且可以固定磷酸單酯酶、糖化酶、木瓜蛋白酶等，得到各種高比活性的固定化酶，且其穩(wěn)定性好，即酶與載體的結合力強，不易從載體上脫落下來。
權利要求
1.一種用重氮法或?；B氮法活化的天然蛋白質載體，具有酶生存的良好微環(huán)境，本發(fā)明的特征在于以共價活化的蠶絲蛋白作為制備高比活性的固定化酶的載體。
2.按照權項要求1所說的載體，其特征在于共價活化的蠶絲蛋白有一最佳的活化條件(1)稱取0.1gSESA溶解于6ml2%Na2CO3水溶液中;(2)將2.5Cm×1.5Cm蠶絲蛋白織物浸入上述SESA溶液中，在80℃左右保溫10分鐘，再加入0.2g無水Na2CO3，繼續(xù)在80℃下保溫45分鐘，取出，用冰水充分漂洗，然后在0℃下用Na2NO2-HCl溶液處理3分鐘，取出后，再用冰水充分洗滌，即得本發(fā)明所說的共價活化的蠶絲蛋白載體。
3.按照權項要求1，2所說的載體，其特征在于共價活化的蠶絲蛋白載體可制成各種形狀，如絲狀，線狀，纖維織物狀等。
4.按照權項要求1，2所說的載體，其特征在于共價活化的蠶絲蛋白載體可固定葡萄糖氧化酶，磷酸單酯酶、糖化酶、木瓜蛋白酶等，得到高比活性的固定化酶。
專利摘要
本發(fā)明屬于生物化學領域，是一種經(jīng)共價活化的可制備固定化酶的蛋白質載體。本發(fā)明所說的固定化酶載體是一種經(jīng)共價活化的蠶絲蛋白，它來源豐富、加工方便、機械強度和通透性好，可制成絲狀，線狀、纖維織物狀，所得的固定化酶的比活性和穩(wěn)定性高，是實現(xiàn)工業(yè)規(guī)模的酶反應過程的理想載體。
文檔編號C12N11/00GK86100565SQ86100565
公開日1987年11月11日 申請日期1986年4月30日
發(fā)明者樓一心, 周文瑜 申請人:華東化工學院導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan