專利名稱:一種提高外源基因在蝴蝶蘭上轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌脫菌法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高外源基因在蝴蝶蘭上轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌脫菌法。
背景技術(shù)：
在轉(zhuǎn)基因中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化依賴于T-DNA的轉(zhuǎn)移及整合，這一過程的前提是農(nóng)桿菌必須依附于植物材料，并有足夠的時間從外植體的傷口浸入并感染植物。因而，外植體和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的時間對外源基因的轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。延長共培養(yǎng)時間有助于更多T-DNA發(fā)生轉(zhuǎn)移，但共培養(yǎng)時間延長，轉(zhuǎn)化率雖然增加，而農(nóng)桿菌會由于過盛生長，造成外植體嚴重污染而褐化死亡。因而，如何優(yōu)化共培養(yǎng)時間，使對轉(zhuǎn)化效率有重要影響的共培養(yǎng)時間與外植體受農(nóng)桿菌污染褐化死亡的矛盾得到一定程度的平衡和解決，成了提高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種提高外源基因在蝴蝶蘭上轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌脫菌法，它可以大幅度地提高外源基因在蝴蝶蘭上的轉(zhuǎn)化率。
本發(fā)明的采用了以下技術(shù)方案一種提高外源基因在蝴蝶蘭上轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌脫菌法，它采用如下步驟步驟一，以葉片為受體材料，建立蝴蝶蘭外源基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)；步驟二，進行抗生素敏感性試驗，獲得本底指標；步驟三，取蝴蝶蘭的脫毒無菌苗生理狀態(tài)良好的葉片，剪去葉片邊緣，再將葉片剪成四周都有創(chuàng)口，以利于攜有外源目的基因的農(nóng)桿菌侵染和附著，葉片經(jīng)處理后，植入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，葉片在近軸面朝下進行預(yù)培養(yǎng)；步驟四，制作農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，從轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌中，隨機挑選單菌落，進行農(nóng)桿菌培養(yǎng)；步驟五，將農(nóng)桿菌液置平衡，然后從培養(yǎng)瓶中取出預(yù)培養(yǎng)好的葉片，浸入菌液中浸染，取出放入培養(yǎng)皿中并吸出多余的菌液后，將浸染后的葉片，放在預(yù)培養(yǎng)基上，將細菌和外植體置于暗培養(yǎng)室中培養(yǎng)，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上添加抗生素，抑制農(nóng)桿菌的快速生長，將上述共培養(yǎng)的葉片在此誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)；步驟六，將上述共培養(yǎng)的葉片用含頭孢霉素的液體培養(yǎng)基沖洗干凈后，轉(zhuǎn)移到含抗生素的篩選培養(yǎng)基中，在暗培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)，在篩選過程中一直加入抗生素，當肉眼不可見農(nóng)桿菌出現(xiàn)時，除去頭孢霉素，當葉片邊緣肉眼可見淡黃色顆粒型胚性愈傷組織時，可將淡黃色顆粒型胚性愈傷組織小心切下，轉(zhuǎn)移到相同培養(yǎng)基上在光培養(yǎng)下進行增殖；步驟七，當顆粒型胚性愈傷組織增殖后，轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)幼芽分化，當幼芽長到一定程度時，轉(zhuǎn)入生根狀苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待根系長成后，一部分出瓶練苗，并移栽到水苔中，于溫室中培養(yǎng)，一部份直接用于分子檢測。
步驟二中的抗生素為頭孢霉素。步驟三中所述的蝴蝶蘭脫毒無菌苗生理狀態(tài)良好葉片的培養(yǎng)時間為三周。將步驟五農(nóng)桿菌液置時的溫度為20℃，平衡時間為3-5分鐘。步驟五中所述的細菌和外植體放到暗培養(yǎng)室中培養(yǎng)的溫度為25℃，時間為5天。步驟五中所述的抗生素為頭孢霉素，濃度為20mg/l。步驟五中共培養(yǎng)的葉片在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的時間為2-3周。步驟六中所述的液體培養(yǎng)基為無蔗糖液體培養(yǎng)基，其內(nèi)含頭孢霉素500mg/L。步驟六中葉片在暗培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)需要每三個星期轉(zhuǎn)移一次。
采用如上技術(shù)方案，它可以通過在適當共培養(yǎng)時間內(nèi)的將外源基因的轉(zhuǎn)化效率提高5倍左右，同時又解決了外植體受農(nóng)桿菌污染褐化死亡的問題。
具體實施方式本發(fā)明為一種提高外源基因在蝴蝶蘭上轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌脫菌法，它采用如下步驟步驟一，以葉片為受體材料，建立蝴蝶蘭外源基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)；步驟二，進行抗生素敏感性試驗，抗生素為頭孢霉素，獲得本底指標；步驟三，取蝴蝶蘭培養(yǎng)三周的脫毒無菌苗生理狀態(tài)良好的葉片，剪去葉片邊緣，再將葉片剪成四周都有創(chuàng)口，以利于攜有外源目的基因的農(nóng)桿菌侵染和附著，葉片經(jīng)處理后，植入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，葉片近軸面朝下進行預(yù)培養(yǎng)；步驟四，制作農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，從轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌中，隨機挑選單菌落，進行農(nóng)桿菌培養(yǎng)；步驟五，在超凈的工作臺上，將農(nóng)桿菌在20℃的條件下液置平衡3-5分鐘，然后從培養(yǎng)瓶中取出預(yù)培養(yǎng)好的葉片，浸入菌液中浸染，取出放入培養(yǎng)皿中并吸出多余的菌液后，將浸染后的葉片，放在預(yù)培養(yǎng)基上，然后細菌和外植體置于培養(yǎng)的溫度為25℃暗培養(yǎng)室中培養(yǎng)5天，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上添加濃度為20mg/l為頭孢霉素，抑制農(nóng)桿菌的快速生長，將上述共培養(yǎng)的葉片在此誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3周；步驟六，將上述共培養(yǎng)的葉片用含500mg/L頭孢霉素的液體培養(yǎng)基沖洗干凈后，轉(zhuǎn)移到含抗生素的篩選培養(yǎng)基中，在暗培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)需要每三個星期轉(zhuǎn)移一次，在篩選過程中一直加入抗生素，當肉眼不可見農(nóng)桿菌出現(xiàn)時，除去頭孢霉素。當葉片邊緣肉眼可見淡黃色顆粒型胚性愈傷組織時，可將淡黃色顆粒型胚性愈傷組織小心切下，轉(zhuǎn)移到相同培養(yǎng)基上在光培養(yǎng)下進行增殖；步驟七，當顆粒型胚性愈傷組織增殖后，轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)幼芽分化，當幼芽長到一定程度時，轉(zhuǎn)入生根狀苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待根系長成后，一部分出瓶練苗，并移栽到水苔中，于溫室中培養(yǎng)，一部份直接用于分子檢測。
權(quán)利要求
1.一種提高外源基因在蝴蝶蘭上轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌脫菌法，它采用如下步驟步驟一，以葉片為受體材料，建立蝴蝶蘭外源基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)；步驟二，進行抗生素敏感性試驗，獲得本底指標；步驟三，取蝴蝶蘭的脫毒無菌苗生理狀態(tài)良好的葉片，剪去葉片邊緣，再將葉片剪成四周都有創(chuàng)口，以利于攜有外源目的基因的農(nóng)桿菌侵染和附著，葉片經(jīng)處理后，植入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，葉片在近軸面朝下進行預(yù)培養(yǎng)；步驟四，制作農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，從轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌中，隨機挑選單菌落，進行農(nóng)桿菌培養(yǎng)；步驟五，將農(nóng)桿菌液置平衡，然后從培養(yǎng)瓶中取出預(yù)培養(yǎng)好的葉片，浸入菌液中浸染，取出放入培養(yǎng)皿中并吸出多余的菌液后，將浸染后的葉片，放在預(yù)培養(yǎng)基上，將細菌和外植體置于暗培養(yǎng)室中培養(yǎng)，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上添加抗生素，抑制農(nóng)桿菌的快速生長，將上述共培養(yǎng)的葉片在此誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)；步驟六，將上述共培養(yǎng)的葉片用含頭孢霉素的液體培養(yǎng)基沖洗干凈后，轉(zhuǎn)移到含抗生素的篩選培養(yǎng)基中，在暗培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)，在篩選過程中一直加入抗生素，當肉眼不可見農(nóng)桿菌出現(xiàn)時，除去頭孢霉素，當葉片邊緣肉眼可見淡黃色顆粒型胚性愈傷組織時，可將淡黃色顆粒型胚性愈傷組織小心切下，轉(zhuǎn)移到相同培養(yǎng)基上在光培養(yǎng)下進行增殖；步驟七，當顆粒型胚性愈傷組織增殖后，轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)幼芽分化，當幼芽長到一定程度時，轉(zhuǎn)入生根狀苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待根系長成后，一部分出瓶練苗，并移栽到水苔中，于溫室中培養(yǎng)，一部份直接用于分子檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種提高外源基因在蝴蝶蘭上轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌脫菌法，其特征是步驟二中的抗生素為頭孢霉素。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種提高外源基因在蝴蝶蘭上轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌脫菌法，其特征是步驟三中所述的蝴蝶蘭脫毒無菌苗生理狀態(tài)良好葉片的培養(yǎng)時間為三周。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種提高外源基因在蝴蝶蘭上轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌脫菌法，其特征是將步驟五農(nóng)桿菌液置時的溫度為20℃，平衡時間為3-5分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種提高外源基因在蝴蝶蘭上轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌脫菌法，其特征是步驟五中所述的細菌和外植體放到暗培養(yǎng)室中培養(yǎng)的溫度為25℃，時間為5天。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種提高外源基因在蝴蝶蘭上轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌脫菌法，其特征是步驟五中所述的抗生素為頭孢霉素，濃度為20mg/l。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種提高外源基因在蝴蝶蘭上轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌脫菌法，其特征是步驟五中共培養(yǎng)的葉片在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的時間為2-3周。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種提高外源基因在蝴蝶蘭上轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌脫菌法，其特征是步驟六中所述的液體培養(yǎng)基為無蔗糖液體培養(yǎng)基，其內(nèi)含頭孢霉素500mg/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種提高外源基因在蝴蝶蘭上轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌脫菌法，其特征步驟六中葉片在暗培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)需要每三個星期轉(zhuǎn)移一次。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種提高外源基因在蝴蝶蘭上轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌脫菌法，它采用如下步驟1)以葉片為受體材料，建立蝴蝶蘭外源基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)；2)進行抗生素敏感性試驗，獲得本底指標；3)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，培養(yǎng)農(nóng)桿菌菌株；4)對蝴蝶蘭受體材料進行預(yù)培養(yǎng)后，將外植體和農(nóng)桿菌在無任何抗生素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)5天；5)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上添加較低濃度的抗生素，抑制農(nóng)桿菌的快速生長，將上述共培養(yǎng)的葉片，在此誘導(dǎo)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2－3星期；6)轉(zhuǎn)化體的篩選和增殖；7)轉(zhuǎn)化株的再生和分子檢測。
文檔編號C12N15/87GK1995360SQ200610161525
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月27日
發(fā)明者李 杰 申請人:李 杰導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan