專利名稱:自目標(biāo)多核苷酸和非目標(biāo)多核苷酸的混合物富集目標(biāo)多核苷酸或非目標(biāo)多核苷酸的方法 ...的制作方法
自目標(biāo)多核苷酸和非目標(biāo)多核苷酸的混合物富集目標(biāo)多核苷酸或非目標(biāo)多核苷酸的方法和組合物
背景
病毒、細(xì)菌、酵母菌和真核多細(xì)胞生物在自然界可以以復(fù)合群叢共存。該類型群叢的實例是微生物，其寄居于哺乳動物宿主中。快速DNA測序技術(shù)已被用于考察微生物。關(guān)于樣本中哺乳動物基因組DNA的存在和含量——其影響信噪比一的不確定性不利地影響物種識別的準(zhǔn)確性。這在目標(biāo)DNA以極少量存在于高本底宿主基因組物質(zhì)中的情況下特別有問題。
Zhigang心，等(Lab Chip,9 :1193-1199(2009))開發(fā)了微流體裝置以將細(xì)菌細(xì)胞與人血液細(xì)胞物理分離，其基于柔和慣性力引起的遷移，利用微流體裝置中流動限定的、曲線的和聚集的樣本流動，導(dǎo)致細(xì)菌300倍富集。此細(xì)胞分離類型僅可減少兩種細(xì)胞類型之 間的DNA本底污染-如細(xì)胞可存活。
用于分離血液中膿毒癥致病細(xì)菌DNA的另一方法取決于用離液劑選擇性裂解人有核細(xì)胞(Mo；LYsis, Molzym GmbH, Bremen, Germany)。該方法還取決于活細(xì)胞。利用抗鹽DNA酶降解裂解的細(xì)胞中的人DNA，而DNA酶不影響完整的細(xì)菌細(xì)胞。然后將DNA酶滅活，提取和提純細(xì)菌DNA用于分析。該技術(shù)使樣本中的人DNA總濃度降低99. 5%。但是，細(xì)菌DNA的總回收率很低，僅為預(yù)期總量的30% (Horz，等，Anaerobe 16 :47-53 (2010))。
在目標(biāo)DNA的損失最小化和不要求活細(xì)胞是DNA來源的條件下，目前沒有從包含DNA混合物的環(huán)境樣本富集目標(biāo)DNA的令人滿意的方法。
概沭
在本發(fā)明的實施方式中，提供了這樣的組合物其包含大小各自在IO-IOOkb范圍內(nèi)的非目標(biāo)多核苷酸和目標(biāo)多核苷酸的混合物。該組合物還包含基質(zhì)，該基質(zhì)涂布有蛋白質(zhì)或多肽結(jié)構(gòu)域以形成親和基質(zhì)。該親和基質(zhì)的實例包括選自UHRFl (SRA)、CXXl、DNMTl、MBD或其甲基結(jié)合變體的甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域(MBD)。這些甲基結(jié)合蛋白質(zhì)可借助融合于MBD——其結(jié)合涂布于基質(zhì)上的蛋白質(zhì)A——的Fe部分連接于基質(zhì)。該基質(zhì)的實例包括磁珠。
親和基質(zhì)選擇性地結(jié)合包含修飾堿基——例如堿基是甲基化的胞嘧啶——的目標(biāo)多核苷酸。修飾堿基可以200個堿基中至少I個修飾堿基的頻率存在。組合物進(jìn)一步包含緩沖液，該緩沖液包含有效量如10mM-800mM的鹽和非離子型洗滌劑。
在本發(fā)明的實施方式中，提供了從混合物富集核苷酸的方法，包括(a)得到上述組合物；(b)使目標(biāo)多核苷酸結(jié)合親和基質(zhì)；和(c)在上清液部分得到非目標(biāo)多核苷酸的富集制備物。
在上述方法的進(jìn)一步實施方式中，上清液中的非目標(biāo)多核苷酸由富集前混合物中至少90%的非目標(biāo)多核苷酸組成，和/或上清液中的目標(biāo)多核苷酸由富集前混合物中不高于10%的目標(biāo)多核苷酸組成。
在上述方法的進(jìn)一步實施方式中，富集前多核苷酸混合物得自生物樣本，包含原核生物和哺乳動物基因組DNA，其中混合物包含至少50%哺乳動物基因組DNA。[0012]在上述方法的進(jìn)一步實施方式中，通過測序、克隆或擴(kuò)增分析上清液中的非目標(biāo)多核苷酸以確定非目標(biāo)多核苷酸的基因組同一丨I"生。
在本發(fā)明的進(jìn)一步實施方式中，提供了增強(qiáng)包含與鳥嘌呤相鄰的甲基化的胞嘧啶(CpG)的多核苷酸與未甲基化的多核苷酸分離的方法，包括提供上述組合物，其中修飾堿基是甲基化的CpG ;使CpG-甲基化的多核苷酸結(jié)合親和基質(zhì)，以形成固定化在基質(zhì)上的產(chǎn)物；和對結(jié)合多核苷酸或未結(jié)合多核苷酸中的至少一種進(jìn)行擴(kuò)增和/或測序。
此外，甲基化和未甲基化的多核苷酸的混合物可包含一種或多種細(xì)菌基因組和一種或多種哺乳動物基因組的片段。
在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供了組合物，其包含含甲基化CpG的目標(biāo)DNA，目標(biāo)DNA能結(jié)合MBD珠；非目標(biāo)DNA，不能容易地結(jié)合緩沖液中的MBD珠，該緩沖液包含100mM-800mM NaCl ;和非離子型洗滌劑。目標(biāo)DNA和非目標(biāo)DNA優(yōu)選大小在IO-IOOkb的范 圍內(nèi)。

附圖簡沭
圖I顯示了富集目標(biāo)DNA⑴和包含5-甲基CpG(3)的非目標(biāo)DNA⑵的混合物中的目標(biāo)DNA的示意性工作流程。將(I)和⑵與磁珠⑷混合，磁珠⑷已涂布有蛋白質(zhì)A(7)，該蛋白質(zhì)A(7)上的甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域(MBD2A)在非離子型洗滌劑(5)存在的情況下融合Fe (6)以形成MBD2A-FC珠。真核生物基因組DNA (3)結(jié)合MBD珠(4)。磁體⑶吸引結(jié)合MBD珠的非目標(biāo)DNA，將目標(biāo)DNA (I)留在上清液中。
圖2顯示NaCl對于MBD珠降低甲基化DNA的影響。凝膠上的帶相應(yīng)于Hela細(xì)胞或大腸桿菌(E. coli)細(xì)胞的DNA混合MBD珠后上清液中的DNA。顯示由50mM至450mM以50mM增量遞增的不同鹽濃度的結(jié)果。上清液中可見一些HelaDNA高達(dá)200mMNaCl。
圖3顯示MBD珠降低甲基化DNA的I %瓊脂糖凝膠上得到的結(jié)果。將500ng提純的哺乳動物基因組DNA和50ng大小為10_20kb的氚化大腸桿菌DNA組合不同量的MBD珠，并回收和用SYBR (Life Technologies, Carlsbad, CA)染色在I %瓊脂糖凝膠上分析DNA。利用密度測定法測定用不同濃度的珠處理后保留在上清液中的哺乳動物DNA量。通過閃爍計數(shù)法測定與珠混合前和后的大腸桿菌DNA量。
利用無珠(C)或20 ii I或40 ill (200 U g/ml)MBD珠測試各個樣本。上圖從左至右開始的基因組 DNA 提純自 Jurkat 2，HCT 1161, HCT 1162, IMR 90，3T3 鼠，Hela 和 JurkatI細(xì)胞系。MR 90細(xì)胞用20 u I MBD珠以及其他細(xì)胞類型用40 u I MBD珠實現(xiàn)這些DNA的
有效去除。
與起始量相比時，單個樣本高于92%的哺乳動物基因組DNA(所有測試樣本平均97% )被MBD珠去除，而至少80%大腸桿菌DNA——平均90%——保留在上清液中。
圖4顯示利用不同體積的MBD珠(200 U g/ml)對恒定量的人(MR 90)和細(xì)菌(大腸桿菌)DNA(10 I)的富集效果，其中DNA片段的大小為至少20kb。在Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) System (Life Technologies, Carlsbad, CA)中分析上清液。如比對的序列讀取確定，MBD珠結(jié)合的DNA為99. 5%人DNA，而上清液中DNA的比對序列讀取為96%大腸桿菌。在MBD珠不存在的情況下，人DNA與大腸桿菌DNA的比對序列讀取比為約80%比約20%。
圖5顯示自人唾液樣本提純的DNA的SOLiD 4測序結(jié)果(Life Technologies,Carlsbad, CA)。在MBD珠不存在的情況下，輸入DNA樣本顯示96%的DNA的讀取與人類比對，而僅4%的DNA測序讀取與口腔微生物數(shù)據(jù)庫(人口腔微生物數(shù)據(jù)庫(HOMD) (www.HOMD. org))比對(Chen 等，Database(Oxford). doi 10.1093/database/baq013(2010))。用20 ill MBD珠富集后，上清液包含10%與人比對的DNA讀取和90%與HOMD比對的序列讀取。用40 ill MBD珠處理后，上清液包含6. 5%與人DNA比對的讀取和93. 4%與HOMD的比對讀取。
圖6A和6B顯示相比MBD珠富集不存在時得到的結(jié)果，通過去除宿主DNA利用MBD珠提供細(xì)菌DNA富集而分析人唾液樣本中微生物的有效性的提高。
圖6A顯示對富集前和后150種已知口腔微生物(X軸上編號1_150)繪制的測序讀取。利用 Bowtie 0. 12 比對軟件(Langmead 等.Genome Biology 10 R25 (2009). doi 10. 1186/gb-2009-10-3-r25)，將讀數(shù)與HOMD中特定的150種不同的細(xì)菌物種進(jìn)行比對?？傮w上，富集樣本的比對讀取數(shù)增加10倍，并且無物種多樣性損失。
圖6B提供了相應(yīng)于圖6A的圖中X軸編號的細(xì)菌物種。
實施方式詳沭
“目標(biāo)”多核苷酸可指具有特定所需特征的多核苷酸，其中該特征可以是多核苷酸中的核苷修飾?！胺悄繕?biāo)”多核苷酸沒有該特征。該特征可使多核苷酸能夠特異性結(jié)合固定在固體支持物或基質(zhì)上的親和結(jié)構(gòu)域。
目標(biāo)多核苷酸的實例包括以高于1/200堿基的密度天然包含修飾堿基一例如甲基化胞嘧啶——的哺乳動物基因組DNA。非目標(biāo)多核苷酸的實例包括不含有修飾堿基或以低于1/200堿基的密度含有修飾堿基的原核生物基因組DNA。在某些情況下，可能希望有效地得到具有修飾堿基的DNA，其中修飾堿基以能使該DNA從包含修飾或未修飾DNA的DNA混合物富集的密度存在，而在其他情況下，修飾或未修飾DNA是特別感興趣的，可優(yōu)先被回收以用于進(jìn)一步分析。
“修飾”多核苷酸是由于添加側(cè)基如甲基、羥甲基、5-甲?；谆螋然谆辽僖环N不同于A、G、T或C的特定堿基的多核苷酸。修飾堿基的實例包括5-甲基胞嘧P定、N-6甲基腺嘌呤和N-4甲基胞嘧啶。修飾堿基可進(jìn)一步衍生為包含標(biāo)記劑，然后其可被親和劑捕獲。例如，5-hmC可用修飾的葡萄糖糖基化，該修飾的葡萄糖包含生物素。
本發(fā)明的實施方式提供了從非目標(biāo)多核苷酸分離目標(biāo)多核苷酸的方法。這些方法利用目標(biāo)DNA與非目標(biāo)DNA中修飾核苷酸的密度的天然存在差異實現(xiàn)了目標(biāo)多核苷酸的富集。例如,為測序微生物DNA(目標(biāo)DNA)，需要從得自生物樣本(如人源性唾液、粘膜、血液或組織活組織檢查)的DNA混合物去除污染性哺乳動物基因組DNA(非目標(biāo)DNA)。微生物DNA與哺乳動物基因組DNA中修飾堿基的密度差異導(dǎo)致哺乳動物基因組DNA選擇性結(jié)合親和基質(zhì)，而微生物DNA留在上清液中。
該方法提供了可在15分鐘內(nèi)完成的目標(biāo)DNA快速一步富集。該方法具有這樣的優(yōu)勢快速且避免進(jìn)一步提純步驟以從親和基質(zhì)去除非特異性結(jié)合的目標(biāo)DNA。然后可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測序富集的DNA，和快速測定微生物含量(參見圖6A)。
發(fā)現(xiàn)在目標(biāo)和非目標(biāo)多核苷酸的快速、選擇性和特異性富集中發(fā)揮作用的參數(shù)包括下列中的一個或多個
(a)用于結(jié)合修飾多核苷酸的蛋白質(zhì)涂布的親和結(jié)合基質(zhì)[0035]本文所用的“親和基質(zhì)”與親和蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域連接以結(jié)合含修飾堿基的多核苷酸的基質(zhì)。在本發(fā)明的實施方式中，珠，更具體地磁珠，被用作親和基質(zhì)，其中磁珠類型是，例如，羧基化聚苯乙烯珠(例如Seradyn,來自Thermo Scientific,Waltham,MA的珠)或羧基化聚氯乙烯珠(例如，來自Chemagen,PerkinElmer,Waltham,MA),更具體地聚苯乙烯珠。各實例示例了親和蛋白質(zhì)涂布的聚苯乙烯磁珠的應(yīng)用，其中聚苯乙烯磁珠可獲自EnglandBiolabs,Inc. (NEB), Ipswich, MA0
親和蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域包括，例如，抗體如蛋白質(zhì)A、限制性內(nèi)切核酸酶如PvuRtslI或其修飾形式、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和/或修飾核苷結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其變體如甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域。對DNA或RNA中的CpG-甲基化胞嘧啶具有結(jié)合特異性的親和蛋白質(zhì)實例包括MeCP2、MBD1、MBD2、MBD3或MBD4(美國7，670，773)。這些實例共享70個殘基的MBD (美國專利申請公開號2008/0260743)。這些蛋白質(zhì)或其變體中任一個均可用于涂布上述珠，在此被稱為MBD0其他能結(jié)合DNA中的甲基化胞嘧啶的分子包括核酶或其他多核苷酸、蛋白質(zhì)如抗體、UHRFl (SRA結(jié)構(gòu)域、如來自人UHRFl的結(jié)構(gòu)域)或鼠NP95、CXXC1、DNMT1蛋白及其修飾形式或不再具有切割活性但保持其DNA結(jié)合特異性的限制性內(nèi)切核酸酶變體(參見例如，Qian，J. Biol. Chem. 283 :34490-34494(2008) ;Voo，等，Mol Cell Biol. 20(6) :2108-2121(2000)； Pradhan,等，J. Biol. Chem.，274 :33002-33010 (1999))。
上述蛋白質(zhì)可連接至間隔區(qū)以設(shè)計結(jié)合蛋白質(zhì)以期望的距離間隔珠表面，該由樣本緩沖液中所用非離子型洗滌劑的聚合物長度確定。
各實例描述了 “MBD珠”的應(yīng)用。這些為涂布蛋白質(zhì)A的磁珠，該蛋白質(zhì)A結(jié)合MBD2a-Fc，其比例為2分子MBD2a_Fc比I分子蛋白質(zhì)A。
MBD2a_Fc具有如下氨基酸序列
人MBD2[AA 144-230]
ESGKRMDCPALPPGWKKEEVIRKSGLSAGKSDVYYFSPSGKKFRSKPQLARYLGNTVDLSSFDFRTGKMMPSKLQKNKQRLRNDPL(SEQ ID No. I)。
撓性連接體
AAADPIEGRGGGGG(SEQ ID No. 2)。
人IgGl [AA 99-330] Fe 區(qū)域
DPKSSDKPHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID No. 3)。
本方法的實施方式利用MBD珠以有效且快速地分離相對于包含約4%與鳥嘌呤相鄰的甲基化胞嘧啶(mCpG)的哺乳動物DNA少含或不含甲基化CpGs的原核生物DNA。
(b)緩沖液中的鹽
包含多核苷酸和親和結(jié)合基質(zhì)的混合物的緩沖液中的鹽含量被發(fā)現(xiàn)用于測定能結(jié)合上述親和基質(zhì)的多核苷酸中甲基化堿基的密度。適用于富集的鹽包括在10mM-800mM范圍內(nèi)的NaCl、KCl或其他鹽。實例是150-450mM的NaCl。
鹽濃度可如圖2所示改變以確定包含對于多核苷酸結(jié)合親和基質(zhì)的修飾堿基閾含量的多核苷酸的結(jié)合。在此，由NaCl示例的鹽的存在增強(qiáng)修飾DNA與親和基質(zhì)(MBD珠)的結(jié)合,這導(dǎo)致宿主基因組DNA的去除，如上清液中Hela DNA減少所示。例如，在300mM鹽存在時，僅比未修飾DNA多至少3倍至6倍甲基化CpG的多核苷酸片段結(jié)合親和基質(zhì)。對于約4%甲基化的人基因組多核苷酸片段，預(yù)期20kb片段包含800個甲基化堿基，使得這些多核苷酸在300mM鹽中容易地結(jié)合親和基質(zhì)。相反，可具有少于3個甲基化CpG的多核苷酸在該鹽濃度下不結(jié)合親和基質(zhì)。
(c)非離子型洗滌劑
雖然不希望被理論約束，但在此提出非離子型洗滌劑增強(qiáng)親和基質(zhì)的疏水性，以減少基本未甲基化的多核苷酸的非特異性結(jié)合。一種或多種特征在于不帶電的親水首基的非離子型聚合洗滌劑可以以低于I %的濃度，更特別是低于0. 5%的濃度應(yīng)用，如Triton X(Union Carbide Corp. , Midland, MI)、Brij (Uniquema Americas LLC, Wilmington, DE) >Nonidet P-40 (Shell Brands International, Zug, Switzerland),或優(yōu)選地聚山梨醇酉旨 (聚氧乙烯失水山梨醇單油酸酯)(Tween , Uniqema Americas LLC, Wilmington, DE)如Tween 20、Tween 80、Tween 100。
上述非離子型洗滌劑和鹽的應(yīng)用導(dǎo)致未甲基化CpG多核苷酸至MBD珠的非特異性吸附明顯減少。
(d)珠的體積
以適當(dāng)?shù)姆治鰷y試提供預(yù)期富集效果的珠的體積，如實施例3所述。在所述條件下，該實施例中顯示，20iil-40iil珠(4-8 u g MBD2a-Fc負(fù)載于200ii g-400ii g蛋白質(zhì)A涂布的磁珠上)對于結(jié)合250ng DNA是最佳的。
(e)多核苷酸的大小
目標(biāo)或非目標(biāo)多核苷酸的富集優(yōu)選以大小在約IO-IOOkb范圍內(nèi)的大分子量多核苷酸分子實現(xiàn)，例如，大小在約10kb-20kb范圍內(nèi)的多核苷酸。富集前從細(xì)胞提純DNA的方法在本領(lǐng)域已知。優(yōu)選利用不造成剪切的方法，因此應(yīng)避免超聲波法或噴霧法。取而代之，優(yōu)選裂解細(xì)胞和利用蛋白酶K，然后進(jìn)行溫和的有機(jī)提取程序(利用氯仿和苯酚(或乙醇)進(jìn)行相分離和用乙醇進(jìn)行沉淀)和/或分級柱提純和/或瓊脂糖制備型凝膠電泳(Sambrook,等，Molecular Cloning A Laboratory Manual,3rd ed. pp. 6. 4-6. 12, ColdSpring Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor, NY, (2001))。
在此將本文應(yīng)用的全部參考文獻(xiàn)以及2011年4月2日提交的美國臨時申請?zhí)?1/471，134、2011年9月22日提交的美國臨時申請?zhí)?1/537，761、2012年2月14日提交的美國臨時申請?zhí)?1/598，715和2012年2月15日提交的美國臨時申請?zhí)?1/599，253并入作為參考。
實施例
實施例I MBD珠用于未修飾DNA富集的適用件
MBD 珠得自 NEB，Ipswich, MA (目錄 #E2600)。
DNA通過裂解細(xì)胞和氯仿-苯酚提取而制備一其導(dǎo)致相比于超聲波法(超聲處理)DNA剪切減少，并且提供長度至少10-20kb，優(yōu)選地至少20kb的片段。
鹽濃度的滴定將250ng輸入性提純的DNA(來自HeLa或大腸桿菌)與40 MBD珠在緩沖液中溫育，該緩沖液包含IOmM Tris, pH 7. 5、lmM EDTAU % TritonX 100,0. 1%Tween 80(聚山梨醇酯 80, J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)和增加濃度的 NaCl (50mM 至450mM)。在室溫下溫育樣本10分鐘，然后在反應(yīng)容器外部存在磁體的情況下從其余樣本分離MBD珠。將各個樣本的上清液加載于I %瓊脂糖凝膠上，并通過溴化乙錠染色進(jìn)行分析。圖2顯示，在所有NaCl濃度下Hela DNA通過MBD珠從上清液有效去除，而大腸桿菌DNA留在上清液中。
珠的體積將250ng來自哺乳動物細(xì)胞系(Hela、Jurkat、HCT 116、3T3)和正常非癌癥胎兒肺成纖維細(xì)胞細(xì)胞系(MR 90)的各種提純基因組DNA與20iU或40iU MBD珠或僅涂布蛋白質(zhì)A的珠一起溫育。(20 ill MBD珠=4iig MBD2a-Fc加載于200 ii g蛋白質(zhì)A涂布的磁珠上，40 ill MBD珠=8iig MBD2a-Fc加載于400iig蛋白質(zhì)A涂布的磁珠上。(貯存蛋白質(zhì)A磁珠(NEB)具有10mg/ml的濃度。貯存MDB2a_Fc具有2mg/ml的濃度(NEB))。
溫育樣本15分鐘，將上清液去除、加載于I %瓊脂糖凝膠上，并通過SYBR綠色DNA染色分析。當(dāng)40 ill MBD珠用于反應(yīng)時，實現(xiàn)DNA從上清液有效去除。在20 珠時觀察到MR 90DNA的有效去除。
實施例2 :從原核牛物DNA分離哺乳動物DNA的效力
向如上述制備的40 ill MBD珠(200 u g/ml)添加DNA混合物(約250ng總DNA)——該DNA混合物由長度至少20kb的哺乳動物DNA (人Jurkat)和細(xì)菌DNA (大腸桿菌菌株ER 1506)的50 50混合物組成，并溫育約10分鐘。然后將樣本管置于磁機(jī)架上5分鐘以濃縮結(jié)合雙鏈CpG甲基化的DNA的MBD珠。
小心地去除含有原核生物、病毒或宏基因組(metagenomic)DNA的上清液，留下粘附于MBD珠的真核生物或人DNA。利用熱和含有蛋白酶K的Tris緩沖液從MBD珠提取該DNA。在I %瓊脂糖凝膠上分析上清液DNA。
利用Ion Torrent PGM測序儀進(jìn)一步分析瓊脂糖凝膠上相應(yīng)于上清液中20kb未結(jié)合的大腸桿菌DNA的帶，從而分析存在的DNA (參見圖5)。
發(fā)現(xiàn)至少95%的人DNA (CpG-甲基化)保持結(jié)合于磁珠基質(zhì)，而未CpG-甲基化的細(xì)菌DNA留在上清液中，其回收率高于95%。
實施例3 分析人唾液的微牛物基因組
任何提純無RNA和無蛋白質(zhì)基因組DNA的方法均可被應(yīng)用，如，例如，蛋白酶K處理，然后進(jìn)行苯酹/氯仿提取和乙醇沉淀、溶菌酶消化、Qiagen(Valencia, CA)柱制備(對于基因組DNA)或其他方法。避免超聲波法(超聲處理)、噴霧法、離液鹽、酶處理、粗處理或任何其他會引起DNA剪切的程序，因為從哺乳動物DNA分離微生物DNA在DNA片段大小大于10-20KB且不包含小分子量片段時是最佳的(Sambrook,等，Molecular Cloning A Laboratory Manual,第三版 第 6. 4-6. 12 頁，Cold Spring Harbor Lab Press, ColdSpring Harbor,NY, (2001))。從唾液提取的DNA質(zhì)量和數(shù)量可通過附有DNA標(biāo)記的樣本的瓊脂糖凝膠電泳確定(2-log DNA梯帶，NEB#N3200S, Ipswich, MA)。
在本實施例中，正常人唾液獲自創(chuàng)新研究(Innovative Research) (Novi,Ml)。將250ml 唾液加至 10 ii I IM Tris-HCL pH. 7. 5、5 y I 500mM EDTA、5 y I 20% SDS、3 y I 20mg/ml蛋白酶K(NEB#P8102S，Ipswich，MA)，在50°C下溫育2小時，并進(jìn)行乙醇提取。將小球風(fēng)干，懸浮于 25ml 緩沖液(IOmM TrisUmM EDTA U 00 u I RNA 酶 A(IOmg))中，并在 37°C 下溫育I小時。用Tris-EDTA平衡的苯酚提取分離的產(chǎn)物，用二氯甲烷提取一次釋放的產(chǎn)物，并、加入2體積乙醇(ETOH)。然后將產(chǎn)物旋轉(zhuǎn)，并將小球如上風(fēng)干和重新懸浮于250 ill TE中，給出最終濃度150 u g/ml,總計37. 5 u go
瓊脂糖凝膠分析顯示， 50% DNA降解至IOkb以下。為進(jìn)一步純化DNA和富集高分子量片段，將樣本加載于I %低熔融瓊脂糖凝膠，加上I X SYBR安全DNA凝膠染色(I X SYBR Safe DNA Gel Stain) (Life Technologies, Carlsbad, CA)。將 10_15kb 的大帶切離凝膠，加熱至50°C，并且將10單位P瓊脂水解酶I (Beta Agarase I) (NEB #M0392S,Ipswich,MA)加100 ill IOX反應(yīng)緩沖液，總體積為1ml，加至樣本，并在42°C下溫育30分鐘。將2體積ETOH加至樣本，旋轉(zhuǎn)，干燥，和懸浮于上述TE。
對第二個250ml集中的等份額量唾液樣本重復(fù)上述程序，并將兩個純化DNA樣本組合，將DNA濃度調(diào)節(jié)至70 u g/ml ;總產(chǎn)量為40 u g。將上述提純的人唾液DNA以如下比例與MBD珠混合250ng DNA比20 u IMBD珠或40 u I MBD珠。在不利用MBD珠富集原核生物DNA時，DNA樣本顯示96 %的DNA讀取與人類比對，而僅4%的DNA測序讀取與HOMD比對。
在用20iil MBD珠富集后，10% DNA讀取與人類比對，90%讀取與HOMD比對。在用40iil MBD珠處理后，6. 5%讀取與人類比對，93. 4%與HOMD比對(圖6A)。
實施例4 :富集人線粒體DNA
人線粒體DNA是約16. 5kb的環(huán)狀DNA分子。其編碼37個基因13個是呼吸復(fù)合物I、III、IV和V亞基的基因，22個是線粒體tRNA的基因(20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，和另外的亮氨酸和絲氨酸基因)，2個是rRNA的基因。一個線粒體可包含2至10個其DNA拷貝(Chan，Cell，125(7) :1241-1252(2006). doi :10. 1016/j. cell. 2006. 06. 010.))。許多疾病與線粒體DNA缺陷有關(guān)，因此需要富集線粒體DNA。利用本文所述的方法，將兩個輸入樣本(4. 75 X IO5堿基)與四個富集的上清液樣本(I. 6X105堿基)和兩個小球樣本(I. 5X IO6堿基)進(jìn)行比較，其利用在Ion Torrent PGM System中分析MR 90DNA。利用Bowtie 0. 12比對軟件將所有堿基讀取均與人基因組(hgl9)比對，并進(jìn)行染色體分布。發(fā)現(xiàn)MBD上清液樣本與輸入樣本相比具有160倍的線粒體DNA富集。相反，小球不包含可檢測到的線粒體DNA。
權(quán)利要求
1.組合物，包含 (a)非目標(biāo)和目標(biāo)多核苷酸混合物，所述混合物中的多核苷酸的大小在IO-IOOKb的范圍內(nèi)； (b)基質(zhì)，其涂布有蛋白質(zhì)或多肽結(jié)構(gòu)域以形成親和基質(zhì)，所述親和基質(zhì)能選擇性地結(jié)合包含修飾堿基的所述目標(biāo)多核苷酸，但不結(jié)合所述非目標(biāo)多核苷酸；和 (C)緩沖液，其包含有效量的鹽和非離子型洗滌劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的組合物，其中所述鹽的有效量是10mM-800mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求
I或權(quán)利要求
2所述的組合物，其中所述目標(biāo)多核苷酸中的所述修飾堿基以200個堿基中至少I個修飾堿基的頻率存在。
4.從混合物富集多核苷酸的方法，包括 (a)得到根據(jù)權(quán)利要求
I或權(quán)利要求
2所述的組合物； (b)使所述目標(biāo)多核苷酸結(jié)合所述親和基質(zhì)；和 (c)在上清液部分中得到所述非目標(biāo)多核苷酸的富集制備物。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的方法，其中所述上清液中的所述非目標(biāo)多核苷酸包含富集前所述混合物中至少90%的所述非目標(biāo)多核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求
4或權(quán)利要求
5所述的方法，其中所述上清液中的所述目標(biāo)多核苷酸包含富集前所述混合物中不高于10%的所述目標(biāo)多核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求
4至6中任一項所述的方法，其中所述修飾堿基是甲基化的胞嘧啶。
8.根據(jù)權(quán)利要求
4至7中任一項所述的方法，其中富集前的所述多核苷酸混合物得自生物樣本，并包含原核生物和哺乳動物基因組DNA，其中所述混合物包含至少50%的哺乳動物基因組DNA。
9.根據(jù)權(quán)利要求
4至8中任一項所述的方法，進(jìn)一步包括通過測序、克隆或擴(kuò)增來分析所述上清液中的所述非目標(biāo)多核苷酸，以確定所述非目標(biāo)多核苷酸的基因組同一性。
10.根據(jù)權(quán)利要求
4至9中任一項所述的方法，其中所述親和基質(zhì)包含選自UHRFl (SRA)、CXXI、DNMTI、MBD或其甲基結(jié)合變體的甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域(MBD)。
11.根據(jù)權(quán)利要求
4至10中任一項所述的方法，其中所述親和基質(zhì)包括磁珠。
12.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的方法，其中所述磁珠涂布有結(jié)合MBD2a-Fc的蛋白質(zhì)A。
13.根據(jù)權(quán)利要求
4至12中任一項所述的方法，其中所述鹽是在10mM-800mM濃度范圍內(nèi)的NaCl。
14.增強(qiáng)包含與鳥嘌呤相鄰的甲基化的胞嘧啶(CpG)的多核苷酸與未甲基化的多核苷酸分離的方法；包括 (a提供根據(jù)權(quán)利要求
I所述的組合物，其中所述修飾堿基是甲基化的CpG ； (b)使所述CpG甲基化的多核苷酸結(jié)合所述親和基質(zhì)，形成固定化在所述基質(zhì)上的產(chǎn)物；和 (c對所述結(jié)合的多核苷酸或所述未結(jié)合的多核苷酸中的至少一種進(jìn)行擴(kuò)增和/或測序。
15.根據(jù)權(quán)利要求
14所述的方法，其中所述甲基化和未甲基化的多核苷酸的混合物包含一種或多種細(xì)菌基因組和一種或多種哺乳動物基因組的片段。
16.根據(jù)權(quán)利要求
14或15所述的方法，其中所述基質(zhì)是磁珠。
17.根據(jù)權(quán)利要求
14至16中任一項所述的方法，其中所述甲基化核苷結(jié)合蛋白質(zhì)選自UHRFl (SRA)、CXXI、DNMTI、MBD 或其甲基結(jié)合變體。
18.根據(jù)權(quán)利要求
14至17中任一項所述的方法，其中有效量的鹽是在100mM-800mM范圍內(nèi)的NaCl。
19.組合物，包含含有甲基化CpG的目標(biāo)DNA，所述目標(biāo)DNA能結(jié)合緩沖液中的MBD珠；非目標(biāo)DNA，其不能容易地結(jié)合所述緩沖液中的所述MBD珠，所述緩沖液含有100mM-800mMNaCl ;和非離子型洗滌劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求
19所述的組合物，其中所述目標(biāo)DNA和所述非目標(biāo)DNA的大小在IO-IOOkb的范圍內(nèi)。
專利摘要
提供了從非目標(biāo)和目標(biāo)多核苷酸的混合物富集非目標(biāo)多核苷酸的組合物和方法，其中目標(biāo)多核苷酸與非目標(biāo)多核苷酸之間的差異包括修飾堿基的程度，其以比在非目標(biāo)多核苷酸中更大的密度存在于目標(biāo)多核苷酸中。這使目標(biāo)多核苷酸選擇性地和快速地結(jié)合至親和基質(zhì)如親和蛋白質(zhì)涂布的磁珠，在上清液中提供非目標(biāo)多核苷酸的富集。該富集的一種應(yīng)用是從得自人組織樣本的DNA混合物去除人基因組DNA以富集微生物多核苷酸，從而通過DNA測序表征微生物。
文檔編號C12N15/10GKCN102732506SQ201210097967
公開日2012年10月17日 申請日期2012年4月5日
發(fā)明者F·斯圖爾特, G·R·費哈瑞, J·麥克法蘭, S·普拉丹 申請人:新英格蘭生物實驗室公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan