專利名稱:一種裂殖壺菌誘變方法及其產(chǎn)生的變異株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物遺傳育種技術(shù)和發(fā)酵生物技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及用于生產(chǎn)DHA (二十二碳六烯酸，22:6，n-3)的誘變菌株。
背景技術(shù)：
DHA (Docosahexaenoic acid, 二十二碳六烯酸，22:6, n_3)是一種必需脂肪酸，即人體不能自生合成，又具有重要生理功能的長鏈脂肪酸。DHA是人的大腦和視網(wǎng)膜的主要組成成分，在大腦皮層中含量達(dá)20%，在視網(wǎng)膜中含量高達(dá)50%，因此，對(duì)胎嬰兒的神經(jīng)系統(tǒng)和視覺系統(tǒng)的發(fā)育起重要作用，是維持正常智力和視力的重要的保障，還具有防治心血管疾病、抗癌、抗炎等重要的生理功能。另外，DHA還是多種海水魚類生長發(fā)育所需的必需脂肪酸，可以提高魚苗的成活率和降低白化病發(fā)病率。傳統(tǒng)上DHA從深海魚油中獲得，但從魚油中提取的多不包含脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)存在著產(chǎn)量不穩(wěn)、得率低、成本高及含有其它的ω-ePUFAs等問題，且隨著漁業(yè)資源的日益緊張，傳統(tǒng)的DHA資 源已無法滿足日益增長的市場(chǎng)需求。因此，開發(fā)DHA的新生資源已成為新的研究熱點(diǎn)。
裂殖壺菌(Schizochytrium sp)是一種已經(jīng)開發(fā)為生產(chǎn)DHA和其他多飽和脂肪酸的商業(yè)資源海洋微藻或真菌樣微生物，目前已被用來生產(chǎn)DHA。該菌使用安全，Hammond等人用其對(duì)白鼠、兔子進(jìn)行了一系列的安全性檢測(cè)，沒有發(fā)現(xiàn)任何毒副作用。
但是，在發(fā)酵生產(chǎn)的過程中，裂殖壺菌難免發(fā)生種質(zhì)退化，從而導(dǎo)致DHA產(chǎn)率下降。因此，亟需改良該種質(zhì)，從而提高生長率，尤其是提高DHA含量。
乙酰輔A羧化酶[Acetyl-Co A carboxylase, ACC, (EC6. 4. I. 2)]是一種脂肪合成的關(guān)鍵酶，而除草劑喹禾靈{2-[4-(6-氯-2-喹惡啉氧基)-苯氧基]丙酸乙酯}是該酶的抑制劑。在喹禾靈存在的情況下，細(xì)胞往往會(huì)因脂肪合成途徑受阻變得生長緩慢甚至死亡。
近年來，一些研究表明喹禾靈能夠誘導(dǎo)微藻誘變，可以進(jìn)一步篩選得到EPA含量提聞的誘變株。
例如，Chaturvedi等(2004)用 MNNG 對(duì)微綠球藻(Nannochloropsis oculata)誘變，再篩選抗除草劑喹禾靈藻株，EPA含量明顯提高。
Chaturvedi 等(2006)用 EMS 對(duì)微綠球藻(Nannochloropsis oculata)進(jìn)行誘變處理，再篩選淺藍(lán)菌素(cerulenin)及紅霉素(erythromycin)抗性藻株，EPA含量分別提聞了 29% 和 12%。
Cao Xiaohong等(2007)先后用二甲基亞砜和喹禾靈處理娃藻菱形藻屬(Nitzschia Iaevis)，其 EPA 的含量從 3. 00%提高到 3. 58%。
已知裂殖壺菌不同于微綠球藻或硅藻菱形藻屬，而且EPA的含量較低，到目前為止，還不清楚是否存在抗喹禾靈的誘變裂殖壺菌。而且如果存在這種突變株，也不清楚，經(jīng)喹禾靈突變株篩選后是EPA的含量還是DHA的含量得到提高。尤其是，到目前為止，并不清楚，經(jīng)UV誘變的裂殖壺菌是否能夠在喹禾靈的篩選中活存。
發(fā)明內(nèi)容
本申請(qǐng)的發(fā)明人驚奇發(fā)現(xiàn)，用紫外誘變技術(shù)對(duì)裂殖壺菌實(shí)施誘變，然后利用關(guān)鍵脂肪合成酶(例如乙酰輔酶A羧化酶)抑制劑，例如但不限于喹禾靈，進(jìn)行定向篩選，能夠得到DHA含量增加的裂殖壺菌變異株。此外，根據(jù)以上獲得的變異株DHA含量高，而且生長速度快。
據(jù)此，第一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)具有增加的DHA含量的裂殖壺菌變異株的方法，包括(a)利用紫外線照射(UV)誘導(dǎo)裂殖壺菌突變，以及(b)將步驟(a)獲得的菌株與乙酰輔酶A羧化酶的抑制劑接觸，來篩選具有增加的DHA含量的裂殖壺菌突變株。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述乙酰輔酶A羧化酶抑制劑是喹禾靈。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述DHA含量增加的變異株還具有快的生長速度，從而使得DHA的生廣效率提聞。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述裂殖壺菌突變株的DHA含量的提高是相對(duì)于其母體或起始菌株比較而言，優(yōu)選地，該DHA含量高于經(jīng)UV突變而未經(jīng)乙酰輔酶A羧化酶抑制劑篩選的菌株。
在第二方面，本發(fā)明提供裂殖壺菌的變異株，例如于2011年I月21日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)的保藏號(hào)為CCTCC M2011024的菌株裂殖壺菌2010-0321(Schizochytrium limacinum2010_0321)。
在另一實(shí)施方案中，所述變異株通過本發(fā)明公開的方法獲得，該方法包括(a)利用紫外線照射誘導(dǎo)裂殖壺菌突變，以及將步驟(b)獲得的菌株與乙酰輔酶A羧化酶的抑制劑接觸，來篩選具有增加的DHA含量的裂殖壺菌突變株。
在第三方面,本發(fā)明提供生產(chǎn)DHA的方法,包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明公開的裂殖壺菌變異株。在一個(gè)實(shí)施方案中，還涉及由此方法產(chǎn)生的生物量(biomass)。
在另一方面，本發(fā)明還提供食品，優(yōu)選所述食品含有本發(fā)明的生物量或根據(jù)本發(fā)明方法生產(chǎn)的DHA。

附圖簡要說明
圖I顯示紫外線對(duì)裂殖壺菌的致死作用。
圖2顯示喹禾靈濃度與裂殖壺菌致死率的關(guān)系。
圖3顯示對(duì)照菌株和變異株的生長速度和DHA含量。
圖4顯示對(duì)照菌株和變異株在50L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)中的生長速度和DHA含量。
圖5顯示對(duì)照菌株與變異株321-3的18S rRNA序列的比對(duì)結(jié)果。
具體實(shí)施方式
本文所使用的術(shù)語“菌株”在本發(fā)明中指從單一細(xì)胞或分離菌落獲得的微生物的任何培養(yǎng)物，通常為純的培養(yǎng)物。
本文所使用的術(shù)語菌株X的“變異株”或“突變株”，在本發(fā)明的內(nèi)涵之中，指任何從參照菌株X得到的菌株。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“變異株”更特別地用于指主要通過從參照菌株X突變和選擇而得到的菌株，而術(shù)語“突變株”更特別的指通過隨機(jī)或定向誘變技術(shù)應(yīng)用于菌株X上得到的菌株。[0027]一旦本發(fā)明的菌株的突變株或變異株具有本發(fā)明的基本方面，尤其是具有高的或增加的DHA含量時(shí)，其當(dāng)然被包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。
本文所使用的術(shù)語“食品”，在本發(fā)明中指任何用于人類或動(dòng)物營養(yǎng)的產(chǎn)品。特別的，食品包括用于給食嬰兒、兒童、青少年和成人的產(chǎn)品。全部或部分的本發(fā)明的食品含有至少一種本發(fā)明的生物量或DHA。本發(fā)明的食品也能含有其他通常用于農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)的成分，如添加劑、防腐劑、果類或果類提取物、調(diào)味劑、著色劑、增稠劑、谷類、巧克力等。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，食品是乳制品。本文所用術(shù)語“乳制品”指，除了奶之外，還包括任何奶衍生的產(chǎn)物，如奶粉、乳酪、冰淇淋、黃油、干酪、酸奶酪、發(fā)酵牛奶；副產(chǎn)物，如抗乳血清和干酪素以及各種制備的含有奶或奶成分作為主要 成分的食品。所述奶通常是奶牛的奶，但是也能是其他哺乳動(dòng)物的奶，如山羊、母羊、母馬、駱駝或水牛。這些乳制品均添加了本發(fā)明方法生產(chǎn)的DHA或生物量。
適于本發(fā)明的突變或誘變以及篩選的起始菌株包括異養(yǎng)的微藻類，其包括裂殖壺菌屬(Schizochytrium sp)的成員。優(yōu)選的裂殖壺菌屬成員是裂殖壺菌(Schizochytriumlimacinum)。可從許多公開可利用的來源，包括通過從自然環(huán)境收集而獲得合適的生物量。用于本發(fā)明中的裂殖壺菌株的例子包括，裂殖壺菌SR21 (Schizochytrium limacinumSR21)、Schizochytrium sp. (S8) (ATCC 20889)、Schizochytrium sp. (LC-RM) (ATCC18915)和 Schizochytrium limacinum IFO 32693 (Honda et Yokochi,日本大阪微生物研究所(IF0, Institute for Fermentation. Osaka, Japan),優(yōu)選Schizochytrium limacinumSR21或Schizochytrium limacinum IFO 32693菌株。本文所用的任何微生物或生物體的任何具體類型，包括野生菌株、突變株或重組類型。
在裂殖壺菌突變的實(shí)施方案中，將裂殖壺菌暴露于紫外線輻射約10秒-140秒
(S)，優(yōu)選約20秒-120秒，更優(yōu)選約30秒至100秒，最優(yōu)選約70秒至90秒。在一具體的實(shí)施方案中，將裂殖壺菌暴露于紫外線輻射的時(shí)間選自約70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80,81,82,83,84,85,86,87,88,89 和 90 秒。收集活存的 Schizochytrium 菌落用于乙酰輔酶A羧化酶抑制劑，例如喹禾靈的定向篩選。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案，一定濃度的喹禾靈被加入到培養(yǎng)基中來篩選喹禾靈抗性株。在篩選中使用的喹禾靈的濃度范圍為約5 μ mo I/L至100 μ mol/L,優(yōu)選約10 μ mol/L至90 μ mol/L,更優(yōu)選約50 μ mol/L至80 μ mol/L培養(yǎng)基。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述喹禾靈的濃度選自約 51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79和80 μ mol/L培養(yǎng)基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述喹禾靈的分子式為KR)-2-[4-(6-氯-2-喹噁啉氧基)_苯氧基]-丙烯酸酯}。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗喹禾靈的Schizochytrium菌落的篩選首先在含有喹禾靈的固體培養(yǎng)基中實(shí)施，然后從該固體培養(yǎng)基中挑選活存的菌落，并將其進(jìn)一步培養(yǎng)在含有喹禾靈的液體或半固體培養(yǎng)基中，以驗(yàn)證該菌落具有喹禾靈的抗性。
優(yōu)選地，基于菌株的生長速率和DHA含量進(jìn)一步篩查所挑選的抗喹禾靈的菌落。
由此，通過包括UV暴露和喹禾靈篩選的本發(fā)明的方法獲得的裂殖壺菌變異株與正?；蚱鹗嫉牧阎硥鼐容^，可以產(chǎn)生較高或增加的DHA量。所述裂殖壺菌變異株產(chǎn)生DHA的量，在7天培養(yǎng)物或生物量中，優(yōu)選在5天的培養(yǎng)物或生物量中，至少高于正常對(duì)照株或起始株約10，20，25，30，35，40 %，優(yōu)選至少高于正常對(duì)照株或起始株約20，25，30，35，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，
66，67，68，69，70%。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述裂殖壺菌變異株產(chǎn)生DHA的量為至少1.0% (w/w) ,2.0% (w/w), 3. 0% (w/w), 3. 5% (w/w), 4. 0% (w/w), 4. 5% (w/w), 5. 0% (w/w), 5. 5% (w/w) ,6. 0% (w/w),或6. 5% (w/w)的裂殖壺菌變異株的生物量干重,優(yōu)選為占裂殖壺菌變異株的生物量干重的3. 0% -6. 5% (w/w)。
在另一實(shí)施方案中，所篩選的裂殖壺菌變異株具有高于正常對(duì)照或起始菌種至少約3，4，5，6，7，8，9，10%的生長速度，優(yōu)選在7天，更優(yōu)選在5天的培養(yǎng)期內(nèi)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所篩選的裂殖壺菌變異株在不同的培養(yǎng)條件在，其生長速度和產(chǎn)生高含量DHA的能力均是穩(wěn)定的。這些不同培養(yǎng)條件例如不同的葡萄糖濃度、不同的氮源以及不同的PH值等。在任選的實(shí)施方案中，可以對(duì)所述裂殖壺菌變異株的18S RNA進(jìn)行分析，以鑒定相對(duì)于正常對(duì)照菌株的遺傳變異。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裂殖壺菌變異株的例子包括但不限于菌株321-1,321-3和303-11，更優(yōu)選菌株321-3。
在另一實(shí)施方案中，為生產(chǎn)具有較高含量的DHA生物量，將本發(fā)明的裂殖壺菌變異株在適合裂殖壺菌培養(yǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，優(yōu)選地，該變異株選自菌株321-1, 321-3,303-11或其組合，更優(yōu)選菌株321-3。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)條件可由本領(lǐng)域公知的方法來實(shí)現(xiàn)，這些方法包括在美國專利5，130，242和美國專利7，022，512公開的方法(其全部以引用的方式并入本文)，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定最佳條件。簡言之，可以在任何適合的發(fā)酵罐，優(yōu)選在提供氧來源的攪拌釜發(fā)酵罐或氣升式發(fā)酵罐中完成培養(yǎng)。應(yīng)將微生物的攪拌保持在一定的水平以使在溶解氧濃度足夠支持培養(yǎng)物生長和DHA產(chǎn)生的同時(shí)，所述攪拌不剪切或以其它方式損害微生物。優(yōu)選的溶解氧水平為至少10%的空氣飽和水平，更優(yōu)選將溶解氧水平保持在大約10%至約50%的空氣飽和水平。本發(fā)明示例性的發(fā)酵罐可以提供IVVM通氣比率,轉(zhuǎn)速為70 100RPM。
適合的發(fā)酵罐的體積為至少10至60公升，例如10，20，30，40，50，或60公升。高達(dá)100至150公升也可以使用。
可以在任何維持微生物活存的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。通常，可在約15°C至約34°C溫度下培養(yǎng)微生物，優(yōu)選將培養(yǎng)穩(wěn)定保持在約20°C至約28 °C，更優(yōu)選約22°C至約27 V。
發(fā)酵過程中的培養(yǎng)基的pH為4-10，例如5-8，優(yōu)選6_7。
發(fā)酵的時(shí)間通常持續(xù)10天或更少，優(yōu)選9天或更少，更優(yōu)選8天或更少?？梢允腔蛑辽偈?、5、6或7天。
任選的發(fā)酵時(shí)間可以持續(xù)150-200小時(shí)，例如，160-190小時(shí)，優(yōu)選170-180小時(shí)。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述方法中使用的培養(yǎng)裂殖壺菌變異株的培養(yǎng)基優(yōu)選為液體培養(yǎng)基，并優(yōu)選包含本領(lǐng)域已知的在商業(yè)可行的水平上促進(jìn)生長和DHA產(chǎn)生的組分，可以包括美國專利5，130，242和美國專利7，022，512中列出的組分。更優(yōu)選地，本發(fā)明的用于培養(yǎng)裂殖壺菌變異株以生產(chǎn)DHA的培養(yǎng)基包含碳源和有機(jī)或無機(jī)氮源。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基包含10g/L至80g/L的碳源，優(yōu)選50g/L至70g/L的碳源。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基包含10g/L至60g/L的氮源,優(yōu)選15g/L至40g/L的氮源。
在一實(shí)施方案中，所述碳源包括葡萄糖、各種淀粉、糖蜜、粉碎的玉米等。所述培養(yǎng)基中的氮源可以是例如硝酸鹽、尿素、銨鹽、氨基酸、酵母提取物或浸膏等。所述培養(yǎng)基中還可以包含可同化的磷和/或硫，例如，磷酸和硫酸。
所述培養(yǎng)基還可以含有其它的輔助發(fā)酵的物質(zhì)，例如螯合劑(例如檸檬酸)，抗發(fā)泡劑(例如大豆油)，維生素(例如硫胺和/或核黃素)，以及必要的催化金屬(例如堿土金屬，例如鎂、鈣、鋅或鐵和/或諸如銅或鈷的其他金屬)。
用于裂殖壺菌生長的具體的培養(yǎng)基的例子可以參見Jiang and Chen,Process Biochemistry 35 (2000) 1205-1209 ;Jiang and Chen, Journal of IndustrialMicrobiology & Biotechnology,(1999)Vol. 23,508-513 ；Vazhappilly and Chen,Journalof the American Oil Chemists Society, (1998)Vol. 75, No.3p 393-397.
作為一個(gè)例子，用于本發(fā)明的突變、篩選以及生產(chǎn)DHA方法中的培養(yǎng)基包含葡萄 糖40-60g/L ;酵母浸膏10-15g/L ;谷氨酸鈉4_8g/L ;氯化鈉2. 4-4. 0g/L ;硫酸鎂3. 0-6. Og/L ;硫酸銨3. 0-6. 0g/L。優(yōu)選地,用于本發(fā)明所述方法中的培養(yǎng)基的成分由葡萄糖40-60g/L ;酵母浸膏10-15g/L ;谷氨酸鈉4-8g/L ;氯化鈉2. 4-4. 0g/L ;硫酸鎂3. 0-6. 0g/L ；以及硫酸銨3. 0-6. 0g/L組成。
可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)手段來收獲生物量，所述手段例如離心、絮凝或過濾，并可立即處理或干燥后用于以后加工。無論那一種方式均可以提取脂質(zhì)。如本文中使用的，術(shù)語“脂質(zhì)”包括磷脂、游離脂肪酸、脂肪酸的酯類、三酰甘油、二?；视王?、單?；视王?、溶血磷脂、磷脂、固醇和固醇酯、類胡蘿卡素、葉黃素(例如，氧合類胡蘿素)、碳?xì)浠衔?、以及本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的其他脂質(zhì)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員充分理解的，本發(fā)明涉及的DHA可為這些不同脂質(zhì)的形式，并且不限于游離的脂肪酸。依賴于使用的提取技術(shù)，可提取脂質(zhì)的不同形式或組分。
可用有效量的溶劑提取脂質(zhì)。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員可確定合適的溶劑。通常用極性溶劑(例如，氯仿/甲醇)提取極性脂質(zhì)(例如，磷脂)，而且通常用非極性溶劑(例如，己烷)提取中性脂質(zhì)(例如，三酰甘油)。優(yōu)選的溶劑是純己烷。己烷與干生物量的合適的比例為大約4升己烷每千克干生物量。優(yōu)選將己烷與生物量在攪拌反應(yīng)容器在大約50°C的溫度混合大約2小時(shí)?；旌虾螅瑢⑸锪窟^濾并與含油的己烷分離。通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的蒸餾技術(shù)從油中移除己烷。如果具體應(yīng)用要求或需要，可進(jìn)行本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的附加的加工步驟。在如下的參考文獻(xiàn)中描述了脂質(zhì)回收的可替換的方法，所述參考文獻(xiàn)整體并入作為參考=PCT國際申請(qǐng)公開號(hào)WO 01/76715 ；PCT國際申請(qǐng)公開號(hào)WO01/76385 ；PCT 國際申請(qǐng)公開號(hào) WO 00/153512。
本發(fā)明雖然以具體的生物體和方法為例子進(jìn)行了公開，但并不意欲將本發(fā)明嚴(yán)格限于所述具體的生物體和方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，對(duì)所公開的技術(shù)方案進(jìn)行替換、修改和優(yōu)化，這是本本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的精神能夠容易做到的。而且，上述技術(shù)方案中的所涉及的步驟、條件以及菌種等元件可根據(jù)需要，任意組合，從而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
以下實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明實(shí)施方案的示例性說明，并不是所要求保護(hù)發(fā)明的限制。實(shí)施例
實(shí)施例I紫外線對(duì)裂殖壺菌的突變作用
將裂殖壺菌SR21涂布于培養(yǎng)皿上，置于紫外燈下進(jìn)行輻照，輻照時(shí)間分為O秒(S)(對(duì)照組)、30S、40S、50S、60S、70S、80S、90S和100S (實(shí)驗(yàn)組)。輻照后在黑暗中放置24h，待菌落出現(xiàn)時(shí)統(tǒng)計(jì)數(shù)量。對(duì)照組的菌落數(shù)為100%，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的致死率(圖I)。從圖I可以看出，隨著紫外輻照時(shí)間的延長，裂殖壺菌的致死率隨之增高，顯示明顯的劑量效應(yīng)。選用70S-90S輻照時(shí)間(裂殖壺菌的致死率為60% -80% )，可對(duì)裂殖壺菌實(shí)施有效的誘變處理。
所用培養(yǎng)基為葡萄糖55g/L
酵母浸膏10g/L
谷氨酸鈉5g/L
氯化鈉2.4g/L
硫酸鎂4g/L
硫酸銨4gL。
培養(yǎng)溫度22-27°C。
初始pH :5. 0-7. O。
實(shí)施例2喹禾靈對(duì)裂殖壺菌的篩選
在裂殖壺菌培養(yǎng)基中加入脂肪合成關(guān)鍵酶(乙酰輔酶A羧化酶)的抑制劑喹禾靈(Quizalofop ethyl) {(R) ~2~ [4_ (6_氯-2-喹卩惡啉氧基)-苯氧基]-丙烯酸酯}，添加濃度分別為 O μ mol/L、10 μ mol/L、30 μ mol/L、50 μ mol/L、70 μ mol/L、80 μ mol/L 和 90 μ mol/L。以對(duì)照組(Ομπιο /L)的菌落數(shù)為100%，統(tǒng)計(jì)各組菌落數(shù)，計(jì)算致死率(圖2)。從圖2可以看出，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，裂殖壺菌的致死率與喹禾靈的濃度呈正相關(guān)關(guān)系。選用喹禾靈濃度為50 μ mol/L到80 μ mol/L進(jìn)行抗性菌株篩選。
為方便操作，在培養(yǎng)基中添加喹禾靈，涂布裂殖壺菌，對(duì)紫外線抗性菌株進(jìn)行進(jìn)一步的定向篩選。
所篩選出的菌株可在含有喹禾靈的液體或半固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)以確認(rèn)其具有喹禾靈的抗性。
上述培養(yǎng)條件為
a.培養(yǎng)基配方為(g/L)
葡萄糖60g/L
酵母浸膏15g/L
谷氨酸鈉4g/L
氯化鈉3g/L
硫酸鎂5g/L
硫酸銨5g/L。
b.培養(yǎng)溫度22-27 °C。
c.初始 pH :5. 0-7. O。[0080]實(shí)施例3對(duì)照菌株及不同的突變菌株的生長率和DHA含量的差異
經(jīng)過實(shí)施例2的篩選和確認(rèn)，選出具有喹禾靈抗性的菌株200余株。然后，以菌株的生長速度和DHA含量為指標(biāo)，進(jìn)一步對(duì)所挑選的喹禾靈抗性的菌株進(jìn)行篩選。第一次復(fù)篩選出20-50株，第二次復(fù)篩從中選出3株，篩選出的三株菌株其生長速率和DHA含量都高出對(duì)照10%以上。
其培養(yǎng)的條件為
a.培養(yǎng)基配方為(g/L)
葡萄糖60g/L
酵母浸膏15g/L谷氨酸鈉4g/L
氯化鈉3g/L
硫酸鎂5g/L
硫酸銨5g/L。
b.培養(yǎng)溫度22-27O。
c.初始 pH :5· 0-7. O。
圖3表示經(jīng)過紫外輻照誘變后在喹禾靈篩選壓力下選的部分突變菌株的生物量和DHA含量。圖中最左邊是對(duì)照菌株。從圖中看出，有的突變菌株在生長速度和DHA含量兩個(gè)性狀都低于對(duì)照菌株，如321-6、321-7和321-8 ;有的這兩個(gè)性狀變化不明顯，如321-4、321-5、321-19。在突變體中 DHA 含量提高的較多，如 321-1、321-3、321-12、321-13、321_14、321-15、321-16、321-17和321-18。在突變菌株中，321-1和321-3表現(xiàn)最最突出，比對(duì)照菌株的生長速度分別提高了 10. 5%和31. 5%，DHA含量分別提高了 64. 5%和66. 4%。
除這兩個(gè)突變菌株之外，還有一個(gè)突變菌株303-11，在生物量和DHA含量上也具有良好的表現(xiàn)。
挑選321-1、321_3、和303-11這3個(gè)突變菌株作為例子，經(jīng)過以下實(shí)施例5、實(shí)施例6和實(shí)施例7的一系列的測(cè)試、比較和鑒定來驗(yàn)證本發(fā)明突變方法所篩選的菌株DHA含量高、生長速度快的特性，并能夠在不同的培養(yǎng)條件下保持穩(wěn)定。
以下實(shí)施例4-7是對(duì)所篩選的菌株進(jìn)行系統(tǒng)的分析和鑒定，包括在不同葡萄糖濃度下、不同氮源條件下、不同PH條件下進(jìn)行培養(yǎng)，多層次多角度比較對(duì)照菌株與突變菌株在生長速度和DHA積累能力，并且在50升發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，在突變菌株中確定選育菌株，以確認(rèn)通過本發(fā)明的方法所篩選的裂殖壺菌變異株在不同的生長條件下，表現(xiàn)出穩(wěn)定的生長速度快、DHA含量高的特性。
通用的培養(yǎng)條件為
培養(yǎng)溫度22-27°C，初始pH 5· 0_7· 0，IVVM通氣比率，轉(zhuǎn)速為70 100RPM，培養(yǎng)周期4-7天。
通用培養(yǎng)基含有(g/L)
葡萄糖60g/L
酵母浸膏15g/L
谷氨酸鈉4g/L
氯化鈉3g/L[0103]硫酸鎂5g/L
硫酸銨5g/L,加水至1L。
實(shí)施例4對(duì)照菌株與321-1、321-3及303-11在不同葡萄糖濃度條件下的生長率和DHA含量
為了比較對(duì)照菌株和突變菌株321-1、321_3和303-11在不同培養(yǎng)條件下的反應(yīng)特性，并進(jìn)一步確認(rèn)篩選出的菌株比對(duì)對(duì)照菌株的優(yōu)越性，進(jìn)行了一系列測(cè)試和比較。本實(shí)施例就是比對(duì)在不同碳源濃度的條件下對(duì)照菌株和突變菌株的生長率和DHA含量，即利用不同濃度的碳源替換通用培養(yǎng)基中的碳源來觀察所述菌株的特性。從表I可以看出，在不同的葡萄糖濃度(50g/l、60g/l和70g/l)條件下，3個(gè)突變菌株表型優(yōu)于對(duì)照菌株，在3個(gè)突變菌株中最好的是321-3，其次是321-1,303-11。
表I對(duì)照菌株和3個(gè)突變菌株在不同葡萄糖濃度(g/Ι培養(yǎng)基)條件下的生長率 (生物量的每天每升培養(yǎng)基克重量，g/1· d)和DHA占干細(xì)胞的含量w/w, % )
-葡萄糖含量I5060I 70
指標(biāo)生物量 DHA 生物量 DHA 生物量 DHA
對(duì)照菌株 424 4 7 4J2 535 4^56 5715321-14.42 4.20 4.94 5.78 4.82 4.86
321-34.42 4.81 — 4.94 6.08 ~J.20 T98
303-11I 3.94 I 3.79—丨 4.44 5.60 丨 4.76 5.66 一
實(shí)施例5對(duì)照菌株與321-1、321-3及303-11在不同氮源條件下生長率和DHA含
量
本實(shí)施例是比對(duì)在不同氮源條件下對(duì)照菌株和突變菌株321-1、321-3和303-11的生長率和DHA含量，即利用不同的氮源替換通用培養(yǎng)基中的氮源來觀察其特性。具體而言，分別用以下四種氮源(g/Ι培養(yǎng)基)(a)酵母浸膏(20g/l)、(b)酵母浸膏(20g/l) +谷氨酸鈉(10g/l)、(c)酵母浸膏(40g/l) +谷氨酸鈉(10g/l)、以及(d)玉米漿(40g/l) +谷氨酸鈉(10g/l)，檢測(cè)這3個(gè)菌株生物量增長和DHA積累的情況?？梢钥闯?，通過不同氮源培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，突變菌株321-1和321-3在生長速度和DHA積累都優(yōu)于對(duì)照菌株，在DHA含量方面321-3優(yōu)于321-1，而303-11只在DHA含量上比對(duì)照菌株有優(yōu)勢(shì)(表2)。
表2對(duì)照菌株和3個(gè)突變菌株在不同氮源(10g/l)條件下的生長率(生物量的每天每升培養(yǎng)基克重量，g/1. d)和DHA占干細(xì)胞的含量w/w, % )
氮源氮源(a)氮源(b)氮源(C)氮源(d)
指標(biāo)生物量I DHA生物量I DHA生物量I DHA生物量| DHA對(duì)照菌株 78 ΟΟ5Μ 986^54 2Λ55^96 1.84321-1 5.52 4.69 5.62 — 5.05 7.62 2.70 ~ 6.34 2.56321-3 5.48 5.14 5.36 — 5.17 7.50 3.82 6.86 2.59303-11 14.28 4.53 4.90 | 6.33 6.16 14.66 丨 5·70 2.66
實(shí)施例6對(duì)照菌株與321-1、321-3及303-11在不同pH條件下生長率與DHA含量[0114]本實(shí)施例是對(duì)照菌株與3株突變菌株在不同pH值條件下生長率和DHA含量。在初始PH為5. 0-7. O的范圍內(nèi)，這些菌株在不同pH條件下利用通用培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)生物量增長和DHA積累情況。表3的數(shù)據(jù)顯示，321-1和321-3兩個(gè)突變菌株的生長速度和DHA積累高于對(duì)照菌株；而突變菌株303-11在本組實(shí)驗(yàn)中的生長速度上沒有優(yōu)勢(shì)，在DHA積累上呈現(xiàn)微弱優(yōu)勢(shì)。
表3對(duì)照菌株和3個(gè)突變菌株在不同pH條件下的生長率(生物量的每天每升培養(yǎng)基克重量，g/1. d)和DHA占干細(xì)胞的含量w/w，% )
權(quán)利要求
1.裂殖壺菌變異株321-3，其于2011年I月21日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏號(hào)CCTCC M 2011024，優(yōu)選地，上述裂殖壺菌變異株具有DHA含量提高和/或生長速度快的特性，更優(yōu)選地，所述變異株在蛋白質(zhì)含量、蛋白質(zhì)的氨基酸組成和/或脂肪酸組成有差異。
2.產(chǎn)生裂殖壺菌變異株的方法，所述裂殖壺菌變異株具有DHA含量提高和/或生長速度快的特性，所述方法包括將起始裂殖壺菌暴露于紫外線以進(jìn)行誘變，以及將所述經(jīng)紫外線誘變的菌株與脂肪合成關(guān)鍵酶(乙酰輔酶A羧化酶)抑制劑(例如喹禾靈)接觸，從中篩選出DHA含量提高和/或生長速度快的變異株，更優(yōu)選地，所述變異株在蛋白質(zhì)含量、蛋白質(zhì)的氨基酸組成和/或脂肪酸組成有差異。
3.如權(quán)利要求
2所述的方法，其中所述紫外線的輻照時(shí)間為30秒-100秒，優(yōu)選為70秒_90秒。
4.如權(quán)利要求
2或3所述的方法，所述喹禾靈為{(R)-2-[4-(6-氯-2-喹噁啉氧基)-苯氧基]-丙烯酸酯}，其濃度為10 μ mol/L-90 μ mol/L,優(yōu)選為50 μ mol/L-80 μ mol/L0
5.培養(yǎng)裂殖壺菌變異株以生產(chǎn)DHA的方法,包括 將權(quán)利要求
I所述的裂殖壺菌變異株，優(yōu)選為裂殖壺菌變異株321-3，在適合培養(yǎng)裂殖壺菌以產(chǎn)生DHA的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，優(yōu)選地，所述培養(yǎng)條件包括(a).含有50-70g/L的碳源和10-20g/L氮源的培養(yǎng)基；(b) ·培養(yǎng)溫度:22-270C ； (c) ·初始pH :5. 0-7. O。
6.權(quán)利要求
5所述的方法其中所述的培養(yǎng)基包含(g/L) 葡萄糖 50-70， 酵母浸膏 20-30， 谷氨酸鈉 10-20 ;優(yōu)選地還包含 氯化鈉 2. 4-4. 0， 硫酸鎂 3. 0-6. 0， 硫酸銨 3. 0-6. O。
7.由權(quán)利要求
5或6所述方法產(chǎn)生的生物量。
8.包含權(quán)利要求
7所述生物量或其中提取的DHA的食品，優(yōu)選地，食品包括用于給食嬰兒、兒童、青少年和成人的產(chǎn)品，更優(yōu)選地所述食品是乳制品。
9.如權(quán)利要求
I所述的裂殖壺菌變異株或權(quán)利要求
2-4任一項(xiàng)所述的方法，其中所述裂殖壺菌變異株與常規(guī)的或起始的裂殖壺菌比較，所述裂殖壺菌變異株產(chǎn)生DHA的量，至少高于常規(guī)菌株或起始菌株約10，20，25，30，35，40 %，優(yōu)選至少高于常規(guī)菌株或起始菌株約 41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70%，優(yōu)選在7天的培養(yǎng)期內(nèi)。
10.如權(quán)利要求
I或9所述的裂殖壺菌變異株或權(quán)利要求
2-4和9任一項(xiàng)所述的方法，所篩選的裂殖壺菌變異株具有高于常規(guī)或起始菌種至少約3，4，5，6，7，8，9，10%的生長速度，優(yōu)選在7天的培養(yǎng)期內(nèi)。
專利摘要
本發(fā)明涉及新的裂殖壺菌變異株。特別是，本發(fā)明涉及DHA含量提高和/或生長速度快的裂殖壺菌變異株，以及利用該菌株生產(chǎn)DHA的方法。此外，本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明所述菌株的方法，包括采用紫外線對(duì)裂殖壺菌進(jìn)行誘變，以及在脂肪合成關(guān)鍵酶(乙酰輔酶A羧化酶)抑制劑(例如喹禾靈)的選擇壓力下，篩選生長速度快和DHA含量高的株系。
文檔編號(hào)A23L1/30GKCN102839129SQ201110176833
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2011年6月23日
發(fā)明者伯翰, 周潔 申請(qǐng)人:法國羅凱特兄弟公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan