專利名稱:一種硫酸銨促進(jìn)Eupergit C 250固定化草酸脫羧酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是提供了一種硫酸銨促進(jìn)Eupergit C 250固定化草酸脫羧酶的方法。
背景技術(shù)：
草酸脫羧酶(EC 4.1.1.2)催化轉(zhuǎn)化草酸為甲酸和C02，是生物體內(nèi)催化降解草酸及草酸鹽的三種酶之一，對(duì)底物草酸具有較強(qiáng)的專一性。草酸脫羧酶已被應(yīng)用于高草酸尿、尿石癥等臨床醫(yī)療檢測(cè)，其在食品、工業(yè)等領(lǐng)域也具有廣闊的應(yīng)用前景。將草酸脫羧酶應(yīng)用于啤酒工業(yè)中可控制和降解富含草酸鹽的啤酒石；用于氧化鋁冶煉工業(yè)中可以高效處理生產(chǎn)過(guò)程的草酸廢棄物；用于造紙制漿過(guò)程可降低在流程管路、過(guò)濾器或換熱器等設(shè)備上草酸鹽的結(jié)垢風(fēng)險(xiǎn)(曹茂新等，草酸脫羧酶及其應(yīng)用，中國(guó)生物工程雜志， 2005(增)170-175)。草酸脫羧酶主要存在于木材腐敗真菌中，如漆斑菌(Myrothecium Verrucari)、金針 (Flammulina velutipes)、黑曲霉(Aspergillus niger)、雙抱蘑 (Agaricus bisporus)等，細(xì)菌中枯草桿菌(Bacillus subtil is)的草酸脫羧酶研究報(bào)道較多。目前草酸脫羧酶的制備有兩種方法一是對(duì)高產(chǎn)的野生菌進(jìn)行酸誘導(dǎo)發(fā)酵，產(chǎn)酶水平約在 20U/L 左右 Oiu CX 等，Induction of an Oxalate decarboxylase in the Filamentous Fungus Trametes versicolor by Addition of Inorganic Acids, Appl Biochem Biotechnol, 2010,160 (2) :655-664) ；二是構(gòu)建草酸脫羧酶的轉(zhuǎn)基因工程菌進(jìn)行高效誘導(dǎo)合成，產(chǎn)酶水平約為820U/g(wet weight)?？傮w看，目前草酸脫羧酶的生產(chǎn)制備成本比較高，這直接限制了其在各種工業(yè)過(guò)程的應(yīng)用。
酶固定化是降低酶催化成本、提高酶穩(wěn)定性的有效方法。目前已有結(jié)晶交聯(lián)固定化草酸脫羧酶的方法(結(jié)晶化的草酸脫羧酶和使用方法，中國(guó)專利公開(kāi)號(hào)CN 101583375A)，但存在固定化過(guò)程必須首先實(shí)現(xiàn)酶的結(jié)晶、固定化酶粒度難以控制等問(wèn)題， 獲得的結(jié)晶交聯(lián)固定化草酸脫羧酶操作性能差，僅適合于制作口服酶制劑而不適用于工業(yè)降解草酸的操作條件。通過(guò)共價(jià)連接將酶固定于樹(shù)脂等載體上可以有效地改善固定化酶的的操作性能；合理控制固定化反應(yīng)條件，實(shí)現(xiàn)酶與載體間的多點(diǎn)共價(jià)連接，還可以有效穩(wěn)定多聚體酶的四級(jí)結(jié)構(gòu)，這對(duì)于維持草酸脫羧酶六聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與活性非常重要。聚丙烯酸載體C(Eupergit C)，直徑約100-250 μ m，具有化學(xué)、機(jī)械性能穩(wěn)定；可長(zhǎng)期存放；具有較高的反應(yīng)活性，可以和蛋白質(zhì)上的氨基、巰基、羥基等基團(tuán)反應(yīng)形成穩(wěn)定多點(diǎn)共價(jià)鍵；固定化后未反應(yīng)的環(huán)氧基團(tuán)易于使用巰基乙醇或二硫蘇糖醇進(jìn)行封閉等優(yōu)點(diǎn)，是酶固定化常用的商品化載體(Ephraim KK 等 Eupergit C, a carrier for immobilization of enzymes of industrial potential, Journal of Molecular Catalysis B :Enzymatic 10,2000. 157-176)，目前已成功應(yīng)用于青霉素酰胺酶、環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、磷酸二酯酶、脂肪酶等多種工業(yè)酶的固定化。使用Eupergit C固定化酶反應(yīng)歷程需經(jīng)過(guò)吸附和共價(jià)反應(yīng)兩步。由于Eupergit C表面具有較強(qiáng)的疏水性，而酶的親水性一般較強(qiáng)，因此需通過(guò)提高緩沖液的濃度促進(jìn)載體對(duì)酶的吸附，加快固定化的反應(yīng)歷程以減少固定化造成的酶活損失。而一些緩沖對(duì)價(jià)格比較高，提高緩沖液濃度的方法必將大幅增加固定化反應(yīng)的成本。 此外，利用Eupergit C固定化草酸脫羧酶用于流體中草酸及草酸鹽降解迄今未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種硫酸銨促進(jìn)Eupergit C 250固定化草酸脫羧酶的方法，該方法操作簡(jiǎn)單，制備所得固定化草酸脫羧酶酶活可達(dá)410U/g，酶活回收達(dá)84%以上。制備所得固定化草酸脫羧酶可用于工業(yè)或食品中草酸及草酸鹽的降解。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種硫酸銨促進(jìn)Eupergit C 250固定化草酸脫羧酶的方法。 包括草酸脫羧酶的誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析分離純化草酸脫羧酶，草酸脫羧酶固定化三部分。工藝步驟如下
(1)重組草酸脫羧酶的誘導(dǎo)表達(dá)
將產(chǎn)草酸脫羧酶基因工程菌E. coli BL21(DE;3)/pET32a/YVrK進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)至0D600為0. 4時(shí)，42°C熱沖擊5min，加人MnCl2及IPTG誘導(dǎo)草酸脫羧酶表達(dá)，離心收集菌體，磷酸鹽緩沖液重懸菌體后進(jìn)行超聲破碎細(xì)菌，離心收集上清為粗酶液。
(2)親和層析分離純化草酸脫羧酶
使用AKTA-FPLC系統(tǒng)進(jìn)行酶純化。粗酶液過(guò)0. 2um孔徑膜后上柱(5mL HisTrap HP)，調(diào)節(jié)洗脫液中咪唑濃度進(jìn)行洗脫，將草酸脫羧酶與其他雜質(zhì)分離。分級(jí)酶液利用 SDS-PAGE進(jìn)行分析鑒定。有活性的純化酶液經(jīng)超濾濃縮、PD-10柱脫鹽，獲得純化的草酸脫羧酶。
(3)草酸脫羧酶固定化
Eupergit C 250首先使用50mmol/L磷酸鹽緩沖液浸泡溶脹，加入純化草酸脫羧酶，加入硫酸銨使之濃度達(dá)0. l-2mol/L，在pH7-10、20-30°C下，以30_200rpm的轉(zhuǎn)速振蕩固定化反應(yīng)4-72h。離心棄去上清，加入5%巰基乙醇封閉剩余環(huán)氧基團(tuán)，反應(yīng)1 后過(guò)濾，用緩沖液洗滌，沖洗巰基乙醇及未固定上的游離酶，直至洗出液中無(wú)酶活性，即得固定化草酸脫羧酶，4°C用緩沖液保存待用。
游離草酸脫羧酶活性測(cè)定草酸脫羧酶活力測(cè)定采用終止反應(yīng)法。反應(yīng)液含 0. 115mol/L草酸鉀，80μπκ)1/1 MnCl2, 50mmol/L pH4. 0檸檬酸緩沖液，加入草酸脫羧酶液開(kāi)始反應(yīng)，IOmin后加入等體積的0. 2mol/L磷酸氫二鉀使體系pH上升至7. 2終止反應(yīng)。 過(guò)0.20 μ m微孔膜除去酶蛋白，采用液相色譜法(HPLC)檢測(cè)反應(yīng)生成的甲酸。色譜柱為 Aminex resin-based 87H 柱，柱溫 65°C ；流動(dòng)相為 0. 004mol/LH2S04，流速 0. 6mL/min ；紫外檢測(cè)器210nm檢測(cè)；進(jìn)樣量20 μ L。酶活單位定義為每分鐘催化轉(zhuǎn)化草酸產(chǎn)生1 μ mol 甲酸的酶量。
固定化草酸脫羧酶活性測(cè)定方法同游離草酸脫羧酶酶活測(cè)定方法，反應(yīng)在120rpm 震蕩條件下進(jìn)行。
固定化酶活回收率回收的固定化酶的酶活力與用于固定化的酶的總活力之比。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于
①利用成熟的固定化載體Eupergit C 250固定化草酸脫羧酶，利于草酸脫羧酶的回收及重復(fù)使用，提高酶對(duì)溫度等影響因子的穩(wěn)定性，克服了草酸脫羧酶應(yīng)用中成本較高的問(wèn)題，同時(shí)改善了固定化草酸脫羧酶應(yīng)用中的操作性能；
②應(yīng)用添加中性鹽硫酸銨促進(jìn)Eupergit C 250固定化草酸脫羧酶，提高了酶的固定化效率，操作簡(jiǎn)單，成本低。
具體實(shí)施方式
為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。
實(shí)例1
(1)重組草酸脫羧酶的誘導(dǎo)表達(dá)
將基因工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET32a/YvrK接于含氨芐青霉素(0. lmg/ml)的 LB培養(yǎng)基中37°C，200r/min進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)菌生長(zhǎng)至0D600為0. 4時(shí)，42°C熱沖擊5min，將溫度降回37°C，加人MnCl2至終濃度為5mmol/L，IPTG終濃度至0. 4mmol/L,誘導(dǎo)表達(dá)4h后， 離心收集細(xì)菌沉淀，按每克濕重菌體加IOmL磷酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH8. 0)重懸菌體，超聲破碎細(xì)菌后，離心收集上清為粗酶液。
(2)親和層析分離純化草酸脫羧酶
使用AKTA-FPLC系統(tǒng)進(jìn)行酶純化。先以5倍柱床體積A緩沖液(含20mmol/L咪唑，0. 5mol/L NaCl,50mmol/L的pH8. 0磷酸鹽緩沖液)平衡柱床。粗酶液過(guò)0. 2um孔徑膜后上柱，按以下程序洗脫含0%的B緩沖液(含20mmol/L咪唑，0. 5mol/L NaCl, 500mmol/L 的pH8. 0磷酸鹽緩沖液)沖洗15個(gè)柱體積，含10%的B緩沖液沖洗8個(gè)柱體積，B液10% 至100%線性梯度洗脫10個(gè)柱體積。洗脫流速為lmL/min。合并有活性的分級(jí)液，經(jīng)超濾濃縮、PD-10柱脫鹽，獲得純化的草酸脫羧酶。
(3)草酸脫羧酶固定化
Eupergit C 250首先使用磷酸鹽緩沖液浸泡溶脹，加入純化草酸脫羧酶，加入硫酸銨使之濃度達(dá)1.5mol/L，在pH7-10、20-30°C下，以30_200rpm的轉(zhuǎn)速振蕩固定化反應(yīng) 4-72h，離心棄去上清，加入5%巰基乙醇封閉剩余環(huán)氧基團(tuán)，反應(yīng)1 后過(guò)濾，用緩沖液洗滌，沖洗巰基乙醇及未固定上的游離酶，直至洗出液中無(wú)酶活性，即得固定化草酸脫羧酶。
測(cè)定該固定化酶活力為410U/g，酶活回收率為84. 2%
實(shí)例2
(1)重組草酸脫羧酶的誘導(dǎo)表達(dá)同實(shí)例1
(2)親和層析分離純化草酸脫羧酶同實(shí)例1
(3)草酸脫羧酶固定化
EupergitC首先使用磷酸鹽緩沖液浸泡溶脹，加入純化草酸脫羧酶，加入硫酸銨使之濃度達(dá)0. l-2mol/L，在pH7-10、20-30°C下，以30_200rpm的轉(zhuǎn)速振蕩固定化反應(yīng)4_72h， 離心棄去上清，加入5%巰基乙醇封閉剩余環(huán)氧基團(tuán)，反應(yīng)1 后過(guò)濾，用緩沖液洗滌，沖洗巰基乙醇及未固定上的游離酶，直至洗出液中無(wú)酶活性，即得固定化草酸脫羧酶。
固定化過(guò)程蛋白質(zhì)回收率、固定化酶活回收率以及固定化酶的表觀比活見(jiàn)表1。
表1添加硫酸銨對(duì)Eupergit C固定化草酸脫羧酶的影響
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權(quán)利要求
1.一種硫酸銨促進(jìn)Eupergit C 250固定化草酸脫羧酶的方法，包括重組草酸脫羧酶的誘導(dǎo)表達(dá)，草酸脫羧酶的純化，以及固定化草酸脫羧酶的步驟；其特征在于使用含活性環(huán)氧基的Eupergit C 250為固定化酶載體。
2.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于使用含活性環(huán)氧基的EupergitC 250為固定化酶載體，固定化操作過(guò)程添加硫酸銨。
3.如權(quán)利要求
1或2所述的方法，其特征在于使用含活性環(huán)氧基的EupergitC 250 為固定化酶載體，固定化操作過(guò)程添加的硫酸銨是一種中性鹽，濃度為0. l-2mol/L。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種硫酸銨促進(jìn)Eupergit C 250固定化草酸脫羧酶的方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明包括重組草酸脫羧酶的誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析分離純化草酸脫羧酶及草酸脫羧酶固定化三部分。其特征在于使用含活性環(huán)氧基的Eupergit C 250為固定化載體，在固定化過(guò)程中添加0.1-2mol/L的中性鹽硫酸銨，促進(jìn)載體對(duì)草酸脫羧酶的吸附和共價(jià)連接反應(yīng)。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，酶活回收達(dá)到84％以上；使用載體材料價(jià)格適中，物化性能穩(wěn)定，制備的固定化酶具有較好的操作性能、易于回收重復(fù)使用，可應(yīng)用于食品或造紙等工業(yè)過(guò)程中草酸的降解。
文檔編號(hào)C12N11/08GKCN102174502SQ201110028096
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年1月26日
發(fā)明者林日輝 申請(qǐng)人:廣西民族大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan