專利名稱:一種檢測腦組織中異常朊蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫檢測方法，更具體地說，涉及一種檢測腦組織中異常朊蛋白 的方法。
背景技術(shù)：
朊病毒(prion)疾病是一組累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的致死性腦病，包括人類 Creutzfeldt-Jakob 病(CJD)，Gerstmann-Straussler-Scheinker 綜合征(GSS)，致死性家 族失眠癥(fatal familial insomnia，F(xiàn)FI)和kuru?。辉趧游镏饕叙W病和牛海綿狀腦 病(瘋牛病)。人類CJD發(fā)病可呈散發(fā)性、家族性和獲得性，這類疾病潛伏期長，往往在老年 期發(fā)病，但近來在英國出現(xiàn)的新型變異型CJD卻常見于年輕患者。新型變異型CJD具有傳 染性，其發(fā)病可能與食用動物病變組織有關(guān)，它的出現(xiàn)引起了世界范圍的廣泛關(guān)注。
朊病毒疾病的顯著標(biāo)志是在患者腦組織中出現(xiàn)一種異常的朊蛋白，即PrPSe。它的 編碼基因與在正常腦組織中存在的I^Pg相同，但具有明顯不同理化特性。Prfe具有抵抗蛋 白酶水解特性，可在腦組織中形成淀粉樣堆積，因而又稱之為PrPres。目前各國科學(xué)家面臨 的最大挑戰(zhàn)是闡明在朊病毒病發(fā)病過程中正常的I^Pg如何轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏〉腜rPSe。由于尚未 發(fā)現(xiàn)有任何一種蛋白在結(jié)構(gòu)改變后獲得致病性和傳染性，這一難題的解決將會在生物學(xué)和 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)產(chǎn)生一次革命。朊病毒病的臨床表現(xiàn)缺乏特征性，有效的實驗室診斷方法的建 立將有助于朊病毒病的確診。
目前國外各國已廣泛采用世界衛(wèi)生組織推薦的CJD及其亞型的診斷標(biāo)準(zhǔn)。這一標(biāo) 準(zhǔn)在參考臨床征象、腦電圖和影響學(xué)改變的基礎(chǔ)上，著重強調(diào)使用實驗室檢測技術(shù)。這包括 對病人腦組織中PrP-res蛋白的檢測，常規(guī)病理學(xué)改變，腦脊液14-3-3蛋白的檢測、PrP基 因序列的檢測等。CJD病例的確診必須通過嚴(yán)格的實驗室診斷，對于動物源性傳播性海綿狀 腦病(transmissible spongiform encephalopathy,TSE)的確診也同樣依賴于有效的實驗 室檢測。動物TSE對人類公共衛(wèi)生的威脅已經(jīng)得到了廣泛的認(rèn)可，但目前對肉類及肉制品、 動物血清制品等常用物品仍缺乏快速準(zhǔn)確的檢測方法。隨著基因工程藥物、疫苗，轉(zhuǎn)基因動 物藥物及產(chǎn)品的研制和使用，對TSE因子的檢測問題就顯得更為重要。
我國對CJD病人的診斷仍多停留于臨床資料、腦電圖改變，僅有2-3個實驗室采用 實驗室診斷技術(shù)，并且所用檢測抗體均來自國外。所以，亟需制備出高特異性、高靈敏度的 抗朊蛋白抗體，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展一種能夠準(zhǔn)確、靈敏地檢測CJD患者腦組織中異常朊蛋 白的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種檢測腦組織中異常朊蛋白的方法。
簡而言之，我們從人血白細胞中獲得朊蛋白脫氧核糖核酸(DNA)，并利用谷胱甘 肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白表達系統(tǒng)在大腸桿菌中成功的表達了 C端朊蛋白，經(jīng)親和純 化后免疫家兔，制備朊蛋白特異抗體，然后用于檢測腦組織中異常朊蛋白的檢測。[0008]本發(fā)明的檢測方法部分建立在本發(fā)明人制備獲得了高特異性的抗朊蛋白抗體。
我們利用GST融合蛋白表達系統(tǒng)成功地表達了 C端朊蛋白，其表達產(chǎn)量高，同時具 有良好的免疫反應(yīng)性，表達蛋白經(jīng)純化后，用作免疫原免疫家兔，制備了高效價抗C端朊蛋 白多克隆抗體，表明表達的C端朊蛋白具有良好的免疫原性。
第一個方面，本發(fā)明成功克隆了朊蛋白的編碼基因
我們根據(jù)該基因公開的核苷酸序列，設(shè)計合成了一對朊蛋白特異引物。用朊蛋 白特異引物進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約750堿基對 (base pair,bp)處有一擴增條帶。擴增帶純化后，與克隆載體(pGEM_T)連接構(gòu)成重組質(zhì)粒 (pT-PrP)，DNA序列測定證實，插入片段序列與文獻報道一致，確系朊蛋白基因，氨基酸不變 夕卜，其余均與文獻報道一致。以此為基礎(chǔ)擴增出C端朊蛋白基因。
在本發(fā)明的實施方案中，所述朊蛋白特異引物的序列為
上游引物5，-GGATCC ATG AAG AAG CGG CCA AAG CCT GG-3，
C 端上游引物5，-GGATCC ATG GGT CAA GGA GGT GGC ACC CAC-3，
下游引物5'-GAA TTC TCA TGG ATC TTC TTC CGT CGT AGT-3，
第二個方面，本發(fā)明制備獲得了具有良好免疫反應(yīng)性的C端朊蛋白。
利用帶有酶切位點的C端朊蛋白表達引物，對克隆在上述pT-PrP質(zhì)粒上的C端朊 蛋白序列進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)酶切純化后，克隆至GST融合表達載體(PGEX-2T)，經(jīng) 酶切鑒定出陽性質(zhì)粒，在受體細胞DH5 α中誘導(dǎo)表達，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電 泳(SDS-PAGE)電泳證實插入片段可在大腸桿菌中表達，所表達的融合蛋白相對分子量約 為41400道爾頓。用谷胱苷肽瓊脂糖4Β柱(Si^pharose 4Β)對所表達蛋白進行純化后，經(jīng) SDS-PAGE證實，在預(yù)期位置出現(xiàn)了純化的蛋白條帶，進一步證明了插入基因在大腸桿菌中 能夠有效表達。為了進一步證明所表達的GST融合蛋白確系人朊蛋白，我們采用商品化的 人朊蛋白多克隆抗體對表達的蛋白進行蛋白免疫印跡(Western blot)鑒定，結(jié)果表達蛋白 可與特異性抗體發(fā)生反應(yīng)，而單純的GST蛋白不與朊蛋白特異性抗體發(fā)生反應(yīng)，這表明我 們所表達的蛋白確系人GST-PrP蛋白，并且具有良好的免疫反應(yīng)性。
第三個方面，本發(fā)明制備獲得了高效價的特異性C端朊蛋白的抗血清。
為制備朊蛋白抗體，用純化的融合蛋白做免疫原與等量的弗氏佐劑乳化后，免疫 家兔，共免疫4次，末次免疫經(jīng)瓊擴散實驗測得血清效價達1 16時，放血，分離血清，進一 步用ELISA測定所制備的兔血清的效價。當(dāng)以2μ g/ml的純化C端朊蛋白為包被抗原進行 ELISA測定，以P/N值=2.1為陽性，結(jié)果顯示所制備抗體的效價可達1 204800。
為進一步鑒定所制備抗體的特異性，我們?nèi)⊥?、鼠腦組織蛋白，純化融合蛋白經(jīng) SDS-PAGE電泳后，用自制和3F4抗體進行Western blot檢測，結(jié)果顯示商品化抗體和本發(fā) 明制備的抗體均可有效地識別腦組織朊蛋白和原核細胞表達的C端朊蛋白，二者無明顯差 異，所制備抗體Westernblot效價可達1 1000，與國外標(biāo)準(zhǔn)抗體效價基本相同。為排除 內(nèi)源性GST的干擾，我們利用GST特異性抗體與腦組織提取物進行Western印跡檢測，未發(fā) 現(xiàn)有相應(yīng)條帶出現(xiàn)。試驗結(jié)果表明本發(fā)明制備的抗體可特異、有效地識別C端和全長朊蛋 白。
第四個方面，本發(fā)明建立了檢測腦組織中異常朊蛋白的方法以及該方法在CJD患 者輔助診斷中的用途。[0022]接種羊瘙癢因子263K而發(fā)病的30只倉鼠腦組織使用96%的甲酸浸泡2小時，高速離心 IOOOOrpm 10 分鐘，PBS洗三次，加入裂解液(IOmM NaCl, IOmM EDTA, IOmM Tris-HCl, 0. 5% NP-40,0. 5%脫氧膽酸鈉，pH7. 4)制成10%勻漿。腦組織勻漿轉(zhuǎn)移到Eppendorf管， 4°C，2000rpm 離心。每個樣本按照一下稀釋1 50 ；1 100 ； 1 200 ； 1 400 ； 1 800 ； 1 1600共計30X6份PrPse樣品，保存于_80°C ；腦組織勻漿中加入終濃度50mg/ml的蛋 白酶K，37°C作用lh。加入等體積的2X上樣緩沖液，100°C煮沸10分鐘。
取20 μ 1進行異常朊蛋白Western blot檢測，與Dako公司的3F4抗體相比，結(jié)果 與本發(fā)明制備的抗體完全一致。
本發(fā)明的優(yōu)點
本發(fā)明制備的抗C端朊蛋白的抗血清特異性強，效價高達1 204800，在此基礎(chǔ)上 建立的檢測方法能夠高特異性，高靈敏度地檢測感染羊瘙癢因子的倉鼠腦組織中的C端朊 蛋白，而且由于其制備成本很低，所以與現(xiàn)有的檢測方法相比，在提高檢測的特異性和靈敏 度的同時還大大降低了檢測的經(jīng)濟成本。


圖1. PrP C端蛋白表達的SDS-PAGE圖。泳道1為純化的PrP C端蛋白；泳道2為 PrP C端蛋白包含體；泳道3為誘導(dǎo)表達前；泳道4為誘導(dǎo)表達后。
圖2.制備的抗體㈧與3F4(B)在檢測PrPse中的比較。
圖3.制備的抗體的檢測敏感度的檢測?？乖?jīng)梯度稀釋至1 1600仍能被 1 1000制備的抗體檢出。
實施例
試驗材料
1.質(zhì)粒和菌種
質(zhì)粒質(zhì)粒pGEX-2T為GE公司產(chǎn)品，PGEM-T載體為Promega公司產(chǎn)品。
細菌大腸桿菌DH5a為本室保存，基因型為F_，endAI，hsdR17 (rk_，mk_)， supE44, thi-1 λ -recAIgyr96, relAIA(ArgF---LacZya)U169(p80d, LacZ ΔΜ15
2.工具酶
實施例部分試驗中使用的各種限制性內(nèi)切酶均購自寶生物公司，連接酶為 Promega公司產(chǎn)品，反轉(zhuǎn)錄酶為Gibco公司產(chǎn)品。
3.化學(xué)試劑
弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自GIBCO BRL公司，還原性谷胱甘肽購自 Serva 公司，Glutathione Sepharose 4B 購自 GE 公司，酶標(biāo)抗兔 IgG 抗體購自 Santa Crutz 公司，3F4特異性單克隆抗體Dako公司，其它試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。
4.實驗動物
敘利亞倉鼠、balb/c小鼠購自生物制品檢定所。
實施例1
1.免疫原的制備和免疫
將S印hSr0Se4B純化的GST-C端朊蛋白蛋白與等量的弗氏完全佐劑混合乳化，注射家兔，分4點背部皮內(nèi)注射，每只抗原注射量約為0. 3mg,間隔2周后進行加強免疫，加強 免疫時，將等量的抗原與弗氏不完全佐劑混合乳化，抗原量Img/只，共加強免疫3次。最后 一次加強免疫1周后，耳靜脈采少量血，用瓊脂擴散法測定抗體效價，如效價合適，則1周后 頸靜脈放血，分離血清，-20 0C凍存。
2. ELISA測定抗體效價

用表達的GST-C端朊蛋白為抗原包被酶標(biāo)板，每孔100μ l(2ng/l·! 1)，4°C過夜，酶 標(biāo)板用 PBSTdOOOml 中含 8g NaCl,0. 2g KCl，1. 44g NaHPO4,0. 24g KH2PO4, ρΗ7· 4)洗 3X5 分鐘后，每孔加入不同稀釋度的待測血清100 μ 1，室溫下反應(yīng)2小時，PBST洗3X5分鐘，力口 入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠，每孔100 μ 1,37°C 1小時，PBST洗3X5分鐘，加入底物TMB， 每孔100μ 1,37°C,30分鐘，加入50 μ 1終止液，以450nm波長讀取光密度值。
3. Western blot鑒定抗體特異性
接種羊瘙癢因子263K毒株而發(fā)病的30只倉鼠腦組織使用96%的甲酸浸泡2 小時，高速離心IOOOOrpm lOmin，PBS洗三次，加入裂解液(IOmM NaCl, IOmM EDTA, IOmM Tris-HCl，0. 5% NP-40，0. 5%脫氧膽酸鈉，ρΗ7· 4)制成10%勻漿。腦組織勻漿轉(zhuǎn)移到 Eppendorf 管，4°C，2000rpm 離心。每個樣本按照一下稀釋1 50 ；1 100 ；1 200 ； 1 400 ； 1 800 ； 1 1600共計30X6份PrPse樣品；腦組織勻漿中加入終濃度50mg/ml 的蛋白酶K，37°C作用1小時。加入等體積的2X上樣緩沖液，100°C煮沸10分鐘。常規(guī)制 備15%分離膠和5%濃縮膠。常規(guī)上樣，110V電壓條件下電泳2小時。電轉(zhuǎn)移到硝酸纖 維素膜，200mA穩(wěn)流70分鐘。轉(zhuǎn)移完畢，膜用5 %脫脂奶PBS (20mmol/LTriS-HCl，pH7. 5， 0. 15MNaCl)溶液封閉過夜。與1 4000稀釋的制備的抗體室溫振蕩孵育2小時。TBST洗 3次，共30分鐘。與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠Ig G 二抗(用PBSIMtl 5000稀釋)室 溫振蕩孵育2小時。TBST洗3次，共30分鐘。ECL試劑盒顯色。
參考文獻
1. PRUSINER, S. B. Prions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998,95 (23) 13363-13383.
2. Brown DR, Herms Jff, Schmidt B, Kretzschmar HA. PrP and beta-amyloid fragments activatedifferent neurotoxic mechanisms in cultured mouse cells. Eur J Neurosci 1997,9 1162-9.
3. Safar J, Roller PP, Gajdusek DC, et al. Conformational transitions, dissociation, and unfoldingof scrapie amyloid(prion)protein. J Biol Chem 1993, 268 :20276-20284.
4.Prusiner SB, Groth DF, Bolton DC, et al. Purification and structural studies of a major scrapieprion protein. Cell 1984, 38 :127-134.
5. Rudd PM, Endo T, Colominas C, et al. Glycosylation differences between the normal and pathogenic prion protein isoform. Proc Natl Acad Sci USA 1999,96 13044-13049.
6. Caughey B, Chesebro B. Prion protein and the transmissible spongiform encephalopathies. Trends Cell Biol 1997,7:56-62.
7. Jarrett JT, Lansbury PT. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid -.a pathogenicmechanism in Alzheimer's disease and scrapie. Cell 1993,73:1055-1058.8.Prusiner SB. Molecular biology of prion diseases. Science 1991，252 1515-1522.
9. Caughey WS, Raymond LD, Horiuchi M，Caughey B. Inhibition of protease-resistant prion protein formation by porphyrins and phthalocyanines. Proc Natl Acad Sci USA 1998,95 -.12117-22.
10.Horiuchi M， Caughey B.Specific binding of normal prion protein to the scrapie form via alocalized domain initiates its conversion to the protease-resistant state. EMBO J 1999，18 (12) :3193_203.
11.趙霞，董小平，周偉等.人PrP基因體外誘導(dǎo)細胞凋亡的初步研究[J].病毒學(xué) 報 2000 (16) :3，207-211.
12. Caughey, B.，Kocisko, D. A.，Raymond, G. J. & Lansbury, P. Τ.，Aggregates of scrapie associated prion protein induce the cell—free conversion of protease-senditive prion protein to the protease-resistant state. 1995 Chem. Giol.2,807-817
13.孫憲鋒，董小平，張寶云等.羊瘙癢因263K毒株感染金黃地鼠后鼠腦組織中檢 出PrP-res蛋白及其神經(jīng)病理學(xué)研究[J]·病毒學(xué)報2001，17 (1) :48_53.
14. Chen SG, Parchi P，Brown P. Allelic origin of the abnormal prion protein isoform in familial prion diseases. Nat. Med 1997，3，1009—1015·
權(quán)利要求
1.具有良好免疫反應(yīng)性的C端朊蛋白的制備。其特征在于利用本發(fā)明的方法進行C端 朊蛋白編碼基因的克隆及表達載體的構(gòu)建，并純化出良好免疫原性的重組C端朊蛋白。
2.特異性抗C端朊蛋白抗血清的制備。其特征在于利用本發(fā)明的方法和權(quán)利要求
1中 制備的重組蛋白免疫動物，制備高效價的C端朊蛋白特異性抗體。
3.腦組織中異常朊蛋白的Western印跡檢測方法的步驟。具體步驟如下接種羊瘙癢 因子263K而發(fā)病的30只倉鼠腦組織使用96%的甲酸浸泡2小時，高速離心IOOOOrpm 10 分鐘，PBS 洗三次，加入裂解液(IOmM NaCl, IOmM EDTA, IOmM Tris-HCl,0. 5% NP-40,0. 5% 脫氧膽酸鈉，PH7.4)制成10%勻漿。腦組織勻漿轉(zhuǎn)移到Eppendorf管，4°C，2000rpm離心。 每個樣品按照以下比例稀釋1 50 ；1 100 ； 1 200 ； 1 400 ；1 800 ； 1 1600共計 30X6份PrPse樣品，加入終濃度50mg/ml的蛋白酶K，37°C作用1小時。加入等體積的2X 上樣緩沖液，100°C煮沸10分鐘。取20 μ 1樣品進行異常朊蛋白Western blot檢測。
專利摘要
發(fā)明名稱一種檢測腦組織中異常朊蛋白的方法。技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫檢測方法，更具體地說，涉及一種檢測腦脊液中異常朊蛋白的方法。解決的技術(shù)問題所研究的方法具有較高的敏感性和特異性。所建立的檢測方法大大的降低了檢測的成本。要點及主要用途本發(fā)明建立了提供了一種高特異性、高效價的抗朊蛋白的抗體用于檢測克雅氏病(CJD)腦組織中異常朊蛋白(PrPSc)的檢測方法。
文檔編號C12N15/09GKCN102146366SQ201110009850
公開日2011年8月10日 申請日期2011年1月18日
發(fā)明者姜慧英, 張寶云, 董小平, 韓俊, 高建梅, 高晨 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan