專利名稱:水稻OsWRKY45-2基因在改良植物抵抗非生物逆境脅迫中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及水稻0SWRKY45-2基因在水稻應(yīng)對非生物脅迫反應(yīng)中的功能驗證和應(yīng)用。0sWRKY45-2基因是水稻抗旱、抗鹽和抗冷反應(yīng)中的負(fù)調(diào)控因子。抑制0sWRKY45-2基因功能后，水稻應(yīng)對干旱、高鹽和低溫的抗性能力顯著提高。
背景技術(shù)：
農(nóng)作物生產(chǎn)受到諸多環(huán)境因素的影響。干旱、高鹽、低溫是最為常見的非生物逆境，嚴(yán)重影響農(nóng)作物的生長，造成產(chǎn)量和品質(zhì)的下降，在許多地區(qū)是農(nóng)業(yè)發(fā)展的瓶頸。因此， 培育抗逆農(nóng)作物一直是農(nóng)作物品種改良的主要目標(biāo)之一。長期的進(jìn)化選擇，使植物形成了抵抗干旱、高鹽、低溫等逆境脅迫的自我保護(hù)機(jī)制。雖然目前人們對這種自我保護(hù)機(jī)制的調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識仍然有限，但是已知許多植物基因參與調(diào)控這ー自我保護(hù)機(jī)制(Seki，2007)。 植物激素也參與植物應(yīng)對非生物逆境脅迫的調(diào)控,其中脫落酸(abscisic acid, ABA)在植物抵抗干旱、高鹽、低溫等逆境脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用(Verslues and Zhu, 2005).作為基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，轉(zhuǎn)錄因子在各種逆境脅迫反應(yīng)中具有重要的作用(Hu等，2006 ;Qiu等， 2008)。但是目前可用于農(nóng)作物抗非生物逆境脅迫改良的優(yōu)良基因資源非常有限。
水稻是禾本科農(nóng)作物中的重要模式植物。因為禾本科植物的染色體共線性關(guān)系 (Moore等，1995 ；Gale and Devos，1998)，禾本科植物間存在大量進(jìn)化上同源的基因。這些進(jìn)化上同源的基因在不同禾本科植物間可能參與調(diào)控相同或者相似的生理活動(Chen等， 2003)。因此，從水稻中分離逆境相關(guān)基因，并鑒定其在提高植物抗逆性方面所發(fā)揮的功能， 對于培育抗逆水稻和其他禾本科農(nóng)作物新品種將具有非常重要的意義。
本申請人于2008年10月21日提交了ー份0sWRKY45_2基因?qū)＠暾?，其申請?zhí)枮?200810197309. 9，(發(fā)明名稱水稻抗病相關(guān)基因0sWRKY45_2和它在改良水稻抗病性中的應(yīng)用)，公開號為CN101386856，
公開日為2009年3月18日。該基因的序列為序列表SEQID NO 1所示，序列全長為1629bp。該0sWRKY45-2基因的編碼區(qū)是序列表SEQ ID NO 1中第 113-1270位所示的核苷酸，該基因的功能是增加水稻對生物脅迫-白葉枯病菌和稻瘟病菌的抗性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是對已知0sWRKY45-2基因(專利申請公開號為CN101386856)新功能的進(jìn)ー步鑒定。該基因的新功能是增強水稻在非生物逆境脅迫條件下(如干旱、高鹽和低溫脅)的耐受能力；通過抑制0sWRKY45-2基因的表達(dá)增強水稻抵抗干旱、高鹽和低溫的能力，為利用這個基因改良水稻品種或其它植物抵御干旱、高鹽和低溫的能力奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明所涉及的0sWRKY45_2基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: I所示?？梢圆捎靡呀?jīng)克隆的0sWRKY45-2基因作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選到本發(fā)明的基因或同源基因。同樣，采用PCR技術(shù)，也可以從基因組、mRNA和cDNA中擴(kuò)增得到本發(fā)明的0sWRKY45-2基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。可以采用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)抑制0sWRKY45-2基因的功能，產(chǎn)生同時抗干旱和低溫的轉(zhuǎn)基因植株。采用這種技術(shù)創(chuàng)造抗性植物是傳統(tǒng)育種技術(shù)所不能達(dá)到的。
本發(fā)明為增強水稻對非生物逆境脅迫的抗性提供了一種新的方法。這種方法包括將0sWRKY45-2基因的部分片段和與能夠表達(dá)雙鏈RNA (double strand RNA, dsRNA)的載體連接、轉(zhuǎn)入水稻，通過抑制其自身0sWRKY45-2基因的表達(dá)改良水稻對非生物逆境脅迫的耐受能力。
在本發(fā)明的實施例部分，我們闡述了 0sWRKY45_2基因在抗非生物逆境脅迫中的功能驗證和應(yīng)用過程。


序列表SEQ ID NO :1.是本發(fā)明所涉及的0sWRKY45_2基因的DNA序列。
圖I.用定量RT-PCR技術(shù)分析水稻品種珍汕97在各種逆境和脫落酸處理下 0sffRKY45-2基因的表達(dá)變化。對照是未處理的樣品。
圖2.抑制0SWRKY45-2基因表達(dá)的水稻植株(陽性)提高了對干旱的耐受能力。 “陰性”表示分別從這兩個株系中分離出的陰性轉(zhuǎn)基因植株作為對照。
圖3.抑制0sWRKY45_2基因表達(dá)的水稻植株(陽性)提高了對高鹽的耐受能力。 “陰性”表示分別從這兩個株系中分離出的陰性轉(zhuǎn)基因植株作為對照。
圖4.抑制0sWRKY45_2基因表達(dá)的水稻植株(陽性)提高了對低溫的耐受能力。 “陰性”表示分別從這兩個株系中分離出的陰性轉(zhuǎn)基因植株作為對照。
圖5.抑制0sWRKY45_2基因表達(dá)的水稻植株(陽性)降低了對脫落酸的敏感性。 “陰性”表示陰性轉(zhuǎn)基因植株作為對照。
具體實施方式
本發(fā)明的前期研究工作結(jié)果提示水稻中的抗病相關(guān)基因0sWRKY45_2參與調(diào)控抗病反應(yīng)(Tao等，2009)。已知有些水稻抗病相關(guān)基因(如0sWRKY13)除了參與調(diào)控抗病反應(yīng)外，還具有其他功能(Qiu等，2008)。為了驗證0sWRKY45-2基因是否還具有其他功能，產(chǎn)生了本發(fā)明。
本發(fā)明所用水稻株系是抑制0sWRKY45_2基因表達(dá)的純合轉(zhuǎn)基因株系D115RMH1和 D115RMH6 (Tao等，2009)，用分別從這兩個株系中分離出的陰性轉(zhuǎn)基因植株作為對照；這兩個株系具有秈稻品種明恢63的遺傳背景，是采用RNA干擾技術(shù)抑制0sWRKY45-2基因的表達(dá)所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因材料(Tao等，2009)。已知該0sWRKY45-2基因序列如序列表SEQ ID NO: I所示。本發(fā)明所用抑制0sWRKY45-2基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系是采用序列表SEQ ID NO :1中 204-421,513-617和719_1038bp處對應(yīng)的一條cDNA序列(該條cDNA序列只是序列表SEQ ID NO :1中編碼序列的一部分)、利用能夠表達(dá)雙鏈RNA的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)產(chǎn)生的(Tao等，2009)。產(chǎn)生這些轉(zhuǎn)基因株系的載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化方法可參照相關(guān)文獻(xiàn)(Tao等，2009)，限于篇幅本說明書不再展開描述。
以下實施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，根據(jù)以下的描述和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。
實施例I :0sWRKY45_2基因在各種逆境反應(yīng)下的表達(dá)模式分析
我們選用秈稻品種Zhenshan 97 (Oryza sativa L. subsp. indica cv.)作為表達(dá)譜分析的材料。種子催芽后，在正常生長條件下培養(yǎng)至四葉期時進(jìn)行各種逆境和激素的處理。干旱處理是將生長在沙土中的植株缺水，分別在脅迫前、脅迫后3天、4天、6天取樣。高鹽脅迫是將幼苗由水培液移入含有200mmol/LNaCl的水培液中，分別在脅迫前，脅迫后3小時、6小時、12小時和24小時取樣。低溫脅迫是把水稻幼苗放入4°C人工氣候室,分別于脅迫前、脅迫后3小時、6小時、12小時和24小時取樣。激素處理是用含有0. 02% Tween-20的 100 u M脫落酸(ABA)均勻的噴灑水稻植株表面后，分別在脅迫前、脅迫后3小時、6小時、12 小時和24小時取樣。處理后分不同時間點取接種葉片抽提總RNA(Zh0u等，2002)。取I 5 ii g總RNA用DNaseI (美國Invitrogen公司)處理15分鐘以去除基因組DNA污染，然后參照Zhou等(2002)的方法,使用oligo (dT) 15寡聚引物和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega 公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用實時定量PCR分析試劑盒SYBR Green PCR Master Mix(大連Tokara公司)、并根據(jù)試劑盒使用說明書，在ABI 7500 Real-Time PCR system(美國 Applied Biosystems公司)儀器上進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)。用水稻內(nèi)源肌動蛋白(actin) 基因的表達(dá)量衡量、并均一化樣品RNA含量(Qiu等，2007)。定量反轉(zhuǎn)錄(qRT)-PCR分析中的 0sWRKY45-2 基因特異 PCR 引物是 w45F(5' -TTCCTTGTTGATGTGTCGTCTCA-3')和 w45R( 5' -CCCCCAGCTCATAATCAAGAAC-3')，肌動蛋白基因PCR引物是actinF(5' -TGCTATGTACGT CGCCATCCAG-3')和 actinR(5' -AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3')。分析結(jié)果表明，干旱抑制0sWRKY45-2基因表達(dá)，高鹽和ABA先抑制后誘導(dǎo)0sWRKY45_2基因，低溫誘導(dǎo)0sWRKY45_2 基因(圖I)。這些結(jié)果提示0sWRKY45-2基因可能參與調(diào)控水稻對高鹽、干旱和低溫脅迫的反應(yīng)，同時可能還參與調(diào)控ABA信號傳導(dǎo)。
實施例2 :轉(zhuǎn)基因植株增強了對干旱的耐受能力
本實施例對抑制0sWRKY45-2基因表達(dá)的兩個T2株系(D115RMH1和D115RMH6)進(jìn)行了干旱的脅迫實驗，用分別從這兩個株系中分離出的陰性轉(zhuǎn)基因植株作為對照。將抑制 0sWRKY45-2基因表達(dá)植株(陽性)和對應(yīng)的陰性轉(zhuǎn)基因植株催芽后直播到小圓桶中。試驗用的土壤為南方水稻土與粗沙按體積比I : I混合而成，每圓桶等量均勻沙土加等體積水， 水自行滲漏確保土壌的緊實度一致，試驗設(shè)3次重復(fù)。在植株長至4葉期時進(jìn)行斷水干旱脅迫3到5天，然后復(fù)水，3到7天后調(diào)查植株的存活率并拍照。結(jié)果表明，與陰性對照相比，抑制0sWRKY45-2基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系增強了對干旱的耐受能力(圖2)。在復(fù)水后三天，兩個抑制0sWRKY45-2基因表達(dá)株系(D115RMH1和D115RMH6)的成活率分別是28%和 28%，而對應(yīng)的陰性植株的成活率分別是18%和20% (圖2)。
實施例3 :轉(zhuǎn)基因植株增強了對高鹽的耐受能力
本實施例對抑制0sWRKY45-2基因表達(dá)的兩個T2株系(D115RMH1和D115RMH6)進(jìn)行了高鹽的脅迫實驗，用分別從這兩個株系中分離出的陰性轉(zhuǎn)基因植株作為對照。按照實施例ニ中的方法種植水稻材料。在植株長至4葉期時用200mM的NaCl溶液灌溉4到6天， 持續(xù)觀察表型，恢復(fù)3到7天后調(diào)查植株的存活率并拍照。結(jié)果表明，與陰性對照相比，抑制0sWRKY45-2基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系增強了對高鹽的耐受能力(圖3)。在脅迫后5天，兩個抑制0sWRKY45-2基因表達(dá)株系(D115RMH1和D115RMH6)的成活率分別是43%和42%，而對應(yīng)的陰性植株的成活率分別是20%和18% (圖3)。
實施例4 :轉(zhuǎn)基因植株增強了對低溫的耐受能力
本實施例對抑制0sWRKY45-2基因表達(dá)的兩個T2株系(D115RMH1和D115RMH6)進(jìn)行了低溫的脅迫實驗，用分別從這兩個株系中分離出的陰性轉(zhuǎn)基因植株作為對照。按照實施例二中的方法種植水稻材料。在植株長至4葉期時進(jìn)行低溫(4°C )脅迫4到6天，然后將植株搬至正常的室溫條件下，恢復(fù)3到7天后調(diào)查植株的存活率并拍照。結(jié)果表明，與陰性對照相比，抑制0sWRKY45-2基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系增強了對低溫的耐受能力(圖4)。在恢復(fù)后7天，兩個抑制0sWRKY45-2基因表達(dá)株系(D115RMH1和D115RMH6)的成活率分別是 51%和36%，而對應(yīng)的陰性植株的成活率分別是36%和13% (圖4)。
實施例5 :轉(zhuǎn)基因植株降低了對脫落酸的敏感性
很多外界環(huán)境的變化會影響植物體內(nèi)脫落酸含量的變化(Christmann等，2006)， 而過量脫落酸抑制水稻幼苗的生長(Xiang等，2008)。本實施例對抑制0sWRKY45_2基因表達(dá)的兩個T2株系(D115RMH1和D115RMH6)進(jìn)行了對脫落酸的敏感性實驗，用分別從這兩個株系中分離出的陰性轉(zhuǎn)基因植株作為對照。將抑制0sWRKY45-2基因表達(dá)植株(陽性)和對應(yīng)的陰性轉(zhuǎn)基因植株的種子去殼消毒，在1/2MS培養(yǎng)基(Murashige and skoog, 1962)平板上生長3天左右后，挑選發(fā)芽良好長勢一致的種子轉(zhuǎn)移到含有3 μ M脫落酸的1/2MS培養(yǎng)基的小方盒中，每個小方盒一半種植對照材料，另一半種植轉(zhuǎn)基因材料，同時以不含脫落酸的1/2MS培養(yǎng)基中生長材料作為對照，生長7-10天后觀察表型并照相，分別統(tǒng)計根長和株高。結(jié)果表明，與陰性對照相比，抑制0sWRKY45-2基因表達(dá)株系(D115RMH1和D115RMH6) 降低了對脫落酸的敏感性(圖5)。在脫落酸處理生長7天，抑制0sWRKY45-2基因表達(dá)株系 D115RMH1的根長和株高分別是2. 22厘米與4. 26厘米，株系D115RMH6的根長和株高分別是
2.25厘米與4. 44厘米，而陰性對照的根長和株高分別為I. 38厘米和3. 88厘米(圖5)。
以上結(jié)果說明0sWRKY45-2基因在水稻抵抗非生物逆境脅迫中是負(fù)調(diào)控因子。我們可以通過抑制0sWRKY45-2基因表達(dá)培育耐干旱、高鹽和低溫以及對脫落酸不敏感的農(nóng)作物，特別是應(yīng)用在水稻作物上。
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權(quán)利要求
1.抑制0SWRKY45-2基因表達(dá)在增加水稻耐干旱、高鹽和低溫以及對脫落酸不敏感中的應(yīng)用，其特征在于所述基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。
專利摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及水稻OsWRKY45-2基因在抵抗非生物逆境脅迫中的功能驗證。利用基于RNA干擾(RNA interference，RNAi)原理的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將OsWRKY45-2基因的部分DNA片段與能夠表達(dá)雙鏈RNA的載體連接并轉(zhuǎn)入水稻品種，抑制水稻品種中OsWRKY45-2基因的表達(dá)。OsWRKY45-2基因表達(dá)量降低的遺傳轉(zhuǎn)化水稻對干旱、高鹽、低溫和脫落酸的耐受能力顯著增強，證明OsWRKY45-2基因在水稻抵抗非生物逆境脅迫中是負(fù)調(diào)控因子。我們可以通過抑制OsWRKY45-2基因表達(dá)培育耐干旱、高鹽和低溫以及對脫落酸不敏感的農(nóng)作物。
文檔編號C12N15/29GKCN101948847 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201010194752
公開日2012年7月25日 申請日期2010年6月1日
發(fā)明者王石平, 陶增 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非專利引用 (1),