專利名稱：:應(yīng)用發(fā)酵生產(chǎn)l-蘇氨酸的方法應(yīng)用發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物工業(yè)。特別是涉及應(yīng)用微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，以及用于該生產(chǎn)方法的基因工程菌。
背景技術(shù)：
：蘇氨酸是動(dòng)物維持生長所必需的氨基酸，在以菜籽粕或大豆粕為蛋白質(zhì)主要來源的生豬低蛋白質(zhì)日糧中，賴氨酸是第一限制性氨基酸，蘇氨酸是第二限制性氨基酸。L-蘇氨酸廣泛用于動(dòng)物飼料和食品添加劑，以及用作醫(yī)學(xué)或藥物學(xué)用途的流體和合成材料。L-蘇氨酸是使用衍生自野生型大腸桿菌、棒狀桿菌屬、殺雷氏菌(Serratia)、普羅威登斯菌(Providencia)等的合成突變體以及它們的二氨基庚二酸、甲硫氨酸、賴氨酸或異亮氨酸營養(yǎng)缺陷的合成突變體(日本專利申請公開號(hào)平2-219582，申請人Microbiolo.Biotechnol.，以及韓國專利公開號(hào)92-8365)。中國專利公開號(hào)85104604A公開了一種采用短桿菌屬細(xì)菌的a-氨基-(3-羥基戊酸(AHV)和S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)雙重抗性變異株生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法。韓國專利申請?zhí)?0-22965公開了一種L-蘇氨酸生產(chǎn)菌株TF4076(KFCC10718)，它是甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型并且抗蘇氨酸類似物(AHV:a-氨基-卩-羥基戊酸)、賴氨酸類似物(AEC:S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸)、異亮氨酸類似物(a-氨基丁酸)和甲硫氨酸類似物(乙硫氨酸)。在大腸桿菌中L-蘇氨酸的合成路線主要是二氫吡啶-2,6-二羧酸一一一L-賴氨酸天冬氨酸一天冬氨酰磷酸一/琥珀高絲氨酸一L-甲硫氨酸/魚高絲氨酸、,高絲氨酸磷酸一L-蘇氨酸一L-異亮氨酸在大腸桿菌中，L-蘇氨酸的合成從天冬氨酸開始，天冬氨酸在天冬氨酸激酶I(AKI)催化下轉(zhuǎn)變?yōu)樘於滨Ａ姿?，?jīng)過還原最后生成高絲氨酸。天冬氨酸激酶I(AKI)是一個(gè)多功能酶，從天冬氨酸到高絲氨酸的代謝均由AKI催化。AKI由thrA基因編碼。高絲氨酸在高絲氨酸激酶催化下磷酸化，磷酸化的高絲氨酸通過蘇氨酸合成酶合成L-蘇氨酸。高絲氨酸激酶由thrB基因編碼，而蘇氨酸合成酶由thrC基因編碼。對蘇氨酸的代謝調(diào)節(jié)，現(xiàn)在研究得比較清晰。在L-蘇氨酸的代謝過程中，thrA基因編碼的AKI起決定作用。一般大腸桿菌合成蘇氨酸的量有限，因?yàn)長-蘇氨酸抑制AKI酶的活性，并通過蘇氨酸-tRNAs調(diào)節(jié)蘇氨酸操縱子的轉(zhuǎn)錄。蘇氨酸類似物可以用來篩選蘇氨酸生產(chǎn)菌種，如在a-氨基-P-羥基戊酸的抗性菌株中，thrA基因發(fā)生突變,突變基因編碼的AKI酶抵抗蘇氨酸的反饋抑制，從而導(dǎo)致蘇氨酸的積累。在具有抗生素borrelidin抗性的大腸桿菌中，蘇氨酸-tRNAs合成酶的構(gòu)象發(fā)生變化，大大降低了與蘇氨酸的親和力，使蘇氨酸大量積累。限制蘇氨酸大量合成的另一個(gè)主要因素來源于異亮氨酸，異亮氨酸的合成以L-蘇氨酸為原料。因此，如果其合成途徑不切斷，只能導(dǎo)致異亮氨酸的積累，而L-蘇氨酸含量不會(huì)增高；另一方面，異亮氨酸對thrA基因的轉(zhuǎn)錄水平具有強(qiáng)烈的反饋抑制，高含量的異亮氨酸阻斷AKI酶的合成。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的是通過改變菌種的代謝調(diào)節(jié)，尋找到一種能高產(chǎn)蘇氨酸的基因工程菌。為達(dá)到上述目的，本研究人員進(jìn)行了不懈的努力和勤奮的研究，結(jié)果成功地獲得了經(jīng)過下述改性的大腸桿菌(l)琥珀酰高絲氨酸合成酶和二氫吡啶二羧酸合成酶的細(xì)胞內(nèi)活性減弱；(2)蘇氨酸脫氨酶的細(xì)胞內(nèi)活性降低；(3)天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶和磷酸烯醇式丙酮酸激酶的細(xì)胞內(nèi)活性增強(qiáng)；和/或(4)導(dǎo)入了來自透明顫菌的血紅蛋白基因。(下文也稱"本發(fā)明的細(xì)菌")優(yōu)選的，本發(fā)明的細(xì)菌是包括上述所有改性的大腸桿菌；最優(yōu)選的，本發(fā)明改性的大腸桿菌是基因工程菌K21P3。在本發(fā)明中，術(shù)語"細(xì)胞內(nèi)活性增強(qiáng)"表示與野生型菌株(例如5大腸桿菌BL21菌株)或親本菌株(該菌株在本發(fā)明特定的組合中包括所有酶的細(xì)胞內(nèi)活性都沒有增強(qiáng)的菌株)相比，細(xì)胞內(nèi)的酶促活性增強(qiáng)，還表示一種細(xì)菌具有一種野生型菌株或親本菌株所沒有的酶促活性。在本發(fā)明中，術(shù)語"細(xì)胞內(nèi)活性降低"表示與野生型菌株或親本菌株相比，細(xì)胞內(nèi)的酶促活性減弱。用于測定上述酶活性的方法是公知的，并且，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便準(zhǔn)確地證實(shí)酶在細(xì)胞內(nèi)的活性是增強(qiáng)或是減弱。本發(fā)明的細(xì)菌是大腸桿菌，其中，高絲氨酸合成酶和二氫吡啶二羧酸合成酶的細(xì)胞內(nèi)活性降低。高絲氨酸合成酶，或琥珀酰高絲氨酸合成酶是催化高絲氨酸生成琥珀酰高絲氨酸的酶，是L-甲硫氨酸合成代謝途徑的關(guān)鍵酶。二氫吡啶二羧酸合成酶是催化天冬氨酸-P-半醛生成二氫吡咬-2,6-二羧酸的酶，是L-賴氨酸合成代謝途徑的關(guān)鍵酶。降低琥珀酰高絲氨酸合成酶和降低二氫吡啶二羧酸合成酶的細(xì)胞內(nèi)活性，相應(yīng)的增加了L-蘇氨酸和L-異亮氨酸生成途徑的代謝流，從而使L-蘇氨酸和L-異亮氨酸過量積累。在本發(fā)明的細(xì)菌中，高絲氨酸合成酶和二氫吡啶二羧酸合成酶是通過化學(xué)誘變和紫外誘變的方法使其在細(xì)胞內(nèi)的活性降低。使用化學(xué)誘變劑硫酸二乙酯(DES)和甲硫胺處理大腸桿菌，獲得突變菌株，對突變株進(jìn)行培養(yǎng)選育，并進(jìn)一步對它進(jìn)行紫外誘變和組成型選育。通過對選育后的突變株的發(fā)酵液離心，收集上清液，測定其蘇氨酸的含量，最后將源于大腸桿菌突變株的琥珀酰高絲氨酸合成酶和二氫吡啶二羧酸合成酶與源于大腸桿菌的野生型琥珀酰高絲氨酸合成酶和二氫吡啶二羧酸合成酶進(jìn)行氨基酸序列對比分析，發(fā)現(xiàn)琥珀酰高絲氨酸合成酶的突變包括脯氨酸取代第61位的絲氨酸，絲氨酸取代第107位的甘氨酸，組氨酸取代第165位的絲氨酸。二氫吡啶二羧酸合成酶的突變包括丙氨酸取代第44位的蘇氨酸，賴氨酸取代第55位的谷氨酸，組氨酸取代第65位的天冬氨酸。本發(fā)明的細(xì)菌是大腸桿菌，其中，蘇氨酸脫氨酶的細(xì)胞內(nèi)活性降低。蘇氨酸脫氨酶催化L-蘇氨酸生成ct-酮基丁酸，再經(jīng)過乙酰羥酸合成酶等，進(jìn)一步生成L-異亮氨酸。蘇氨酸脫氨酶是大腸桿菌中L-蘇氨酸的分解酶，它的編碼基因是tdc。如果上述合成途徑不切斷，只能導(dǎo)致異亮氨酸的積累，而蘇氨酸的含量不高。蘇氨酸脫氨酶的細(xì)胞內(nèi)活性降低可通過Red同源重組技術(shù)敲除蘇氨酸脫氨酶基因?qū)崿F(xiàn)。Red同源重組技術(shù)作為一種新型基因打靶技術(shù)，可用于構(gòu)建具有特定突變的基因工程菌，以改變生物代謝途徑。Red同源重組技術(shù)是將一段攜帶與靶基因兩翼各有40-60bp同源序列的PCR片段導(dǎo)入宿主菌細(xì)胞，利用入噬菌體Red重組酶(EXO，Beta,Gam三種蛋白)的作用，使線性DNA片段與染色體的特定靶序列進(jìn)行同源重組，使靶基因被線性DNA片段置換下來。在本發(fā)明的細(xì)菌中，通過Red同源重組技術(shù)敲除蘇氨酸脫氨酶的基因或己知CadA基因，構(gòu)建蘇氨酸脫氨酶基因缺陷株(異亮氨酸缺陷的大腸桿菌菌株)，從而使蘇氨酸脫氨酶的細(xì)胞內(nèi)活性降低。在本發(fā)明的細(xì)菌中，利用代謝工程技術(shù)構(gòu)建蘇氨酸脫氨酶基因缺陷株(異亮氨酸缺陷的大腸桿菌菌株)，有望降低L-蘇氨酸的分解，積累L-蘇氨酸，促進(jìn)菌體生長。運(yùn)用PCR技術(shù)，擴(kuò)增出兩翼與蘇氨酸脫氨酶基因的上下游序列同源，中間為氯霉素抗性基因的DNA片段。經(jīng)電轉(zhuǎn)化，將外源DNA片段分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌(K16P2)中。在Red重組酶的作用下，外源DNA片段與染色體上同源區(qū)域重組，將蘇氨酸脫氨酶基因敲除，獲得蘇氨酸脫氨酶基因缺陷株(K16P3)(異亮氨酸缺陷的大腸桿菌菌株)。增加酶的細(xì)胞內(nèi)活性的方法包括以下方法，以及這些方法的任意組合，但并不局限于這些方法。常用于增加細(xì)胞內(nèi)活性的方法是提高所述酶的表達(dá)量的方法。具體地講，提高酶表達(dá)量的方法包括以下方法(1)導(dǎo)入含有酶基因的質(zhì)粒作為質(zhì)粒，是可以使用且能在大腸桿菌細(xì)胞中自主復(fù)制的載體，可以用公知方法將其導(dǎo)入。就是說，可以將目的(感興趣的)基因插入所述載體，并且可以用該轉(zhuǎn)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌。該載體優(yōu)選是多拷貝型質(zhì)粒。所述目的基因可以由相同質(zhì)?；虿煌|(zhì)粒攜帶，某些基因可以由相同質(zhì)粒攜帶，導(dǎo)入所述基因的順序沒有特別限制。(2)增加染色體上酶基因的拷貝數(shù)量通過用Mu噬菌體等擴(kuò)增染色體的DNA，增加所述拷貝數(shù)量。染色體DNA上的DNA可以是大腸桿菌原來就有的，或是通過使用轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)座子(BergiD,E.和Burgc,M，生物技術(shù)，1，417(1983))(日本專利申請后期公開No.2-109985)的方法，或同源重組方法插入宿主微生物染色體中。(3)改變酶基因的啟動(dòng)子序列可以改變啟動(dòng)子序列，以便提高轉(zhuǎn)錄量，并進(jìn)而提高表達(dá)量。例如，可以通過將一個(gè)突變導(dǎo)入啟動(dòng)子中來增強(qiáng)該啟動(dòng)子，以便提高位于該啟動(dòng)子下游的基因的轉(zhuǎn)錄量。除了將突變導(dǎo)入所述啟動(dòng)子之外，可以導(dǎo)入新的能在大腸桿菌中起作用的啟動(dòng)子，如lac、t卬、tac、trc和PL。另外，可以通過導(dǎo)入新的增強(qiáng)子以提高基因的轉(zhuǎn)錄量。盡管所述啟動(dòng)子序列可以是染色體上酶基因的啟動(dòng)子或質(zhì)粒上酶基因的啟動(dòng)子，但是優(yōu)選染色體上酶基因的啟動(dòng)子。例如日本專利申請后期公開No.l-215280中披露了將諸如啟動(dòng)子的基因?qū)肴旧wDNA的方法。本發(fā)明優(yōu)選上述第一種導(dǎo)入含有酶基因質(zhì)粒的方法。在本發(fā)明的細(xì)菌中，通過增加染色體外質(zhì)粒的表達(dá)量，來增強(qiáng)天冬氨酸-|3-半醛脫氫酶、高絲氨酸激酶，蘇氨酸合成酶和磷酸烯醇式丙酮酸激酶的細(xì)胞內(nèi)活性。對上述酶基因的來源沒有特別限制，因此，各種來源的都可以使用，只要該基因能夠在大腸桿菌中表達(dá)，并且其遺傳產(chǎn)物能在大腸桿菌中起作用就行。另外，作為提高酶比活性的方法，還包括導(dǎo)入具有增強(qiáng)比活性的突變的酶，包括去除其反饋抑制作用的酶等。在這里，"去除反饋抑制作用"表示對抑制作用大體上減弱，而不是要對抑制完全脫敏，只要反饋抑制作用程度低于源于大腸桿菌的野生酶的程度就行。而不論它是該生物的野生型或突變型酶?？梢杂霉姆椒ㄔu(píng)估反饋抑制作用的程度。如披露于國際公開號(hào)WO95/16042中的實(shí)施例1和實(shí)施例2中的方法。天冬氨酸激酶(以下簡稱為AK)是一種將天冬氨酸轉(zhuǎn)化成e-磷酸天冬氨酸的酶，它是天冬氨酸及其衍生氨基酸生物合成途徑的主要調(diào)節(jié)部位。大腸桿菌有三種類型的AK(AKI、AKII、AKIII)，前兩種具有高絲氨酸脫氫酶(以下有時(shí)簡稱為HD)活性的雙功能酶，一種是由thrA基因編碼的AKI-HDI，另一種是由MetL(M)基因編碼的AKII-HDII。只有AKIII是單功能酶，它是稱為lysC的基因的產(chǎn)物，并已知受賴氨酸的阻遏和反饋抑制。另一方面，AKI受蘇氨酸和異亮氨酸的協(xié)同阻遏，并受蘇氨酸抑制，而AKII則受甲硫氨酸阻遏。其細(xì)胞內(nèi)活性的比例約為AKI:AKII:AKIII=5:1:4。本發(fā)明所述的大腸桿菌變體，其中還包括天冬氨酸激酶的細(xì)胞內(nèi)活性增強(qiáng)。在本發(fā)明的細(xì)菌中，通過改造與蘇氨酸的結(jié)合位點(diǎn)，去除天冬氨酸激酶I(AKI)的L-蘇氨酸的反饋抑制作用和通過改造與賴氨酸的結(jié)合位點(diǎn)，去除天冬氨酸激酶ni(AKIII)的L-賴氨酸的反饋抑制作用，以增強(qiáng)天冬氨酸激酶的細(xì)胞內(nèi)活性。去除對天冬氨酸激酶I(AKI)L-蘇氨酸反饋抑制作用的突變包括用另一種氨基酸，優(yōu)選甘氨酸取代第109位上的絲氨酸，用另一種氨基酸，優(yōu)選丙氨酸取代第163位上的絲氨酸。進(jìn)行以上改性后得到的本發(fā)明所述的大腸桿菌變體，是大腸桿菌BL1126P。去除對天冬氨酸激酶III(AKIIDL-賴氨酸反饋抑制作用的突變包括用另一種氨基酸，優(yōu)選天冬氨酸取代第330位上的甘氨酸，用另一種氨基酸，優(yōu)選甘氨酸取代第400位上的半胱氨酸，用另一種氨基酸，優(yōu)選天冬氨酸取代第403位上的甘氨酸。進(jìn)行以上改性后得到的本發(fā)明所述的大腸桿菌變體，是大腸桿菌BL2125P。9眾所周知的是，在種之間或菌株之間可能存在不影響其活性的氨基酸序列差異，并且，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)很容易地識(shí)別于上述特定氨基酸殘基。用于DNA體外誘變處理的制劑的例子包括羥胺等，羥胺是通過將胞嘧啶變成N4-羥基胞嘧啶，導(dǎo)致胞嘧啶被胸腺嘧啶取代的化學(xué)誘變處理劑。當(dāng)對微生物本身進(jìn)行誘變處理時(shí)，是用紫外線輻射或常用于誘變的諸如N-甲基-N，-硝基-N-亞硝基胍(NTG)以及上面提到硫酸二乙酯(DES)、甲硫胺和亞硝等誘變劑進(jìn)行。我們可以用以下方法獲得編碼去除蘇氨酸、賴氨酸的反饋抑制作用的突變型AKI、AKIII的DNA。例如，對含有野生型AKI、AKIII的基因或具有突變的其它AKI、AKIII基因的DNA進(jìn)行體外誘變處理，并將經(jīng)過誘變處理的DNA與和宿主兼容的載體DNA連接，制備重組DNA。將重組的DNA導(dǎo)入宿主微生物中，篩選能表達(dá)突變型AKI、AKIII的轉(zhuǎn)化體，這樣的轉(zhuǎn)化體具有突變型AKI、AKIII的基因。或者，可以將含有野生型AKI、AKIII基因或具有突變的其它AKI、AKIII基因的DNA與宿主兼容的載體DNA連接，以便制備重組DNA。然后，對重組DNA進(jìn)行體外誘變處理，并且將其導(dǎo)入宿主微生物中，篩選能表達(dá)突變型AKI、AKIII的轉(zhuǎn)化體，這樣的轉(zhuǎn)化體同樣具有該突變型基因。另外，在本發(fā)明的大腸桿菌中，研究人員優(yōu)先選用下列方法對產(chǎn)生野生型天冬氨酸激酶的微生物進(jìn)行誘變處理，獲得能產(chǎn)生去除對L-蘇氨酸、L-賴氨酸反饋抑制作用的天冬氨酸激酶的突變菌株，然后，從該突變菌株中獲得去除對L-蘇氨酸、L-賴氨酸反饋抑制作用的天冬氨酸激酶的突變型基因。之后，將突變型AKI、AKIII基因的DNA和宿主兼容的載體DNA連接，制備重組DNA，然后將其導(dǎo)入宿主微生物中，篩選能表達(dá)突變型AKI、AKIII的轉(zhuǎn)化體，這樣的轉(zhuǎn)化體具有該突變型基因。由于基因工程菌中外源基因的表達(dá)，含有重組質(zhì)粒的細(xì)胞會(huì)需要更多的氧，從而可能會(huì)改變細(xì)胞的能量代謝，而不利于細(xì)胞的生長(Khoravi，M，Ryanw，webter，D，A等等，質(zhì)粒，l朔，23:138-143)在大規(guī)模高密度的發(fā)酵中，細(xì)胞大量生長造成溶解氧濃度急劇下降。因此，提高設(shè)備通氧條件，使細(xì)胞處于有氧呼吸狀態(tài)，成為基因工程菌發(fā)酵中關(guān)鍵問題之一?，F(xiàn)有的改進(jìn)方法主要是提高攪拌速度，增加通氣量，加入助溶劑，提高氣液傳質(zhì)系數(shù)等等，但效果有限，并且會(huì)大大增加生產(chǎn)成本。本發(fā)明的細(xì)菌是大腸桿菌，通過宿主菌中引入細(xì)菌血紅蛋白基因，使其在宿主中表達(dá)，提高大腸桿菌基因工程菌的氧傳遞體系，增加氧傳遞量。透明顫菌是一種生長于貧氧環(huán)境中的專性好氧革蘭氏陰性細(xì)菌，能誘導(dǎo)合成一種血紅蛋白，透明顫菌血紅蛋白(Vitreocilla，Hemoglobin，VHb)是一種氧結(jié)合蛋白，這種蛋白的同源二聚體對氧的親和力與真核生物相近，有很高的氧解離常數(shù)，具有很強(qiáng)的氧傳輸能力，尤其是它自身基因的啟動(dòng)子在貧氧條件下能大量有效地啟動(dòng)該基因表達(dá)，可提高發(fā)酵液中氧的傳遞速度，從而促進(jìn)細(xì)胞生長和蛋白質(zhì)的合成。Vgb在大腸桿菌的表達(dá)能增加電子傳遞數(shù)目，跨膜pH值和ATP合成速率。在本發(fā)明中，將透明顫菌中血紅蛋白基因(Vgb)插入質(zhì)粒PT5，構(gòu)建含有Vgb基因的克隆的質(zhì)粒PT6(參見實(shí)施例8)，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中。本發(fā)明所述的大腸桿菌變體中進(jìn)一步包括天冬氨酸-|3-半醛脫氫酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶和/或磷酸烯醇式丙酮酸激酶中的至少一種酶的細(xì)胞內(nèi)活性增強(qiáng)。其中所述細(xì)胞內(nèi)酶活性的增強(qiáng)是通過增加質(zhì)粒表達(dá)量而提高其細(xì)胞內(nèi)活性。本發(fā)明所述的大腸桿菌變體中進(jìn)一步導(dǎo)入了血紅蛋白基因，所述的血紅蛋白基因來源于透明顫菌的血紅蛋白基因。在本發(fā)明的細(xì)菌中，高絲氨酸合成酶、二氫吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、天冬氨酸-(3-半醛脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸激酶和蘇氨酸脫氨酶分別源于大腸桿菌，血紅蛋白酶源于透明顫菌。經(jīng)過以上改性的本發(fā)明的大腸桿菌變體是基因工程菌K21P3。11本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，該方法包括在在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的大腸桿菌，并在其培養(yǎng)基中產(chǎn)生和聚集L-蘇氨酸，并從中收集L-蘇氨酸。所使用的各種培養(yǎng)基可選用蘇氨酸生產(chǎn)中常規(guī)使用的各種培養(yǎng)基，例如使用下述配方的培養(yǎng)基1、斜面培養(yǎng)基(g/1)葡萄糖2.0，NH4C11.0，KH2P041.5，Na2HP043.5,MgS04'7H200.1，瓊脂20.0，加蒸餾水溶解，調(diào)pH7.0-7.2，定容lOOOml，0.8Kg/cm2滅菌30分鐘，冷卻至5(TC左右加入氨芐青霉素溶液，最終濃度為50y/ml。2、搖瓶種子培養(yǎng)基(g/1)葡萄糖40.0，KH2P041.0，MgS04-7H200.5，(NH4)2S0410.0，玉米槳2.0，CaC0315，氨節(jié)青霉素50y/ml，加雙蒸水溶解，調(diào)pH7.0-7.2，定容lOOOml，分裝至500ml搖瓶，0.8Kg/cm2滅菌30分鐘，接種前加入CaC03(121°C，60分鐘滅菌，烘千)和氨芐青霉素。3、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/1)葡萄糖80.0,(NH4)2S0425,0，KH2P042.0，MgS047H201.0，MnS04'5H200.5，F(xiàn)eS04'7H200.5，CaC0330.0，加自來水溶解，調(diào)pH7.0-7.2，定容lOOOml，分裝至500ml搖瓶，0.8Kg/cm2滅菌30分鐘，接種前加入CaC03(12rC，60分鐘滅菌，烘千)4、種子罐培養(yǎng)基葡萄糖4%，(NH4)2S041%，KH2P040.1%，MgS04'7H200.05%，玉米漿0.2%，泡敵0.01%。加水溶解pH自然，12rC滅菌20分鐘，消后定容400L。接種前加入無菌氨芐青霉素50ug/L。5、發(fā)酵罐培養(yǎng)基葡萄糖8%，(NH4)2S042.5%，KH2PO40.2%，MgS04'7H200.1%，F(xiàn)eS04'5H200.05%，MnS04'5H200.05%，泡敵0.01%。加自來水溶解pH自然，12rC滅菌20分鐘，消后定容5.1M3。1.0Kg/cm2滅菌20分鐘。本發(fā)明方法中所使用的細(xì)菌是經(jīng)過下述改性的大腸桿菌(l)琥珀酰高絲氨酸合成酶和二氫吡啶二羧酸合成酶的細(xì)胞內(nèi)活性減弱；(2)蘇氨酸脫氨酶細(xì)胞內(nèi)活性降低；(3)天冬氨酸激酶，高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶，蘇氨酸合成酶和磷酸烯醇式丙酮酸激酶細(xì)胞內(nèi)活性增強(qiáng)；和/或(4)導(dǎo)入了來自透明顫菌的血紅蛋白基因。其中所述的高絲氨酸合成酶、二氫吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、天冬氨酸-P-半醛脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸激酶和蘇氨酸脫氨酶分別源于大腸桿菌。本發(fā)明的方法中，優(yōu)選的大腸桿菌優(yōu)選是具有上述所有改性的大腸桿菌；最優(yōu)選的大腸桿菌是基因工程菌(K21P3)。優(yōu)選的，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，該方法包括在在上述合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)過上述改性和導(dǎo)入血紅蛋白基因后得到的基因工程菌(K21P3)，在其培養(yǎng)基中產(chǎn)生和聚集L-蘇氨酸，并從中收集L-蘇氨酸。更優(yōu)選的，所述的培養(yǎng)在有氧條件下進(jìn)行3660小時(shí)；培養(yǎng)期間將溫度控制在37。C左右；pH值控制在68之間，可使用無機(jī)或有機(jī)酸或堿性物質(zhì)以及氧氣調(diào)節(jié)pH。應(yīng)用本發(fā)明的新的基因工程菌，可通過多種途徑優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)過程中L-蘇氨酸的生成和聚集，提高L-蘇氨酸的產(chǎn)量。除此之外，本發(fā)明的方法的還有以下有益效果1、原始菌株在經(jīng)過基因工程改造后，除在L-蘇氨酸代謝途徑上有少量變化之外，其它生理特征不變，因此不影響菌株的發(fā)酵。2、本發(fā)明的基因工程菌株的天冬氨酸激酶I不受蘇氨酸反饋抑制，因此在L-蘇氨酸合成過程中，細(xì)菌生長和L-蘇氨酸代謝不受影響。3、本發(fā)明的基因工程菌株為異亮氨酸缺陷菌株，異亮氨酸合成是以L-蘇氨酸合成為前體，因此，異亮氨酸缺陷可以使L-蘇氨酸大量累積。4、本發(fā)明的基因工程菌在一定濃度抗生素下正常生長，其中的質(zhì)粒保持穩(wěn)定。具體實(shí)施方式下面通過實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步地說明，但這些實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。其中涉及沒有說明單位的百分比濃度時(shí)，所述的濃度單位是指每100ml溶液中的溶質(zhì)克數(shù)。實(shí)施例1:高絲氨酸合成酶和二氫吡啶二羧酸合成酶弱化菌株的篩選用化學(xué)誘變劑硫酸二乙酯(DES)和甲酰胺處理經(jīng)過篩選的廣譜碳源大腸桿菌菌株(K16),獲得突變菌K16P1菌株。配置pH7.0的磷酸緩沖液100ml滅菌,將經(jīng)過篩選的廣譜碳源大腸桿菌菌種(K16)(本菌由本實(shí)驗(yàn)室保存)(該菌種是已知的，可由市場上買到)在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h，然后取濃度約為2.5乂108的培養(yǎng)菌液用生理鹽水離心洗滌兩次，用玻璃珠振蕩約20min，再用搖瓶機(jī)振蕩20min，使之均勻分散。菌液用磷酸緩沖液配制。誘變試劑用0.8%-1%(g/100ml)的硫酸二乙酯(DES)溶液5ml，配制方法是先加少量乙醇溶解，然后加入磷酸緩沖液混勻。甲酰胺試劑的濃度是70%，其制法與上述方法相似。取菌液和試劑溶液各2.5ml，37r搖瓶機(jī)振蕩30min，。處理后的菌液用2%Na2S203終止反應(yīng)，稀釋后涂布平皿，再用分離篩選用培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基如下葡萄糖150g/l,蛋白胨10g/l.(NH4)2S0435g/l,KH2PO41.0g/l,MgS04'7H200.5g/l,CaC0330g/l，pH7.0，獲得突變菌K16P1菌株。對該突變株進(jìn)行培養(yǎng)選育，并進(jìn)一步對它進(jìn)行紫外誘變吸取4-5ml菌懸液，放入平皿，皿內(nèi)菌液厚度不要超過2mm，將皿置于距燈管30cm下照射，磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速為100r/min，誘變時(shí)間5min，吸0.1ml照射后懸液加入肉汁胨平板，搖勻。培養(yǎng)組成型突變株的選育是將紫外線誘變后的菌株用兩種培養(yǎng)基，即肉汁胨培養(yǎng)基和含桔皮粉的篩選用培養(yǎng)基交替培養(yǎng)的方法，反復(fù)交換培養(yǎng)3次，從群體中選育組成型突變株。由此可獲得選育后菌株K16P2。將所獲得的菌株K16P2在上述液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，按所述培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)，將未誘變處理的菌株K16也在同樣的培養(yǎng)基中作為對照培養(yǎng)，積累L-蘇氨酸，按照常規(guī)方法從培養(yǎng)基中收集蘇氨酸，并且比較大腸桿菌K16和K16P2菌株的L一蘇氨酸的產(chǎn)量。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例2:構(gòu)建大腸桿菌K16P3根據(jù)大腸桿菌的蘇氨基酸脫氫酶基因，設(shè)計(jì)下列PCR引物ILVAP1:5'—ATGGCTGACTCGCAACCCCTGTCCGGTGCTCCGGAAGGTGTCAGTGGAACTCCGTCG--3'(SEQIDNO:1)，ILVAP2:5'—CTAACCCGCCAAAAAGAACCTGAACGCCGGGTTATTGGTTTGTAAAACGTCCGAAGGCC—3，(SEQIDNO:2)其中ILVAP1.ILVAP2靠近5，端的區(qū)域與蘇氨酸脫氨酶基因的兩翼序列同源，ILVAP1,ILVAP2靠近3'端的區(qū)域與質(zhì)粒PKF3上Cat基因兩側(cè)序列互補(bǔ)，以質(zhì)粒PKF3(含有氯霉素抗性基因Cat基因)(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所惠贈(zèng),為已知菌，可從大連寶生物工程公司可以購買到)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件是94'C變性30s，55。C退火30s，72。C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，72°C，lOmin.,16。C，30min.。PCR擴(kuò)增出兩翼與蘇氨酸脫氨酶基因上下游序列同源，中間為氯霉素抗性基因的1.lkbDNA片段。挑取大腸桿菌K16P2/pKD46的單菌落，接種于新鮮LB培養(yǎng)基(含有終濃度為50ug/ml的氨芐青霉素)中，30'C振蕩過夜培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接于50mLLB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至A6。。=0.2-0.3。向培養(yǎng)基中加入L-阿拉伯糖，終濃度為lmmo1/1，繼續(xù)培養(yǎng)至A6。。=0.5-0.6。將菌液置于冰浴中15-20分鐘，于4。C，5000Xg離心IO分鐘。用經(jīng)過滅菌的10%甘油洗滌菌體3次，將菌體重懸于0.5mL10y。甘油中，制成感受態(tài)細(xì)胞。移取上述PCR產(chǎn)物5ul與感受態(tài)細(xì)胞100ul混合，電擊(電擊參數(shù)25pF，200，2.5kv)后加入lml預(yù)冷的LB培養(yǎng)基，3(TC培養(yǎng)1小時(shí)。移取200u1菌液涂布于含有氨芐青霉素(終濃度為50ug/ml)和氯霉素(終濃度為50ug/ml)的LB平板上，3(TC培養(yǎng)，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。上述經(jīng)PCR擴(kuò)增的DNA片段轉(zhuǎn)入大腸桿菌K16P2菌株后，在Red重組酶的作用下，DNA片段與染色體上的同源區(qū)域重組，敲除了蘇氨酸脫氨酶基因，得到蘇氨酸脫氨酶基因缺陷的陽性菌株K16P3。將上述獲得的重組大腸桿菌K16P3在上述培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)，將未將蘇氨酸脫氨酶基因敲除的菌株K16P2也在同樣的培養(yǎng)基中作為對照培養(yǎng)，積累L-蘇氨酸，從培養(yǎng)中收集L一蘇氨酸，并且比較大腸桿菌K16P3和K16P2的L—蘇氨酸的產(chǎn)量(表2)表2<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例3:構(gòu)建pTl質(zhì)粒構(gòu)建pTl質(zhì)粒，用于構(gòu)建質(zhì)粒載體。以pBR322質(zhì)粒(購自大連寶生物工程公司)為模板，用FP2(SEQIDN0:3)、RP2(SEQIDN0:4)為引物，及Pfu酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR的反應(yīng)條件94。C變性30s，55。C退火30s，72。C延伸3min，30個(gè)循環(huán)；72°C,10min)，獲得2583bp的基因片段。再以上述擴(kuò)增的片段為模板，用FP1(SEQIDNO:5)、RP1(SEQIDNO:6)為引物，及EXTaq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR的反應(yīng)條件94。C變性30s，55。C退火30s，72。C延伸3min，30個(gè)循環(huán)72°C，10min)，獲得2607bp的基因片段。將該2607bp的基因片段連到載體pGEM-T(購自大連寶生物工程公司)中，形成質(zhì)粒pGEM-TPLl。用EcoRI酶切pGEM-TPLl，回收2601bp片段，用T4DNA連接酶環(huán)化此片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,提取質(zhì)粒，獲得pTl質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有EcoRIKpnlBamHIHindIIINcollEcoRI酶切位點(diǎn)。實(shí)施例4:構(gòu)建大腸桿菌K17P3根據(jù)大腸桿菌天冬氨酸-0-半醛脫氫酶基因(asd)的己知核苷酸序列，設(shè)計(jì)并制備出兩種類型的寡核苷酸引物ASDF1(SQEIDN0:7)和ASDR1(SQEIDNO:8);ASDF2(SQEIDN0:9)和ASDR2(SQEIDNO:10)。以ASDF1、ASDR1為引物，以pGEMT-UPM質(zhì)粒(由本實(shí)驗(yàn)室保存。該質(zhì)粒是己知的，可由市場上買到。所述的pGEMT是己知載體，可在市場上買到；UPM是含有79個(gè)堿基的啟動(dòng)子)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR反應(yīng)條件94。C變性30s，55。C退火30s，72。C延伸lmin,30個(gè)循環(huán)72°C，10min.);以ASDF2、ASDR2為引物，用pfu酶對K型，即普通型大腸桿菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增(PCR反應(yīng)條件94。C變性30s,55。C退火30s，72。C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，72°C，lOmin.)。以上述兩種PCR產(chǎn)物各1u1為模板，以ASDF1、ASDR1為引物，用ExTaq酶進(jìn)行擴(kuò)增(PCR反應(yīng)條件94。C變性30s，55。C退火30s，72。C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，72。C，10min)，回收1195bp的擴(kuò)增片段，連接到載體pGEM-T中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，提取并純化質(zhì)粒。將該質(zhì)粒用BamHI酶切，并與同樣用BamHI酶切的pT1質(zhì)粒連接，獲得重組質(zhì)粒pT2。將所獲得的重組質(zhì)粒(是pT2)轉(zhuǎn)化實(shí)施例3中的大腸桿菌K16P3，獲得大腸桿菌K17P3。在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)(培養(yǎng)基胰化蛋白胨lg/100ml，酵母提取物0.5g/100ml，NaCllg/100ml，瓊脂1.5-2g/100ml。培養(yǎng)條件pH7.0，0.1Mpa20分鐘)，同時(shí)將未導(dǎo)入質(zhì)粒pT2的K16P3菌株也在同樣的培養(yǎng)基中作為對照培養(yǎng)，積累L-蘇氨酸，從培養(yǎng)物收集L-蘇氨酸，并且比較大腸桿菌K16P3和K17P3的L-蘇氨酸的產(chǎn)量(表3)。表3菌株L-蘇氨酸產(chǎn)量(g/dL)K16P31.6K17P3(asd)2.8大腸桿菌K17P3(asd)由于轉(zhuǎn)入了含有天冬氨酸-P-半醛脫氫酶基因(asd)的質(zhì)粒pT2，天冬氨酸-P-半醛脫氫酶基因在啟動(dòng)子的作用下進(jìn)行復(fù)制，增加了大腸桿菌中的天冬氨酸-e-半醛脫氫酶基因的拷貝數(shù)量，從而使L-蘇氨酸的產(chǎn)率得到提高。實(shí)施例5:構(gòu)建大腸桿菌K18P3按照與實(shí)施例l類似的方法，用化學(xué)誘變劑硫酸二乙酯(DES)和甲酰胺處理大腸桿菌菌株BL1126(該菌種是已知的，可由市場上買到。由本實(shí)驗(yàn)室保存。)，對突變株進(jìn)行培養(yǎng)選育，并進(jìn)一步對它進(jìn)行紫外誘變和組成型選育。配置pH7.0的磷酸緩沖液100ml滅菌，將經(jīng)過篩選的廣譜碳源大腸17桿菌菌種(K16)(本菌由本實(shí)驗(yàn)室保存)在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h，然后取濃度約為2.5乂108的培養(yǎng)菌液用生理鹽水離心洗滌兩次，用玻璃珠振蕩約20min，再用搖瓶機(jī)振蕩20min，使之均勻分散。菌液用磷酸緩沖液配制，誘變試劑用濃度為0.8%-1%的硫酸二乙酯(DES)溶液5ml，配制方法是先加少量乙醇溶解，然后加入磷酸緩沖液混勻。甲酰胺(70%)試劑的制法與此相似，取菌液和試劑溶液各2.5ml，37。C搖瓶機(jī)振蕩30min。處理后的菌液用2。/。Na2S203終止反應(yīng)，稀釋后涂布平皿，再在分離篩選用培養(yǎng)基中分離培養(yǎng)，使用如下的培養(yǎng)基葡萄糖150g/l,蛋白胨10g/L(NH4)2S0435g/l,KH2PO41.0g/l,MgS04*7H200.5g/l,CaC0330g/l.PH7.0))，獲得突變菌K16P1菌株。對突變株進(jìn)行培養(yǎng)選育，并進(jìn)一步對它進(jìn)行紫外誘變，吸取4-5ml菌懸液，放入平皿，皿內(nèi)菌液厚度不要超過2mm，將皿置于距燈管30cm下照射，磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速為100r/min，誘變時(shí)間5min，吸O.lml照射后懸液加入肉汁胨平板，搖勻。培養(yǎng)組成型突變株的選育是將紫外線誘變后的菌株用兩種培養(yǎng)基，即肉汁胨培養(yǎng)基和含桔皮粉的篩選用培養(yǎng)基交替培養(yǎng)的方法,反復(fù)交換培養(yǎng)3次，從群體中選育組成型突變株，篩選積累蘇氨酸產(chǎn)量多或?qū)μK氨酸不敏感的天冬氨酸激酶I的菌株。經(jīng)過篩選，獲得突變菌株BL1126P，該菌種具有對蘇氨酸不敏感的天冬氨酸激酶I(該菌種的保藏號(hào)為CGMCCNo:2369，保存日期2008年1月28曰)。根據(jù)大腸桿菌蘇氨酸操縱子的已知核苷酸序列，設(shè)計(jì)并制備出兩種類型的寡核苷酸引物THRF1(SQEIDNO:11)、THRR1(SQEIDNO:12);T服F2(SQEIDNO:13)、THRR2(SQEIDNO:14)。以THRF1、THRR1為引物，以pGEMT-UPM質(zhì)粒(由本實(shí)驗(yàn)室保存。pGEMT是已知載體，在市場上可以購買；UPM是含有79個(gè)堿基的啟動(dòng)子)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR反應(yīng)條件94X:變性30s，55。C退火30s，72。C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，72°C，10min);以THRF2、THRR2為引物，以上述大腸桿菌BL1126P的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增(PCR反應(yīng)條件94。C變性30s，55'C退火30s，72'C延伸3min，30個(gè)循環(huán)，72°C，10min)。以上述兩個(gè)PCR產(chǎn)物各1u1為模板，以THRF1、THRR1為引物，用ExTaq進(jìn)行擴(kuò)增(PCR反應(yīng)條件94°C變性30s，55。C退火30s，72。C延伸5min，30個(gè)循環(huán)，72°C，10min)。回收4775bp的擴(kuò)增片段，連接到載體pGEM-T(購自大連寶生物工程公司)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a并提取和純化所獲得的質(zhì)粒。將所獲得的質(zhì)粒用HindIII酶切，并與同樣用HindlII酶切的pT2質(zhì)粒連接，獲得重組質(zhì)粒pT3(其中含有對蘇氨酸不敏感的天冬氨酸激酶I)。將所獲得的重組質(zhì)粒pT3轉(zhuǎn)化實(shí)施例4中的大腸桿菌K17P3，得到大腸桿菌K18P3。在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)(胰化蛋白胨lg/100ml，酵母提取物0.5g/100ml，NaCllg/100ml，瓊脂1.5-2g/100ml。條件pH7.0，0.1Mpa20分鐘)，同時(shí)將未導(dǎo)入質(zhì)粒pT3的大腸桿菌K17P3菌株和實(shí)施例3中的K16P3菌株也在同樣的培養(yǎng)基中作為對照培養(yǎng)，積累L-蘇氨酸，從培養(yǎng)物中收集L-蘇氨酸，并且比較大腸桿菌K16P3、K17P3和K18P3的L-蘇氨酸的產(chǎn)量(表4)。表4菌株L-蘇氨酸產(chǎn)量(g/dL)K16P31.6K17P3(asd)2.8K18P3(asdThrA*+thrB+ThrC)3.3大腸桿菌K18P3(asdThrA*+thrB+ThrC)由于轉(zhuǎn)入了質(zhì)粒pT3，而質(zhì)粒pT3上連接了天冬氨酸-P-半醛脫氫酶基因(asd)和對L-蘇氨酸不敏感的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I基因(ThrAO、高絲氨酸激酶基因(ThrB)和蘇氨酸合成酶基因(ThrC)。因此，通過pT3質(zhì)粒的復(fù)制，天冬氨酸-0-半醛脫氫酶基因和對L-蘇氨酸不敏感的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I基因、高絲氨酸激酶基因和蘇氨酸合成酶基因得到增強(qiáng)，拷貝數(shù)量增加，從而而使L-蘇氨酸的產(chǎn)率得到提高。實(shí)施例6:構(gòu)建大腸桿菌K19P3按照與實(shí)施例l類似地方法，用化學(xué)誘變劑硫酸二乙酯(DES)和甲酰胺處理大腸桿菌菌株BL2125((該菌種是已知的，可由市場上買到，由本實(shí)驗(yàn)室保存)，對突變株進(jìn)行培養(yǎng)選育并進(jìn)一步對它進(jìn)行紫外誘變和組成型選育。19配置pH7.0的磷酸緩沖液100ml滅菌，將經(jīng)過篩選的廣譜碳源大腸桿菌菌種(K16)(本菌由本實(shí)驗(yàn)室保存)在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h，然后取濃度約為2.5X108的培養(yǎng)菌液用生理鹽水離心洗滌兩次，用玻璃珠振蕩約20min，再用搖瓶機(jī)振蕩20min，使之均勻分散。菌液用磷酸緩沖液配制，誘變試劑用0.8%-1%(g/100ml)硫酸二乙酯(DES)溶液5ml，先加少量乙醇溶解，然后加入磷酸緩沖液混勻。甲酰胺試劑70%的制法與此相似，取菌液和試劑溶液各2.5ml，37'C搖瓶機(jī)振蕩30min，處理后的菌液用2。/。Na2S203終止反應(yīng)，稀釋后涂布平皿，再在分離篩選用培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，使用下述培養(yǎng)基葡萄糖150g/1，蛋白胨10g/l.(NH4)2S0435g/l,KH2PO41.0g/l，MgS047H200.5g/l,CaC0330g/l.PH7.0)，獲得突變菌K16P1菌株，并進(jìn)一步對它進(jìn)行紫外誘變，吸取4-5ml菌懸液，放入平皿，皿內(nèi)菌液厚度不要超過2mm，將皿置于距燈管30cm下照射，磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速為100r/min，誘變時(shí)間5min，吸0.1ml照射后懸液加入肉汁胨平板，搖勻。培養(yǎng)組成型突變株的選育是將紫外線誘變后的菌株用兩種培養(yǎng)基，即肉汁胨培養(yǎng)基和含桔皮粉的篩選用培養(yǎng)基交替培養(yǎng)的方法，反復(fù)交換培養(yǎng)3次，從群體中選育組成型突變株，篩選積累賴氨酸產(chǎn)量多或?qū)嚢彼岵幻舾械奶於彼峒っ窱II的菌株，獲得突變得大腸桿菌BL2125P(對賴氨酸不敏感的天冬氨酸激酶III的菌株)，該菌種的保藏號(hào)是CGMCCNo:2367保存日期2008年1月28日。根據(jù)對L-賴氨酸不敏感的天冬氨酸激酶III基因(lysC*)的已知核苷酸序列，設(shè)計(jì)并制備出兩種類型的寡核苷酸引物L(fēng)YSCF1(SQEIDN0:15)和LYSCR1(SQEIDNO:16);LYSCF2(SQEIDNO:17)和LYSCR2(SQEIDN0:18)。以LYSCF1、LYSCR1為引物，以pGEMT-UPM質(zhì)粒(含有79堿基的啟動(dòng)子UPM)(由本實(shí)驗(yàn)室保存，pGEMT是已知載體，在市場上可以購買；UPM是含有79個(gè)堿基的啟動(dòng)子.)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR反應(yīng)條件94。C變性30s,55。C退火30s，72。C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，72。C，10min);以LYSCF2、LYSCR2為引物，以上述對賴氨酸不敏感的大腸桿菌BL2125P的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR反應(yīng)條件94。C變性30s，55。C退火30s，72。C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，72°C，10min)，議上述兩種PCR產(chǎn)物各1n1為模板，以LYSCF1、LYSCR1為引物，用ExTaq進(jìn)行PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增條件94。C變性30s，55X:退火30s，72'C延伸2min，30個(gè)循環(huán)，72°C，10min)?；厥?441bp擴(kuò)增片段，連接到載體pGEM-T(該質(zhì)粒購自大連寶生物工程公司)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，提取并純化質(zhì)粒。將所獲得的質(zhì)粒用Ncol1酶切，并與同樣用NcolI酶切的pT3質(zhì)粒連接，獲得重組質(zhì)粒pT4。將所獲得的重組質(zhì)粒pT4轉(zhuǎn)化實(shí)施例5中的大腸桿菌K18P3，得到K19P3菌株。在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)(胰化蛋白胨lg/100ml，酵母提取物0.5g/100ml，NaCllg/訓(xùn)ml，瓊脂1.5-2g/100ml。條件pH7.0，0.1Mpa20分鐘)，同時(shí)將未導(dǎo)入pT4的大腸桿菌K18P3、K16P3和K17P3也在同樣的培養(yǎng)基中作為對照培養(yǎng)，積累L-蘇氨酸，從培養(yǎng)物中收集L-蘇氨酸，并且比較它們的L-蘇氨酸的產(chǎn)量(表5)表5菌株_L-蘇氨酸產(chǎn)量(g/dL)K16P31.6K17P3(asd)2.8K18P3(asdThrA*+thrB+ThrC)3.3K19P3(asdThrA*+thrB+ThrClys(T)3.9大腸桿菌K19P3(asdThrA'+thrB+ThrClys(T)由于轉(zhuǎn)入了質(zhì)粒pT4，而質(zhì)粒pT4上連接了天冬氨酸-0-半醛脫氫酶基因(asd)、對L-蘇氨酸不敏感的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I基因(ThrA"、高絲氨酸激酶基因(ThrB)、蘇氨酸合成酶基因(ThrC)以及對L-賴氨酸不敏感天冬氨酸激酶III基因(lys(T)。因此，通過pT4質(zhì)粒的復(fù)制，天冬氨酸-P-半醛脫氫酶基因、對L-蘇氨酸不敏感的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I基因、高絲氨酸激酶基因、蘇氨酸合成酶基因以及對L-賴氨酸不敏感天冬氨酸激酶m基因得到增強(qiáng)，基因的拷貝數(shù)量增加，從而使L-蘇氨酸的產(chǎn)率得到提高。實(shí)施例7:制備大腸桿菌K20P3根據(jù)大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因(ppc)的已知核苷酸序列，設(shè)計(jì)并制備出兩種類型的寡核苷酸引物PCKF1(SQEIDN0:19)和PCKR1(SQEIDN0:20);PCKF2(SQEIDNO:21)和PCKR2(SQEIDN0:22)。以PCKF1和PCKR1為引物，以pGEMT-UPM質(zhì)粒(含有79堿基的啟動(dòng)子UPM)(由本實(shí)驗(yàn)室保存pGEMT是已知載體，在市場上可以購買；UPM是含有79個(gè)堿基的啟動(dòng)子.)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR擴(kuò)增條件94t:變性30s，55。C退火30s，72。C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，72°C，10min);以PCKF2和PCKR2為引物，以普通大腸桿菌BW3110DNAA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(反應(yīng)條件94。C變性30s，50。C退火30s，72。C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，72°C，10min)。以上述兩種PCR產(chǎn)物各1u1為模板，以PCKF1和PCKR1為引物，用ExTaq進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR反應(yīng)條件94。C變性30s，55。C退火30s，72。C延伸2minl0s，30個(gè)循環(huán)，72°C，10min)?；厥?714bp的擴(kuò)增片段，連接到載體pGEM-T(該質(zhì)粒購自大連寶生物工程公司)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5cx，提取并純化質(zhì)粒。對所獲的質(zhì)粒用EcoRI酶切，并與同樣用EcoRI酶切的pT4質(zhì)粒連接，獲得重組質(zhì)粒pT5。將所獲得的重組質(zhì)粒pT5轉(zhuǎn)化實(shí)施例6中的大腸桿菌K19P3，得到K20P3菌株。在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)(胰化蛋白胨lg/100ml，酵母提取物0.5g/100ml，NaCllg/100ml，瓊脂1.5-2g/100ml。條件pH7.0，0.1Mpa，20分鐘)，同時(shí)將未導(dǎo)入pT5的K19P3、K16P3、K17P3和K18P3菌株也在同樣的培養(yǎng)基中作為對照培養(yǎng)，積累L-蘇氨酸，從培養(yǎng)物中收集L-蘇氨酸，并比較L-蘇氨酸的產(chǎn)量(表6)。表6菌株L-蘇氨酸產(chǎn)量(g/dL)K16P31.6K17P3(asd)2.8K18P3(asdThrA、thrB+ThrC)3.3K19P3(asdThrA*+thrB+ThrClysC*)3.9K20P3(asdThrA*+thrB+ThrClysC'ppc)4.3大腸桿菌K20P3(asdThrA*+thrB+ThrClys(Tppc)由于轉(zhuǎn)入了質(zhì)粒pT5，而質(zhì)粒pT5上連接了天冬氨酸-e-半醛脫氫酶基因(asd)、對L-蘇氨酸不敏感的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I基因(ThrAO+高絲氨酸激酶基因(ThrB)、蘇氨酸合成酶基因(ThrC)、對L-賴氨酸不敏感天冬氨酸激酶III基因(lysCT)和大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因(ppc)，通過質(zhì)粒pT5的復(fù)制，天冬氨酸-e-半醛脫氫酶基因、對L-蘇氨酸不敏感的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I基因、高絲氨酸激酶基因、蘇氨酸合成酶基因、對L-賴氨酸不敏感天冬氨酸激酶III基因和大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因得到增強(qiáng)，基因的拷貝數(shù)量增加，從而使L-蘇氨酸的產(chǎn)率得到提高。實(shí)施例8:制備大腸桿菌K21P3根據(jù)對透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)的已知核苷酸序列，設(shè)計(jì)并制備出兩種類型的寡核苷酸引物VGBF1(SQEIDNO:23)和VGBRl(SQEIDNO:24);VGBF2(SQEIDNO:25)和VGBR2(SQEIDNO:26)。以VGBF1和VGBRl為引物，以pGEMT-UPM質(zhì)粒(含有79堿基的啟動(dòng)子UPM)(質(zhì)粒的來源)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR反應(yīng)條件94"C變性30s,55X:退火30s，72。C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)72°C,lOmin.);以VGBF2和VGBR2為引物，用pfu酶對透明顫菌DNA(該菌種是已知的，由北京大學(xué)農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR反應(yīng)條件94。C變性30s，55。C退火30s，72。C延伸2minl0s，30個(gè)循環(huán)，72°C，10min，在16。C保溫)。以上述兩個(gè)PCR產(chǎn)物各1ul為模板，以VGBF1、VGBR1為引物，用ExTaq進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR反應(yīng)條件:94。C變性30s，55。C退火30s，72。C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，72°C，10min，在16。C保溫)。回收532bp的擴(kuò)增片段，連接到載體pEGM-T(購自大連寶生物工程公司)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ct,提取并純化質(zhì)粒。對所獲得質(zhì)粒用Kpnl酶切，并與同樣用Kpnl酶切的pT5質(zhì)粒連接，獲得重組質(zhì)粒pT6。將所獲得的重組質(zhì)粒pT6轉(zhuǎn)化大腸桿菌K20P3(本實(shí)驗(yàn)室保存，參見實(shí)施例7)，獲得K21P3菌株。在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)(胰化蛋白胨lg/100ml，酵母提取物0.5g/100ml，NaCllg/100ml，瓊脂1.5-2g/100ml。培養(yǎng)條件pH7.0，0.1Mpa20分鐘)，同時(shí)未導(dǎo)入質(zhì)粒pT6的K20P3、K16P3、K17P3、K18P3和K19P3菌株也在同樣的培養(yǎng)基中作為對照培養(yǎng)，積累L-蘇氨酸，從培養(yǎng)物中收集L-蘇氨酸，并比較它們的L-蘇氨酸的產(chǎn)量(表7)。23表7菌株__L-蘇氨酸產(chǎn)量(g/dL)K16P31.6K17P3(asd)2.8K18P3(asdThrA*+thrB+ThrC)3.3K19P3(asdThrA*+thrB+ThrClysC*)3.9K20P3(asdThrA*+thrB+ThrClysCTppc)4.3K21P3(asdThrA*+thrB+ThrClysC*ppcvgb)_4.9大腸桿菌K21P3(asdThrA*+thrB+ThrClysC*ppcvgb)由于轉(zhuǎn)入了質(zhì)粒pT6，而質(zhì)粒pT6連接了天冬氨酸-e-半醛脫氫酶基因(asd)、對L-蘇氨酸不敏感的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I基因(ThrAO、高絲氨酸激酶基因(ThrB)、蘇氨酸合成酶基因(ThrC)、對L-賴氨酸不敏感天冬氨酸激酶III基因(lysC*)、大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因(卯c)和透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)。通過質(zhì)粒pT6的復(fù)制，天冬氨酸-e-半醛脫氫酶基因、對L-蘇氨酸不敏感的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I基因、高絲氨酸激酶基因+蘇氨酸合成酶基因、對L-賴氨酸不敏感天冬氨酸激酶III基因、大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因和透明顫菌血紅蛋白基因得到增強(qiáng)，基因的拷貝數(shù)量增加，從而使L-蘇氨酸的產(chǎn)率得到提高。通過上述具體的實(shí)施例，更容易理解本發(fā)明。上述實(shí)施例只是舉例描述，而不以任何形式限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表〈110>申請人長春大成實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司<120>應(yīng)用發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法〈160>26〈170>PatentInVersion3.0〈210>1<211>57<212〉腿-〈213〉人工序列<400>1atggctgactcgcaacccctgtccggtgctccggaaggtgtcagtggaactccgtcg57<210>2<211>59〈212>■〈213〉人工序列〈400〉2ctaacccgccaaaaagaacctgaacgccgggttattggtttgtaaaacgtccgaaggcc59〈210>3<211>32〈212〉廳〈213〉人工序列〈400〉3gaattcggtacctctagagagctccggaagtc32〈210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列25〈400>4tctagagagctccggaagtcagcgccctgcac32<210>5<211><212>DNA<213〉人工序列〈400>5gaattcccatggaagcttggatccaaccctgat33<210>6<211>40<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉6aagcttggatccaaccctgataaatgcttcaataatattg40<210〉7〈211>28〈212〉腿<213>人工序列<400>7ggatcctcactcattaggcaccccaggc28<210>8〈211>31〈212>廳<213>人工序列<400>8catttttcatatgtatatctccttagtacat31<210>9<211〉31〈212〉廳〈213>人工序列<400>9gagatatacatatgaaaaatgttggttttat31<210>10<211>28〈212>■<213>人工序列<400>10gga/tccttacgccagttgacgaagcatc28〈210〉11〈211>28<212>腿<213>人工序列<400>11aagctttcactcattaggcaccccaggc28<210>12<211>31<212>腿〈213〉人工序列<400>12acactcgcatatgtatatctccttagtacat31〈210>13<211〉31<212>DNA<213>人工序列g(shù)agatatacatatgcgagtgttgaagttcgg31<210>14〈211>28〈212〉廳<213>人工序列<400>14aagcttttactgatgattcatcatcaat28<210>15<211>28<212>■〈213>人工序列<柳>15tctagatcactcattaggcaccccaggc28<210>16〈211>31〈212〉DNA<213>人工序列<400>16tttcagacatatgtatatctccttagtacat31<210>17<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>17gagatatacatatgtctgaaattgttgtctc31<210>18<211>28<212〉DNA<213>人工序列<400>18tctagattactcaaacaaattactatgc28<210>19<211>28<212>DNA〈213>人工序列<400>19ggtacctcactcattaggcaccccaggc28<210>20<211>31〈212>DNA〈213>人工序列<400>20t肌cgcgcatatgtatatctccttagtacat31<210>21<211>31<212>謹(jǐn)<213>人工序列<400>21gagatatacatatgcgcgttaacaatggttt31<210>22〈211〉28<212〉腿<213>人工序列<400>22ggtaccttacagtttcggaccagccgct28<210〉23<211>28〈212〉腿<213>人工序列〈400〉23gaattctcactcattaggcaccccaggc28<210>24<211>31<212>腿<213〉人工序列<400〉24ggtctaacatatgtatatctccttagtacat31〈210〉25〈211>31<212>薩<213>人工序列<400>25gagatatacatatgttagaccaacaaaccgt31<210〉26<211>28<212〉醒<213>人工序列<400>26gaattcttattcagcgtcttgagcgtac2830權(quán)利要求1、一種大腸桿菌變體，其中琥珀酰高絲氨酸合成酶和二氫吡啶二羧酸合成酶的細(xì)胞內(nèi)活性降低。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的大腸桿菌變體，其中所述的細(xì)胞內(nèi)活性降低是通過化學(xué)誘變和紫外誘變完成的；其中經(jīng)過所述化學(xué)和紫外誘變后，琥珀酰高絲氨酸合成酶的突變包括脯氨酸取代第61位的絲氨酸，絲氨酸取代第107位的甘氨酸，組氨酸取代第165位的絲氨酸；二氫吡啶二羧酸合成酶的突變包括丙氨酸取代第44位的蘇氨酸，賴氨酸取代第55位的谷氨酸，和組氨酸取代第65位的天冬氨酸；經(jīng)過上述誘變所得到的是大腸桿菌K16P2株。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的大腸桿菌變體，其中還包括蘇氨酸脫氨酶的細(xì)胞內(nèi)活性降低，所述的蘇氨酸脫氨酶的細(xì)胞內(nèi)活性降低是通過Red同源重組技術(shù)敲除蘇氨酸脫氨酶基因完成的。4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的大腸桿菌變體，其中還包括天冬氨酸激酶的細(xì)胞內(nèi)活性增強(qiáng)，其中所述的天冬氨酸激酶的細(xì)胞內(nèi)活性增強(qiáng)通過下述方法實(shí)現(xiàn)改造與蘇氨酸結(jié)合的位點(diǎn)，去除L-蘇氨酸對天冬氨酸激酶I的反饋抑制作用和通過改造與賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)去除L-賴氨酸對天冬氨酸激酶III的反饋抑制作用；優(yōu)選的，其中所述去除L-蘇氨酸對天冬氨酸激酶I(AKI)反饋抑制作用的突變包括用另一種氨基酸取代109位上的絲氨酸，用另一種氨基取代163位上的絲氨酸；或者，其中用甘氨酸取代109位上絲氨酸；用丙氨酸取代163位上的絲氨酸。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的大腸桿菌變體，其是大腸桿菌BL1126P，該菌種的保藏號(hào)為CGMCCNo:2369。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的大腸桿菌變體，其中所述去除L-賴氨酸對天冬氨酸激酶III(AKIII)的反饋抑制作用的突變包括用另一種氨基酸取代330位上的甘氨酸，用另一種氨基酸取代400位上的半胱氨酸，用另一種氨基酸取代403位上的甘氨酸；或者，用天冬氨酸取代330位上的甘氨酸，用甘氨酸取代400位上的半胱氨酸，用天冬氨酸取代403位上的甘氨酸。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的大腸桿菌變體，其是大腸桿菌BL2125P，該菌種的保藏號(hào)為CGMCCNo:2367。8、根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的大腸桿菌變體，其中進(jìn)一步包括天冬氨酸-(3-半醛脫氫酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶和/或磷酸烯醇式丙酮酸激酶中的至少一種酶的細(xì)胞內(nèi)活性增強(qiáng)，優(yōu)選的，其中所述細(xì)胞內(nèi)酶活性的增強(qiáng)是通過增加質(zhì)粒表達(dá)量而提高其細(xì)胞內(nèi)活性。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的大腸桿菌變體，其中進(jìn)一步包括導(dǎo)入了血紅蛋白基因；優(yōu)選的，其中所述的血紅蛋白基因來源于透明顫菌的血紅蛋白基因；且所形成的大腸桿菌變體是基因工程菌K21P3。10、一種生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，該方法包括在在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求l-19中任意一項(xiàng)所述的大腸桿菌變體，在其培養(yǎng)基中產(chǎn)生和聚集L-蘇氨酸，并從中收集L-蘇氨酸；其中所述的細(xì)菌是經(jīng)過下述改性的大腸桿菌(l)琥珀酰高絲氨酸合成酶和二氫吡啶二羧酸合成酶的細(xì)胞內(nèi)活性減弱；(2)蘇氨酸脫氨酶細(xì)胞內(nèi)活性降低；(3)天冬氨酸-P-半醛脫氫酶、天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶和磷酸烯醇式丙酮酸激酶細(xì)胞內(nèi)活性增強(qiáng)；和/或(4)導(dǎo)入了來自透明顫菌的血紅蛋白基因；其中所述的高絲氨酸合成酶、二氫吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、天冬氨酸-P-半醛脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸激酶和蘇氨酸脫氨酶分別源于大腸桿菌；優(yōu)選的，其中所述的大腸桿菌變體是基因工程菌K21P3;更優(yōu)選的，其中所述的培養(yǎng)在有氧條件下進(jìn)行3660時(shí)；培養(yǎng)期間的溫度控制在37'C左右；pH值控制在68之間；并可使用無機(jī)或有機(jī)酸或堿性物質(zhì)以及氧氣調(diào)節(jié)pH值。專利摘要本發(fā)明提供一種大腸桿菌變體，其是經(jīng)過下述改性的大腸桿菌(1)琥珀酰高絲氨酸合成酶和二氫吡啶二羧酸合成酶的細(xì)胞內(nèi)活性減弱；(2)蘇氨酸脫氨酶的細(xì)胞內(nèi)活性降低；(3)天冬氨酸激酶、天冬氨酸-β-半醛脫氫酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的細(xì)胞內(nèi)活性增強(qiáng)；(4)導(dǎo)入了來自透明顫菌的血紅蛋白基因。其中所述的高絲氨酸合成酶、二氫吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、天冬氨酸-β-半醛脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸激酶和蘇氨酸脫氨酶分別源于大腸桿菌。本發(fā)明也提供一種發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述大腸桿菌變體，積累L-蘇氨酸，然后從培養(yǎng)基中收集L-蘇氨酸。文檔編號(hào)C12P13/00GKCN101580813SQ200810097374公開日2009年11月18日申請日期2008年5月12日發(fā)明者楊傳波,王德輝,賈冬舒申請人:長春大成實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan