專利名稱:生產(chǎn)l-谷氨酸的細菌和生產(chǎn)l-谷氨酸的方法
生產(chǎn)L-谷氨酸的細菌和生產(chǎn)L-谷氨酸的方法技術領域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)L-谷氨酸的微生物和用該微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨 酸的方法。其中，該微生物是一種具有生產(chǎn)L-谷氨酸能力的棒桿菌屬細菌。 具體的說，該微生物是谷氨酸棒桿菌。
背景技術：
L-谷氨酸是可作為食物、藥物和諸如此類的重要氨基酸。生產(chǎn)L-谷氨酸的常規(guī)方法是利用所謂的生產(chǎn)L-谷氨酸的棒狀細菌及其 突變體通過發(fā)酵方法產(chǎn)生，該細菌原則上屬于短桿菌屬(5rew7^"eh腿)、 棒桿菌屬(Car"e6sc力eri咖)和微桿菌屬d'cro^g"eh鵬)的細菌及其 突變體(參見 Amino acid fermentation, Gakkai sh叩pan center, 卯195-215， 1986)。發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸的其他公知的方法包括利用芽孢桿菌、 鏈霉菌、青霉菌和諸如此類的微生物的方法(美國專利號3， 220， 929)，利 用假單孢菌、節(jié)桿菌、沙雷伯氏菌、念珠菌屬和諸如此類的微生物的方法(美 國專利號3， 563， 857)，利用芽孢桿菌、假單孢菌、沙雷伯氏菌和諸如此類 的微生物的方法(日本專利公開號(K0K0KU)， 32-9393 (1957))等。雖然通過前面所述培育這樣的微生物或改善的生產(chǎn)方法已經(jīng)相當大地 提高L-谷氨酸的生產(chǎn)率，但是仍然需要開發(fā)更為有效、更廉價的L-谷氨酸 的生產(chǎn)方法，以便滿足將來對氨基酸的明顯增長的需求。為了達到上述目的，本發(fā)明的研究人員進行了不懈的努力和大量的重復 研究。結果，本研究人員發(fā)現(xiàn)，在特定的谷氨酸棒桿菌(CbiT/7e/^^eh腿 W〃ta/z7i—c"歷)中，如果使谷氨酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸羧化酶、 硫辛酸乙酰轉移酶中的至少一種酶的活性增強，和/或使異檸檬酸裂解酶、 蘋果酸合成酶和硫辛酸琥珀酰轉移酶中至少一種酶的活性減弱，所述細菌的 L-谷氨酸產(chǎn)量可以提高，并且，依據(jù)這些發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。L-谷氨酸生產(chǎn)能力，并提供一種 更有效、成本更低的生產(chǎn)L-谷氨酸的方法。本發(fā)明的目的之一是提供一種屬于棒桿菌屬(6b/T/7e/^"er^/歷)的微 生物，優(yōu)選地，該微生物是谷氨酸棒桿菌(6biT/7e^3"eri'"http://7^Ma/w'c"yT7)， 其具有生產(chǎn)L-谷氨酸的能力。具體地，在該棒桿菌屬微生物中導入了血紅蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin gene，簡寫為vgb)，使該微生物在合適的培養(yǎng)基中，提高氧傳 遞體系，增加氧傳遞量，從而增強L-谷氨酸的生產(chǎn)能力。其中，所述的血 紅蛋白基因來自透明顫菌(「^reoscih's spp.)。本發(fā)明的棒桿菌屬微生物進一步包括如下特征(1) 屬于棒桿菌屬并且具有生產(chǎn)L-谷氨酸的微生物，其中所述微生物中催化L-谷氨酸生物合成反應的酶的活性增強；(2) 根據(jù)上述(1)的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成反應的酶 選自谷氨酸脫氫酶(下面簡寫為gdh)、異檸檬酸脫氫酶(下面簡寫為aceK)、 丙酮酸羧化酶(下面簡寫為pycA)和硫辛酸乙酰轉移酶(下面簡寫為acoC)中 的至少一種；(3) 根據(jù)上述(2)的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成反應的酶是 gdh禾口 aceK;(4) 根據(jù)上述(2)的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成反應的酶是 gdh、 aceK、 pycA禾口 acoC四禾中；(5) 根據(jù)上述任意一種的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成途徑的 分支反應并產(chǎn)生不是L-谷氨酸的化合物的酶的活性降低或缺乏；(6) 根據(jù)上述(5)的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成途徑的分支 反應并產(chǎn)生不是L-谷氨酸的化合物的酶選自異檸檬酸裂解酶(下面簡寫為 IL)、蘋果酸合成酶(下面簡寫為MS)和硫辛酸琥珀酰轉移酶(下面簡寫為LS) 中的至少一種；(7) 根據(jù)上述(6)的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成途徑的分支 反應并產(chǎn)生不是L-谷氨酸的化合物的酶是IL;以及(8) 根據(jù)上述(6)的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成途徑的分支反應并產(chǎn)生不是L-谷氨酸的化合物的酶是IL、 MS和LS三者。本發(fā)明的另一目的是提供一種生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，該方法包括在谷 氨酸生產(chǎn)常用的液體培養(yǎng)基中培育本發(fā)明如上所述的任意一種微生物，以便 在該培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-谷氨酸，并從培養(yǎng)基中收集L-谷氨酸。本發(fā)明的微生物屬于棒桿菌屬，該細菌通過EM途徑完成糖代謝，在這 一途徑產(chǎn)生的丙酮酸在需氧的條件下進入TCA循環(huán)，通過gdh或谷氨酸合成 酶從TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物a -酮戊二酸生物合成L-谷氨酸。本發(fā)明的細菌屬于棒桿菌屬，利用細菌血紅蛋白基因表達來提高棒桿菌 屬基因工程菌的氧傳遞體系，增加氧傳遞量。由于基因工程菌中外源基因的表達，含有重組質(zhì)粒的細胞會需要更多的 氧，從而可能會改變細胞的能量代謝，而不利于細胞的生長(Khoravi， M， Ryanw， webter， D， A等等，質(zhì)粒，1990， 23: 138-143)。在大規(guī)模高密度 的發(fā)酵中，細胞大量生長造成溶解氧濃度急劇下降。因此，提高設備通氧條 件，使細胞處于有氧呼吸狀態(tài)，成為基因工程菌發(fā)酵中關鍵問題之一?，F(xiàn)有 的改進方法主要是提高攪拌速度，增加通氣量，加入助溶劑，提高氣液傳質(zhì) 系數(shù)等等，但效果有限，并且會大大增加生產(chǎn)成本。透明顫菌(W^eosci乃'a s/ a)是一種生長于貧氧環(huán)境中的專性好氧 革蘭氏陰性細菌，能誘導合成一種血紅蛋白一透明顫菌血紅蛋白 (Vitreoscilla hemoglobin, VHb)。該蛋白是一種氧結合蛋白，這種蛋白 的同源二聚體對氧的親和力與真核生物相近，有很高的氧解離常數(shù)，具有很 強的氧傳輸能力，尤其是它自身基因的啟動子在貧氧條件下能大量有效地啟 動該基因表達，可提高發(fā)酵液中氧的傳遞速度，從而促進細胞生長和蛋白質(zhì) 的合成。VHb在大腸桿菌的表達能增加電子傳遞數(shù)目，跨膜pH值和ATP合 成速率。在本發(fā)明的細菌中，由于導入了含有透明顫菌血紅蛋白基因(Vgb)的 pCDFDuet-2表達質(zhì)粒，利用Vgb基因的表達，提高了棒桿菌屬基因工程菌 中氧的傳遞效率，增加了氧傳遞量，從而促進了L-谷氨酸的生產(chǎn)。本發(fā)明的細菌是屬于棒桿菌屬，并且具有產(chǎn)生L-谷氨酸的能力的微生物。在本文使用的表述"具有產(chǎn)生L-谷氨酸的能力"指在培養(yǎng)過程中具有 在培養(yǎng)基中積累丄-谷氨酸的能力。產(chǎn)生L-谷氨酸的能力可以是具有類似于 野生型特性的能力，或通過育種授予的或添加的能力。屬于棒桿菌屬并且具有產(chǎn)生L-谷氨酸的能力的微生物的例子包括例如催化L-谷氨酸生物合成反 應的酶的活性增強了的這樣的微生物，和催化L-谷氨酸生物合成途徑的分 支反應并產(chǎn)生不是L-谷氨酸的化合物的酶的活性降低或缺乏了的微生物。 本發(fā)明所述的微生物可進一步包括催化L-谷氨酸生物合成反應的酶的活性 增強，和催化L-谷氨酸生物合成途徑的分支反應并且產(chǎn)生不是L-谷氨酸的 化合物的酶的活性降低或缺乏。作為催化L-谷氨酸生物合成反應的酶的例子，可以提到的是丙酮酸激 酶，gdh，谷氨酸合成酶，aceK，檸檬酸合成酶，磷酸甘油酸激酶，磷酸甘 油酸變位酶，pycA，磷酸果糖異構酶，己糖激酶，acoC和諸如此類。在這 些酶中，優(yōu)選地，選自gdh、 aceK、 pycA或acoC的中至少一種；更優(yōu)選地， 選自其中的兩種、三種或四種；作為本發(fā)明的微生物，在這些酶中，最優(yōu)選 地是，其中gdh和aceK的酶活性增加，或者所有四種酶gdh， aceK， pycA， acoC的活性都增加。這四種酶的活性是否增加了，以及活性增加的程度，可以通過細菌細胞 提取物或純化部分的酶活性測量，并且將它與野生型菌株或親本菌株比較即 可以確定。用于測定上述酶活性的方法是公知的，并且，本領域技術人員可 以方便準確地證實其細胞內(nèi)的酶活性是否增強。本發(fā)明的細菌是屬于棒桿菌屬，并且催化L-谷氨酸生物合成反應的酶的 活性增強，這種微生物可以作為變異體獲得，其中在編碼該酶的基因中已經(jīng) 產(chǎn)生突變，或通過利用上面提到的微生物作為起始親本菌株的遺傳重組菌株 獲得，下面對這些方法進行簡單的描述。重組質(zhì)粒的構建根據(jù)己知透明顫菌Vitreoscilla sp. CI基因組DNA序列， 設計引物，擴增完整Vgb基因，將完整的Vgb基因片段，與質(zhì)粒pCDFDuet-l 平末端相連接，構建含有Vgb基因的質(zhì)粒pCDFDuet-2。為了增強gdh， aceK， pycA， acoC的活性，例如，編碼gdh， aceK， pycA， acoC的基因可以克隆進入適當質(zhì)粒，可以利用得到的質(zhì)粒轉化作為寄主的前面提到的起始親本菌株，這可以增加編碼各個gdh基因，aceK基因，pycA 基因和acoC基因的拷貝數(shù)，結果，增強了gdh， aceK， pycA， acoC的活性。將選自gdh， aceK， pycA， acoC基因中的兩種或三種或四種以任何聯(lián)合， 導入前面提到的起始親本菌株，當導入三種或四種基因時，將這三種或四種 基因克隆進入一種質(zhì)粒，并且導入寄主，或者他們分別克隆進入一到兩種質(zhì) 粒，所述質(zhì)粒可以在同一寄主中存在，并且導入寄主中。對所用質(zhì)粒沒有特別限制，只要它能夠在所屬棒桿菌屬的微生物中自主 復制。質(zhì)粒的例子包括例如pUC18、 pUC19、 pBR322和諸如此類。除了這 些質(zhì)粒，也可以使用噬菌體DNA載體。通過例如，利用氯化鈣增強受體細胞對DNA的通透性的方法，或者諸如 此類的方法可以達到轉化，這些方法都是公知的(或可以參考J.薩姆布魯 克和D.W.拉塞爾，分子克隆實驗指南(第三版))。gdh， aceK， pycA和acoC的活性也可以通過存在于作為寄主的起始親 本菌株的染色體DNA上的gdh基因，aceK基因，pycA基因和acoC基因的多 個拷貝增強。為了在屬于棒桿菌屬的微生物的染色體中導入多個拷貝的gdh 基因，aceK基因，pycA基因和acoC基因，可以利用多個拷貝數(shù)的染色體 DNA上的序列如重復DNA，和存在于轉座因子末端的倒轉重復。可選擇地， 也可將多個拷貝的基因導入染色體DNA，方法是利用攜帶gdh基因，aceK基 因，pycA基因和acoC基因的轉座子的轉座。這些技術可以增加轉化體細胞 中的gdh基因，aceK基因，pycA基因和acoC基因的拷貝數(shù)，結果增強了 gdh基因，aceK基因，pycA基因和acoC基因的活性?？梢岳萌魏紊矬w作為用于增加拷貝數(shù)的gdh， aceK， pycA和acoC 基因的來源，只要生物體具有gdh， aceK， pycA和acoC的活性。在這些生 物體中，細菌，即原核生物，如那些屬于腸桿菌，克雷伯氏菌，泛菌，歐文 氏菌，沙雷伯氏菌，埃希氏菌，棒狀桿菌，短桿菌或芽孢桿菌屬的細菌是優(yōu) 選。作為特定的實例，可以提到大腸桿菌。從以上提到的這樣的微生物的染 色體DNA可以得到gdh基因，aceK基因，pycA基因和acoC基因。通過分離補充缺乏gdh， aceK， pycA或acoC活性的變異體菌株的營養(yǎng) 缺陷型的DNA片段，可以從前面提到的任何微生物的染色體DNA分別得到gdh基因，aceK基因，pycA基因和acoC基因?？蛇x擇地，因為已經(jīng)闡明了埃希氏菌或棒狀桿菌屬的細菌的這些基因的 核苷酸序列(基因，27巻，1984;微生物學，140巻，1994;生物化學， 22巻，1983;生物化學雜志，95巻，1984;分子遺傳學，218巻，1989; 分子微生物學，6巻，1992)，利用根據(jù)每個闡明的核苷酸序列合成的引物 和染色體DNA作為模板，通過PCR可以獲得這些基因。除了通過上面提到的基因擴增，通過增加gdh基因，aceK基因，pycA 基因和acoC基因的表達也可以增強gdh， aceK， pycA和acoC的活性。例如， 通過利用另一個強啟動子替代gdh， aceK， pycA或acoC基因的啟動子以增 強表達。這樣的強啟動子的例子包括，例如lac啟動子，tac啟動子，trp 啟動子，trc啟動子，入噬菌體PR啟動子和Pi.啟動子和諸如此類。啟動子 已經(jīng)被替代的gdh基因，aceK基因，pycA基因和acoC基因可以克隆進入質(zhì) 粒和導入寄主微生物，或利用重復DNA，倒轉重復，轉座子或諸如此類導入 寄主微生物的染色體DNA。通過利用另一個較強的啟動子替代染色體上的gdh基因，aceK基因， pycA基因和acoC基因的啟動子或在每個基因的編碼序列的上游插入強啟動 子，也可以增強gdh， aceK， pycA和acoC的活性。特定地說，通過在gdh 基因，aceK基因，pycA基因和acoC基因(這些基因的啟動子用強啟動子替 代)或含有它們的一部分的DNA和染色體上對應的基因之間的同源重組可以 達到。屬于棒桿菌屬的微生物的特定例子包括，例如，谷氨酸棒桿菌，其中 gdh， aceK， pycA或acoC的活性增強。催化L-谷氨酸生物合成途徑的分支反應并產(chǎn)生不是L-谷氨酸的化合 物的酶的例子包括例如，a-酮戊二酸脫氫酶，IL，磷酸乙酰轉移酶，乙酸 激酶，乙酰羥酸合成酶，MS，乙酰乳酸合成酶，甲酸乙酰轉移酶，乳酸脫氫 酶，L-谷氨酸脫羧酶，LS和諸如此類.在這些酶中間，MS， IL， LS是優(yōu)選 的。為了在屬于棒桿茵屬的微生物中獲得上面提到的酶活性的下降和缺乏， 可以通過常規(guī)誘變技術和低能離子注入誘變技術，或遺傳工程技術在編碼該酶的基因中導入引起酶活性的下降或缺乏的突變。誘變技術的實例包括例如，利用低能離子注入誘變的方法，離子束作為 一種新的誘變源在誘變育種方面因其獨特的誘變機理和生物效應而發(fā)展極 為迅速。與傳統(tǒng)誘變源相比，離子注入除了具有能量沉積效應外，還有動能 傳遞，質(zhì)量沉積及電荷的中和與交換效應，它將物理誘變和化學誘變特性集 于一身，能夠在低劑量注入，細胞損傷較輕的情況下，誘發(fā)強烈地影響生物 細胞的生理、生化性能，改造遺傳物質(zhì)的基本單位——堿基的改變，誘發(fā)染 色體結構的變異。所用的低能離子為20keV的N+離子，以15X10M N7cii^為 最佳處理劑量。誘變技術的實例包括例如，利用x-射線或紫外光輻射的方法，或者利 用誘變試劑如N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍和諸如此類處理的方法。導入突 變的基因的位置可以是編碼酶蛋白的編碼區(qū)或如啟動子的表達調(diào)節(jié)區(qū)。遺傳工程技術的實例包括，例如遺傳重組，遺傳轉導，細胞融合和諸如 此類.例如，在靶基因中插入藥物抗性基因以便產(chǎn)生功能失活的基因(缺陷 基因)。然后，這一缺陷基因可以導入屬于棒桿菌屬的微生物的細胞，并且 在染色體上的靶基因可以用缺陷基因通過同源重組替代(基因破壞)。通過測量候選菌株的細茵細胞提取物或純化部分的酶活性，并且將它與 野生型菌株或親本茼株的比較可以確定是否微生物降低了靶酶的活性或缺 乏該活性，以及該酶活性的降低程度。用于測定上述酶活性的方法是公知的， 并且，本領域技術人員可以方便準確地證實其活性減弱。根據(jù)靶酶，可以在變異體的表現(xiàn)型的基礎上選擇靶變異體。例如在含 有葡萄耱的基本培養(yǎng)基或含有乙酸或L-谷氨酸作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基 上缺乏MS， IL和LS活性或降低該活性的變異體不能生長，或顯示了明顯的 在需氧條件下生長速率降低。但是，甚至在同樣條件下，通過在含有葡萄糖 的基本培養(yǎng)基中加入琥珀酸或賴氨酸，甲硫氨酸和二氨基庚二酸可以展示出 正常的生長。根據(jù)這些現(xiàn)象，可以選擇缺乏MS， IL和/或LS活性或降低該 活性的變異體。通過培養(yǎng)屬于谷氨酸棒桿茵屬并具有在液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生L-谷氨酸的 能力的微生物，以及在該培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-谷氨酸，并從該培養(yǎng)基中收集L-谷氨酸。本發(fā)明的另一目的是提供了一種生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，該方法包括在 谷氨酸生產(chǎn)常用的液體培養(yǎng)基中培育本發(fā)明如上所述的任意一種微生物，以在在該培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-谷氨酸，并從該培養(yǎng)基中收集L-谷氨酸。采用棒桿菌屬，通過培養(yǎng)和積累生產(chǎn)氨基酸，特別是L-谷氨酸的方法 是常規(guī)技術?，F(xiàn)有技術中應用棒桿菌屬，通過培養(yǎng)和積累生產(chǎn)氨基酸，特別 是L-谷氨酸的任何方法均可以用于本發(fā)明。該生產(chǎn)中所使用的培養(yǎng)基可以是含有碳源、氮源、和無機鹽，以及有機 營養(yǎng)如氨基酸、維生素、和諸如此類的普通營養(yǎng)培養(yǎng)基，可以是合成培養(yǎng)基 或天然培養(yǎng)基。任何碳源和氮源可以用于培養(yǎng)基，只要它們可以被培養(yǎng)的微 生物利用。碳源可以是糖，如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、半乳 糖、淀粉水解物以及糖蜜和諸如此類；另外，有機酸如乙酸和檸檬酸也可以 單獨利用或聯(lián)合其它碳源利用。氮源可以是氨，銨鹽如硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨和乙酸銨，以 及硝酸鹽和諸如此類；玉米淀粉的副產(chǎn)物水解玉米漿可以作為有機氮源。作為微量有機營養(yǎng)，可以使用氨基酸，維生素，脂肪酸，核酸，含有它 們的物質(zhì)如蛋白胨、酪蛋白氨基酸，酵母提取物，和大豆蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物和 諸如此類物質(zhì)，并且當利用其生長需要氨基酸和諸如此類的營養(yǎng)缺陷型變異 體時，必需補充需要的營養(yǎng)。作為無機鹽，可使用磷酸鹽，鎂鹽，鈣鹽，鐵鹽，錳鹽和諸如此類。至于培養(yǎng)條件，可以在需氧條件下進行培養(yǎng)，溫度為30到42'C， pH為 6到8。可以連續(xù)培養(yǎng)30小時到60小時，以便在液體培養(yǎng)基中積累相當量 的L-谷氨酸。在完成培養(yǎng)后，可以通過己知方法收集培養(yǎng)基中積累的L-谷氨酸。例 如，可以通過包括在除去細胞后濃縮培養(yǎng)基以便結晶產(chǎn)物，離子交換層析和 諸如此類的方法分離L-谷氨酸。


圖1是說明質(zhì)粒pCDFDuet-2構建過程的示意圖； 圖2是說明質(zhì)粒pCDFDgdh構建過程的示意圖； 圖3是說明質(zhì)粒pCDGA構建過程的示意圖； 圖4是說明質(zhì)粒pETP構建過程的示意圖；和 圖5是說明質(zhì)粒pETPA構建過程的示意圖。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明進行進一步的說明，但不以任何方式限制本發(fā) 明的保護范圍。實施例1:構建含有vgb、 gdh和aceK基因的質(zhì)粒根據(jù)http://www. ncbi. nlm. nih. gov/己公開的透明顏菌Vitreoscilla sp. Cl基因組DNA序列，設計引物VgbFl:TGCTGCTACACCATACTGA和 VgbRl:AAGTCCGGCGAAAGTCCT，作PCR擴增完整Vgb基因，PCR條件如下成分 用量10XPCR緩沖溶液5y 1dd貼37. 1引物VgbFlly 1引物VgbRl1模板lix 1DNTP混合物(10mmol/L)4y 1PFU DNA聚合酶0. 5u 1總量50 u 1按下列步驟，在DNA擴增儀擴增 預變性94'C 5-10分鐘 Cl)94。C 30秒(2) 55°C 30秒(3) 72°C l分鐘 30次循環(huán)，置72。C 10分鐘質(zhì)粒pCDFDuet-l (購自Novagen公司，含有鏈霉素抗性基因)，用EcoRI 酶消化后補平末端，將其與Vgb基因的PCR產(chǎn)物平末端相連接，構建得到含有Vgb基因的質(zhì)粒pCDFDuet-2，如圖1所示。根據(jù)http:〃w麗.ncbi. nlm. nih. gov/已公開的枯草芽孢桿菌枯草亞種 168株(Bacillus subtilis subsp. Subtilis str. 168)的谷氨酸脫氫酶 (gdh)的基因序列(SEQ ID NO: 11和12),設計引物gdhFl和gdhRl (SEQ ID NO: l和NO: 2)。以gdhFl和gdhRl為引物，以枯草芽孢桿菌枯草亞種168 株(Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168)(已知菌種，可在市 場上買到)的DNA為模板，用PFU酶(購自TAKARA公司)進行PCR擴增，條 件如下成分 用量10 X PCR緩沖溶液5u 1dd貼37. 5u 1引物gdhFlly 1引物gdhRl1模板1"DNTP混合物(1O隱ol/L)4u 1PFU DNA聚合酶0. 5u 1總量50 1按下列步驟，在DNA擴增儀擴增-預變性94'C 5-IO分鐘(1) 94。C 30秒(2) 55。C 30秒(3) 72°C 1分鐘 30次循環(huán)，置72。C 10分鐘PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳回收，質(zhì)粒pCDFDuet-2用Notl酶消化后，補平末端， 將其與gdh基因的PCR產(chǎn)物平末端連接，得到含有Vgb和gdh基因的質(zhì)粒 pCDFDgdh，如圖2所示。根據(jù)http:〃www. ncbi. nlm. nih, gov/已公開的大腸桿菌(Escherichia coli) K12的異檸檬酸脫氫酶(aceK)基因序列(SEQ ID NO: 13和14)，設 計引物aceK Fl和aceK Rl (SEQ ID NO: 3和N0:4)，以aceK Fl和aceK Rl 為引物，以大腸桿菌(Escherichia coli) K12的DNA為模板，用PFU酶 進行PCR擴增，條件如下成分 用量10 X PCR緩沖溶液5u 1ddH》37. 5 1引物aceK Fl1引物aceK Rllu 1模板1 u 1DNTP混合物(10mmol/L)4u 1PFU DNA聚合酶0. 5y 1總量50 u 1按下列步驟，在DNA擴增儀擴增 預變性94"C 5-10分鐘(1) 94°C 30秒(2) 55°C 30秒(3) 72°C l分鐘 30次循環(huán)，置72。C 10分鐘PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳回收，質(zhì)粒pCDFDgdh用PACI酶消化后，補平末端，將其 與aceK基因的PCR產(chǎn)物平末端連接，得到含有vgb、 gdh和aceK基因的質(zhì)粒 pCDGA，如圖3所示。實施例2:用導入了vgb、 gdh和aceK基因的菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸取通常用于生產(chǎn)谷氨酸的生產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌GIOI菌株，其中未導 入任何其它基因。將實施例1中所獲得的重組質(zhì)粒pCDGA轉化具有產(chǎn)生L一谷氨酸能力的 谷氨酸棒桿菌GlOl菌株，得到轉化株G102菌株。因為質(zhì)粒pCDFDuet-1含 有鏈霉素抗性基因，所以構建的質(zhì)粒PCDGA也含有鏈霉素抗性基因，在育種 時需添加鏈霉素，車間生產(chǎn)時無需添加，將G102菌株接種到添加鏈霉素的基 本培養(yǎng)基(葡萄糖70g/L、 MgS(V7H力l.lg/L、 (NH4)2S04 16. 5g/L、 KHJ^ 1. lg/L、 FeSOJ&O 0. 01g/L、 MnSO一 5貼0. 01g/L、水解玉米漿17ml/L、 L-蛋氨酸0. 6 g/L、 L-蘇氨酸0. 12 g/L、 L-異亮氨酸0. 06 g/L，鏈霉素6mg/L， pH7.0)中，在37"C， 115 120轉/分的條件下振蕩培養(yǎng)40小時，同時將 未導入pCDGA的GlOl菌株在不添加鏈霉素的同樣的培養(yǎng)基中作為對照培養(yǎng)。 培養(yǎng)完成后，從培養(yǎng)基中收集L一谷氨酸，測量積累產(chǎn)生的L一谷氨酸。結 果如表l所示。表h L-谷氨酸的產(chǎn)量菌株L-谷氨酸產(chǎn)量(g/dUG1010. 5G102 (vgb + gdh + aceK)4. 2谷氨酸棒桿菌G102由于導入了來自透明顫菌的血紅蛋白基因(vgb)，提 高了氧傳遞效率，增加了氧傳遞量，并且其中谷氨酸脫氫酶(gdh)和異檸檬 酸脫氫酶(aceK)的增強而使L-谷氨酸的產(chǎn)率得到提髙。實施例3:構建含有pycA和acoC基因的質(zhì)粒根據(jù)http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/已公開的枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)的丙酮酸羧化酶(pycA)的基因序列(SEQ ID NO: 15 和16),設計引物pycAFl和pycARl (SEQ ID NO: 5和NO: 6)，以pycAFl 和pycARl為引物，以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的DNA為模板， 用PFU酶進行PCR擴增，條件如下成分 用量10 X PCR緩沖溶液5y 1ddH2037. 5u 1引物pycA Fllu 1引物pycA RlIP 1模板1 u 1DNTP混合物(lOmmol/L)4u 1PFU DNA聚合酶0. 5 1總量50 y 1按下列步驟，在DNA擴增儀擴增 預變性94'C 5-IO分鐘(1) 94°C 30秒(2) 55°C 30秒(3) 72°C l分鐘 30次循環(huán)，置72。C 10分鐘擴增片段經(jīng)電泳回收，質(zhì)粒pETDuet-l(購自Novagen公司，含有氨芐 抗性)用EcoRI酶消化后補平末端，將其與丙酮酸羧化酶(pycA)基因的PCR產(chǎn)物平末端相連接，得到含有丙酮酸羧化酶(pycA)基因的質(zhì)粒pETP，如圖4所示。根據(jù)http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/已公開的枯草芽孢桿菌枯草亞種 168株(Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168)的硫辛酸乙酰轉 移酶(acoC)基因序列(SEQ ID NO: 17和18)，設計引物acoC Fl和acoC Rl( SEQ ID NO: 7和N0:8)，以acoC Fl禾fl acoC Rl為引物，以枯草芽孢 桿菌枯草亞種168株(Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168)的 DNA為模板，用PFU酶進行PCR擴增，條件如下成分 用量10XPCR緩沖溶液5y 1d.37. 5u 1引物acoC Fllii 1引物acoC Rl1模板1"DNTP混合物(10mmol/L)4u 1PFU DNA聚合酶0. 5u 1總量50 n 1按下列步驟，在DNA擴增儀擴增 預變性94'C 5-IO分鐘(1) 94。C 30秒(2) 55。C 30秒(3) 72°C l分鐘 30次循環(huán)，置72。C 10分鐘PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳回收，質(zhì)粒pETP用Notl酶消化后，補平末端，將其與 硫辛酸乙酰轉移酶(acoC)基因的PCR產(chǎn)物平末端連接，得到含有丙酮酸羧 化酶(pycA)基因和硫辛酸乙酰轉移酶(acoC)基因的質(zhì)粒pETPA，如圖5所示。實施例4:用導入了vgb、 gdh、 aceK、 pycA和acoC基因的菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸將上述實施例3中所獲得的重組質(zhì)粒pETPA，轉化至谷氨酸棒桿菌G 1 0 2菌株中，得到G103菌株，并接種到基本培養(yǎng)基(葡萄糖135g/L、 MgS04. 7H20 1. lg/L、 (NH丄S(X 16. 5g/L、 KH2P04 1. 1g/L、 FeSC^ 7H20 0. 01g/L、MnS(X. 5貼0. 01g/L、水解玉米漿30ml/L 、L-蛋氨酸0. 6 g/L、L-蘇氨酸 0. 12 g/L、 L-異亮氨酸0.06 g/L、氨芐青霉素6mg/L、鏈霉素6mg/L， pH 7.0) 中，在37X:， 115 120轉/分的條件下振蕩培養(yǎng)4 O小時，同時將G102菌 株和G101菌株也在不添加氨芐青霉素的同樣的培養(yǎng)基中作為對照培養(yǎng)。培 養(yǎng)完成后，從培養(yǎng)基收集L一谷氨酸，測量積累產(chǎn)生的L一谷氨酸。結果如 表2所示。表2: L-谷氨酸的產(chǎn)量菌株L-谷氨酸產(chǎn)量(g/dL)G1010. 5G102(vgb + gdh + aceK)4. 2G103 (vgb + gdh + aceK + pycA + acoC)8. 1谷氨酸棒桿菌G103由于導入了來自透明顫菌的血紅蛋白基因，提高了 氧傳遞效率，增加了氧傳遞量，并且其中谷氨酸脫氫酶(gdh)、異檸檬酸脫 氫酶(aceK)、丙酮酸羧化酶(pycA)和硫辛酸乙酰轉移酶(acoC)的增強使L-谷氨酸的產(chǎn)率得到提高。實施例5:用敲除硫辛酸琥珀酰轉移酶(LS)基因的菌株生產(chǎn)L-谷氨酸以質(zhì)粒PKF3 (購自TAKARA公司，含有氯霉素抗性基因Cat基因)為模 板，用LSP1、 LSP2為引物進行PCR擴增，其中LSP1靠近5'端的區(qū)域(加 下劃線部分)與硫辛酸琥珀酰轉移酶(LS)基因一端序列同源，LSP2靠近5' 端的區(qū)域(加下劃線部分)與硫辛酸琥珀酰轉移酶(LS)基因另一端序列同源； LSP1靠近3'端的區(qū)域(未加下劃線部分)與質(zhì)粒PKF3上Cat基因一側序 列互補，LSP2靠近3'端的區(qū)域(未加下劃線部分)與質(zhì)粒PKF3上Cat基因另一側序列互補LSP1:5，-GATGCCCTGTACACGGCGAGGCTCCCCTTGCCACGCT CAGTGGAACTCCGTCG-3' (SE(JIDNO: 9)LSP2: 5國GCA GCC ATC TGG CTGCCT TAGTCTGTCTTACGGTGT AAAACGTCCGAAGGCC-3' (SEQIDNO: 10)經(jīng)PCR反應，條件如下10XPCR緩沖溶液ddH20引物LSP1引物LSP2模板DNTP混合物(10mmol/L) PFLI DNA聚合酶忌、37. 1按下列步驟，在DNA擴增儀擴增 預變性94"C 5-10分鐘 (D94。C 30秒(2) 55°C 30秒(3) 72°C l分鐘 30次循環(huán)，置72。C 10分鐘擴增出兩翼與硫辛酸琥珀酰轉移酶(LS)基因上下游序列同源，中間為氯 霉素抗性基因的DNA片段。挑取谷氨酸棒桿菌G103的單菌落接種于新鮮LB培養(yǎng)基(含有氨芐青霉 素)中，3(TC振蕩培養(yǎng)過夜，轉接于50mL培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至A,二O. 2-0. 3。 加入L-阿拉伯糖，繼續(xù)培養(yǎng)至A,=0.5-0.6，將菌液置冰浴中15-20min，于 4°C， 5000Xg離心10min，用滅菌的10%甘油洗滌菌體3次，將菌體重懸于 0、 5mL甘油中，制成感受態(tài)細胞。移取上述PCR產(chǎn)物與感受態(tài)細胞混合， 電擊后加入lml預冷的LB培養(yǎng)基，3(TC培養(yǎng)lh。移取200ul涂布于含有氨 芐青霉素(氨芐青霉素6mg/L)和鏈霉素(鏈霉素6mg/L)的LB平板上， 30。C培養(yǎng)，篩選陽性轉化子。上述外源DNA片段轉入G103菌株中后，在Red 重組酶的作用下，外源酒A片段與染色體上的同源區(qū)域重組，導致將硫辛酸 琥珀酰轉移酶(LS)基因敲除，得到硫辛酸琥珀酰轉移酶(LS)基因缺陷株 G104。將所獲得的重組菌株G104，接種到基本培養(yǎng)基(葡萄糖180g/L、 MgS(k 7H20 1. lg/L、 (NH4)2S04 16. 5g/L、 KH2P04 1. lg/L、 FeS04 7H20 0. 01g/L、MnS(k 5H20 0. 01g/L、水解玉米漿45ml/L 、L-蛋氨酸0. 6 g/L、L-蘇氨酸0. 12 g/L、 L-異亮氨酸0.06 g/L、氨芐青霉素6mg/L、鏈霉素6mg/L， pH7.0) 中培養(yǎng)，同時，將未硫辛酸琥珀酰轉移酶(LS)基因未被敲除的菌株G103也 在同樣的培養(yǎng)基中作為對照培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，從培養(yǎng)基中收集L一谷氨酸， 測量積累產(chǎn)生的L一谷氨酸。結果如表3所示。表3: L-谷氨酸的產(chǎn)量菌株L-谷氨酸產(chǎn)量(g/dL)G103 (vgb + gdh + aceK + pycA+ acoC)8. 1G10411, 2谷氨酸棒桿菌G104由于導入了來自透明顫菌的血紅蛋白基因，提高了 氧傳遞效率，增加了氧傳遞量，并且其中谷氨酸脫氫酶(gdh)、異檸檬酸脫 氫酶(aceK)、丙酮酸羧化酶(pycA)和硫辛酸乙酰轉移酶(acoC)的增強以及硫 辛酸琥珀酰轉移酶(LS)基因被敲除，而使L-谷氨酸的產(chǎn)率得到提高。實施例6.-異檸檬酸裂解酶(IL)，蘋果酸合成酶(MS)的弱化處理。 異檸檬酸裂解酶(IL)，蘋果酸合成酶(MS)的誘變處理 用化學誘變劑硫酸二乙酯(DES)和甲酰胺處理谷氨酸棒桿菌G104，獲得突變菌G104-1菌株，該菌種的保藏號是CGMCC No: 2368 ，保存日期2008年1月28日，該突變菌G104-1菌株與原菌株G104相比，異檸檬酸裂解酶(IL)和蘋果酸合成酶(MS)有一定的弱化。對該突變株進行培養(yǎng)選育，并進一步對它進行紫外誘變和組成型選育， 獲得異檸檬酸裂解酶(IL)和蘋果酸合成酶(MS)進一步弱化的菌株G104-2，該 菌種的保藏號為CGMCC No: 2366 ，保存日期2008年1月28日)，該突 變菌G104-2菌株與原菌株G104-1相比，異檸檬酸裂解酶(IL)和蘋果酸合成 酶(MS)有更進一步的弱化。將所獲得的菌株G104-2,在培養(yǎng)基(葡萄糖230g/L、MgS04. 7H20 1. lg/L、 (NH》2S04 16. 5g/L、 KH2P0 1. lg/L、 FeS0:7H20 0. 01g/L、 MnS04. 5H20 0. 01g/L、 水解玉米槳57ml/L、 L-蛋氨酸0.6 g/L、 L-蘇氨酸0.12 g/L、 L-異亮氨 酸0.06g/L，氨芐青霉素6mg/L，鏈霉素6mg/L)中，在pH7.0培養(yǎng)，同時， 將G104-1菌株和未誘變處理的菌株G104也在同樣的培養(yǎng)基中作為對照培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，從培養(yǎng)基中收集L一谷氨酸，測量積累產(chǎn)生的L一谷氨酸。 結果表示在表4。表4: L-谷氨酸的產(chǎn)量___L-谷氨酸產(chǎn)量(g/dL)G104 11.2G104-l 12.3 _G104-2__谷氨酸棒桿菌G104-2的異檸檬酸裂解酶(IL)，蘋果酸合成酶(MS)弱化 后，使卜谷氨酸的產(chǎn)率在G104基礎上得到提高。以上已詳細描述了本發(fā)明的實施方案，對本領域技術人員來說很顯然可 以做很多改進和變化而不會背離本發(fā)明的基本精神。所有這些變化和改進都 在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。序列表<110〉申請人長春大成實業(yè)集團有限公司 <120〉生產(chǎn)L-谷氨酸的細菌和生產(chǎn)L-谷氨酸的方法 <160> 18<170〉 Patent In版本3. 1<210〉 1 <211〉 24 <212>腿 <213>人工序列<220〉<223〉 PCR引物 <400〉 1tacataggcc taaattttcc tttt 24<210> 2 <211〉 24 <212>腿 <213>人工序列<220〉<223〉 PCR引物 <400> 2agtaaggtcc gtccggcgcc aatt 24<210〉 3 <211> 24 <212〉 DNA <213>人工序列<220><223〉 PCR引物 <400〉 3tacggcgcac cggaccttaa taac 24<210〉 4 <211> 24 <212〉廳 <213>人工序列<220〉<223〉 PCR引物 <400> 4gccatacccc tctacgaaaa aact 24<210> 5 <211> 24 <212〉 DNA <213>人工序列<220><223> PCR引物 <400> 5aeicagagtcg ttagctatgt tttt 24<210> 6 <211〉 24 <212〉 DNA <213〉人工序列<220〉<223〉 PCR引物 <400> 6gaggaacttt aactttttcg tatt 24<210〉 7 <211〉 24 <212〉 DNA 〈213〉人工序列<220〉<223〉 PCR引物<400〉 7taccgccatt ttcatcacta cggt 24<210〉 8 <211> 24. <212〉 DNA <213>人工序列<220〉〈223〉 PCR引物 <400〉 8cttgggcgtc gtaattaaaa tatc 24<210〉 9 <211> 24 <212> DNA <213〉人工序列<220><223> PCR引物 <400〉 9gatgccctgt acacggcgag gctc 24<210〉 10<211> 24<212〉 DNA <213〉人工序列〈220〉<223〉 PCR引物<400〉 10gcagccatct ggctgcctta gtct 24<210〉 11 〈211〉 786 〈212〉 DMA<213〉枯草芽孢桿菌枯草亞種168株(Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168)<400〉 11atgtatccgg atttaaaagg aaaagtcgtc gctattacag gagctgcttc agggctcgga 60aaggcgatgg ccattcgctt cggcaaggag caggcaaaag tggttatcaa ctattatagt 120aataaacaag atccgaacga ggtaaaagaa gaggtcatca aggcgggcgg tgaagctgtt 180gtcgtccaag gagatgtcac ga犯gaggeia gatgtaa犯a atatcgtgca aacggcaatt 240aaggagttcg gcacactcga tattatgatt aataatgccg gtcttgaaaa tcctgtgcca 300tctcacgaaa tgccgctcaa ggattgggat aaagtcatcg gcacgaactt aacgggtgcc 360tttttaggaa gccgtgaagc gattaaatat ttcgtagaaa acgatatcaa gggaaatgtc 420attaacatgt ccagtgtgca cgaagtgatt ccttggccgt tatttgtcca ctatgcggca 480agtaaaggcg ggataaagct gatgacag犯acattagcgt tggaatacgc gccgaagggc 540attcgcgtca ataatattgg gccaggtgcg atcaacacgc caatc犯tgc tgaaaaattc 600g'ctgacccta犯cagaaagc tgatgtagaa agcatgattc caatgggata tatcggcgaa 660ccggaggaga tcgccgcagt agcagcctgg cttgcttcga aggaagccag ctacgtcaca 720ggcatcacgt tattcgcgga cggcggtatg acacaatatc cttcattcca ggcaggccgc 780ggttaa 786<210〉 12 <211〉 261 <212〉 PRT<213〉枯草芽孢桿菌枯草亞種168株(Bacillus subtilis subsp. subtilis str， 168) 〈400〉 12MetTyrProAspLeuLysGlyLysValValAla lie Thr GlyAlaAlaSerGlyLeuGlyLys5101520AlaMetAlalieArgPheGlyLysGluGinAla Lys Val VallieAsnTyrTyrSerAsnLys25303540GinAspProAsnGluValLysGluGluVallie Lys Ala GlyGlyGluAlaValValValGin45505560GlyAspValThrLysGluGluAspValLysAsn lie Val GinThrAlalieLysGluPheGly65707580ThrLeuAsplieMetlieAsnAsnAlaGlyLeu Glu Asn ProValProSerHisGluMetPro859095100105LeuLysAspTrpAspLysVallieGlyThrAsn Leu Thr GlyAlaPheLeuGlySerArgGlu110115120125AlalieLysTyrPheValGluAsnAsplieLys Gly Asn VallieAsnMetSerSerValHis130135140145GluVallieProTrpProLeuPheValHisTyr Als Als SerLysGlyGlylieLysLeuMet150155160165ThrGluThrLeuAlaLeuGluTyrAlaProLys Gly lie ArgValAsnAsnlieGlyProGly170175180185AlalieAsnThrProlieAsnAlaGluLysPhe Als Asp ProLysGinLysAlaAspValGlu190195200205210SerMetlieProMetGlyTyrlieGlyGluPro Glu Glu lieAlaAlaValAlaAlaTrpLeu215220225230AlaSerLysGluAlaSerTyrValThrGlylie Thr Leu PheAlaAspGlyGlyMetThrGin235240245250TyrProSerPheGinAlaGlyArgGly255 260<210> 13〈211〉 1737<212> ■<213〉大腸桿菌(Escherichia coli) K12<400〉 13atgccgcgtgtatggtcgatcatgctgtccgtcgtgg3gccgtgttaaagagcttttttactttttatcta^a_g￡LCtttcccgctgcgccacgg犯acgcttttaccgcaccatttttgcacgacgaccggcgccgctgcgctgaattgttatctcgttt3tggtg3tgt鄉(xiāng)ttcgcgcaaagagcacgg聊agcggcatcaccgatcccgctcaatatacggtaacgaa犯acttcgtacatgacgggccagcgaactggctatgcgcgcgctgatttatgcgtatcgcctggaatttcctcgaagtagcaggcgataactgcgctgagcattacacactccgtgtattagctctcaaccccgatcatgcgctggcatggggacagaat犯3gccgctgccgatccaccgaagcgagccgcagcgctatatggctatatctacagggtggtgtttaccgcaga犯gaatcgcgtgggatatttcccctcggcgaacatctggctggactattcgccagtgtcacccgaagtgaatttcgtggtacagccgacccgcgactggcgcgcggcgcaggcaattgattgct gacctccggtccggctgttg ctgtcggtta gccagagcgc cggctggg犯caacctcgcg ctggctggtaCC3g3Cgg3Ccattgttttt ggtcgagtgg cggctgccag ctgtaatgag gctgccgggc gatgtctgcc ccgaatggcg ggcattaatg aattgtgatt acaagtggaa gcttgccgct tceicgggcgt ccgcgacatc cgtctcgccg tattggtccg actacaaaac aagatttagccaaaccattt gcgcagc鄧c atccatctttccggattacc tttgaccacc cgctttcgta tctctactga cgtgacatcc ga犯gtcatt ggc犯actga gacggcgagt ggctttgcgc ctacgggdaa aagcacgccaC3gttC3ttgtttgatcggg gctcacgttc gacacccagg gaattactgc cgccatcttt ggtcagcagtgtggtUUt ccgccgccgc ggcg3tgttt ctgtttgaag cgcatacgtg gtacggtatgtgcaaggctt gtttcgaaca acgatcatca cggacgcggc cgcgcttcga gctcgcttac ccattccccg tgcgcgttattac鄉(xiāng)tggc tcacaccttc tatttattga gttcttattt ttctgccagg aaaccg肌ag aagcgccggg tattcsaBgt gtgcctgctattcaggaagc atattgagcg tgcgcgacgc tccctggcga atgattacga gctatccgga tcccgg犯ga agatgcacgc aagggcatgt ggg卿tgctcgatgctcag ggccgactgg cgttggtctg atttttacta gattgcggag tcccgagcgg cccgctggcg cagcgaccta tcgccatctg gaacgaactg cggcacattg tacctgcctg tatggtttat taaaac cacc ctaccgcgaa tattcgtgga catc犯agac tcaactggtg ctttgtgctggcggatggtg cattgaagaa catgctgttt tgaaatttgc agacgaactt gtttcgccac cgacctgttc ggaagatgtt tttttga7S1G101112121313141515161617<210〉 14<211〉 577<212〉 PRT<213〉大腸桿菌(Escherichia coli) K12<400〉 14Met Pro Arg GlyGly Arg Phe Leu 25Val Gin Gin Arg 45Gin Leu Arg Cys 65His Tyr Thr Arg 85Val Tyr Cys ArgGin Pro Glu Arg 120Gly Trp Glu Ser 140Lys Ser Arg Asp 160Arg Glu Ser His 180Gly Lys Leu lieGly Glu Leu Phe 215Arg Arg Ser Tyr 235lie Leu Pro GlyLeu Glu 5Glu ValMet Lyslie ThrLeu Leu 90Leu Phe 110Arg PheLeu Leulie HisLeu Gin 185 Thr Pro 205lie Asp Phe Met Lvs ThrLeuThrAsnAsn70ProAspArgMetTyr 165 ValSerThrValThrLeuSerArg50GlyAspHisThrArg 145 lieArgGlyCysTyr 240 ArglieGly30lieGinTyrArglie 125 VallieAsnThrLeu 220 ArgGluArg10ArgHisSerProSer 105 ProlieArgGluLeu 210 ThrProLeuGin ThrGin GinLeu TyrThr Asp75 Arg Phe 95Leu ThrArg ProSer AspHis Leu 170 Leu Phe 190Pro Phe Thr Thr Leu Pro Tyr MetlieArgAsp55ArgGluProLeul>eu 150 ThrTyrLeuArgArg 245 ArgleuPhe35His■ArglieGluArg 130 ProGluArgLeuGlu 225 ArglieGin15GluHisPheArgArg 110 LysleuThrAsnPro 205 ArgLeuGlyGly PheGin ArgVal GlyLeu Leu80 Glu Ser 100Leu PheAsp PheArg LeuLeu Gly 175 Lys Arg 195lie His Ser lie Val Glu Cys GinAspAspLeu60ArgPhelieHisArg 155 ThrArgGinValTrp 250 LysArgTrp40ValValPhePhePro 135 TrpAspTrpThrPhe 230 二euHisGin Tyr 20His ArgVal GluLys GluAsn Ssr 105 Ser Ser 115Asp HisGin 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lieGluGlu Tyr415420liePhe ProGlyAspMet LeuPheLys Asn435440TyrAsp TyrAspGlulie CysTyrMet Thr455460TyrPro GluAspGluLeu Arg Ser Glu Pro475480GluGlu PheArgHisTrp LeuCysArg Asp500505ArgAsp )LeuPheArgArg AspTyrTrp Arg520525GluAsp ValTyrArgTyr ArgArgArg Gin540545<210〉 15 <211〉 3447 <212〉 DNA<213〉大腸桿菌(Escherichia coli) K12 <400〉 15ttgtctcagc aatcgataca aaaagtatta gtagcaaaca ggggagaaat tgcaatccga 61atattccggg cgtgtaccga gttgaatatt cgtacagttg cggtctattc aaaagaagat 121tccggttcct accatcggta caaagcggat gaagcatact tggtcggtga agggaaaaaa 181ccgattgatg cttacctgga ta/ttgaaggt atcattgata ttgcgaaaag aaacaaagtc 241gatgcaattc atccgggata cggtttctta tctgaaaata ttcattttgc gagacgatgt 301gaagaag肌g gcatcgtatt catagggcca aaatccgagc atctcgatat gtttggtgac 361aaggtaaaag cgcgtgagca ggcagaaaaa gcgggaatcc ccgtgattcc gggaagcgac 421ggtcctgccg aaacgcttga agccgtcgaa caatttggac aagctaacgg ttatccgatc 481atcattaaag cctcgcttgg cggcggcggc cgcggtatgc ggattgtcag atctgaaagt 541gaagttaaag aagcatatga gcgtgctaaa tcagaggcga aagcagcctt 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PRT〈213〉大腸桿菌(Escherichia coli) K12 <400〉 16Met Ser Gin Gin Ser lie Gin Lys Val Leu Val Ala Asn Arg Gly Glu5 10 15Phe Arg Ala Cys Thr Glu Leu Asn lie Arg Thr Val Ala Val Tyr Ser25 30 35Ser Tyr His Arg Tyr Lys Ala Asp Glu Ala Tyr Leu Val Gly Glu Gly45 50 55Ala Tyr Leu Asp lie Glu Gly lie lie Asp lie Ala Lys Arg Asn Lys65 70 75Pro Gly Tyr Gly Phe Leu Ser Glu Asn lie His Phe Ala Arg Arg Cys 85 90 95 100Val Phe lie Gly Pro Lys Ser Glu His Leu Asp Met Phe Gly Asp Lys110 115 120Gin Ala Glu Lys Ala Gly lie Pro Val lie Pro Gly Ser Asp Gly Pro130 135 140Ala Val Glu Gin Phe Gly Gin Ala Asn Gly Tyr Pro lie lie lie Lys150 155 160Gly Gly Arg Gly Met Arg lie Val Arg Ser Glu Ser Glu Val Lys Glu170 175 180Lys Ser Glu Ala Lys Ala Ala Phe Gly Asn Asp Glu Val Tyr Val Glu 190 195 200 205Pro Lys His lie Glu Val Gin Val lie Gly Asp Lys Gin Gly Asn Val215 220 225Arg Asp Cys Ser Val Gin Arg Arg His Gin Lys Val lie Glu Val Ala235 240 245Ser Pro Glu Leu Arg Asp Gin lie Cys Glu Ala Ala Val Ala Leu Ala255 260 265lie Asn Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val Ala Asn Asn Glu Phe Tyr275 280 285Pro Arg Val Gin Val Glu His Thr lie Thr Glu Met lie Thr Gly Val 295 300 305 310Gin lie Leu Val Ala Gin Gly His Ser Leu His Ser Lys Lys Val Asnlie Ala lieLys Glu Asp 40Lys Lys Pro 60Val Asp Ala 80Glu Glu GluVal Lys AlaAla Glu Thr 145Ala Ser Leu 165Ala Tyr Glu 185Lys Leu lieVal His LeuPro Ser Val 250Lys Asn Val270 Phe lie Glu 290Asp lie Val lie Pro GluArg lie 20Ser Glylie Asplie HisGly lie 105 Arg Glu 125Leu GluGly GlyArg AlaGlu Asn 210 Phe Glu 230Ser LeuAsn TyrVal AsnGin Thr 315 Gin Lys122222222222222223^33^320 325 330 335
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340 345 350 355
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360 365 370 375
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380 385 390 395
Leu Ser Thr Trp Ala Leu Thr Phe Glu Gin Ala Ala Ala Lys Met Val Arg Asn Leu Gin Glu 400 405 410 415 420
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425 430 435 440
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445 450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 艦 500
Asp Gin Gin Pro Ala Arg Gly Thr Lys Gin lie Leu Asp Glu Lys Gly Ala Glu Gly Leu Ala 505 510 515 520 525
Asn Trp ValLys Glu Gin Lys SerVal Leu Leu Thr AspThr Thr Phe ArgAsp Ala His Gin
530535540545
Ser LeuLeuAla Thr Arglie ArgSer HisAsp Leu LysLys lie AlaAsnPro Thr AlaAla
550555560565
Leu Trp ProGluLeu PheSer MetGlu Met Trp Gly GlyAla Thr PheAspVal Ala TyrArg
570575580585
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590595600605
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610615620625630
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635640645650
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655660665670
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675680685690
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695700705710
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715720725730735
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740745750755
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760765770775
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Gin GlyValGluLeu LeuSer GinTyr Trp Glu Ser ValArg Lys TyrTyrSer Glu PheGlu
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925930935940945
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970975980985
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99099510001005
Gly MetThrLeuGly GluGlu lieGlu ValGlu lie GluArg Gly LysThrLeu lie ValLys
IO]O101510201025
Leu lieSerlieGly GluPro GinPro Asp Ala Thr ArgVal Val Tyr Phe Glu Leu AsnGly10301035104010451050
GinProArg Glu Val VallieLys Asp GluSerlie Lys Ser SerValGinGlu ArgLeu Lys
1055106010651070
AlaAspArg Thr Asn ProSerHis lie AlaAlaSer Met Pro GlyThrVallie LysVal Leu
1075108010851090
AlaGluAla Gly Thr LysValAsn Lys GlyAspHis Leu Met lieAsnGluAla MetLys Met
1095110011051110
GluThrThr Val Gin AlaProPhe Ser GlyThrlie Lys Gin ValHisValLys AsnGly Glu
1115 1120 1125 1130
Pro lie Gin Thr Gly Asp leu Leu Leu Glu lie Glu Lys Ala 1135 1140 1145
〈210〉 17 <211〉 1197 <212〉 DNA
〈213〉枯草芽孢桿菌枯草亞種168株(Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168) <400〉 17
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<210〉 18
<211> 398
<212〉 PRT
<213〉枯草芽孢桿菌枯草亞種168株(Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168)
<400〉 18
MetAlaValCysVal 5ValMetProLysLeu 10GlyMetAlaMetLys 15GinGlyGluValSer 20lie
TrpAsnLysLys 25ValGlyAspProVal 30GluLysGlyGluSer 35lieAlaSerlieGin 40SerGlu
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45505560
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859095100105
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AlaGluLysAla 130GlyLeuAspLeuLys 135GinLeuLysGlyThr 140GlyProGlyGlyArg 145lieVal
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235240245250
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255260265270
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275280285290
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295300305310315
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320325330335
GluThrGlylie LeuGly lieGlyAlaSerTyrAsp ThrProValTyr Gin Gly Glu Glulie
340345350355
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360365370375
AlaAlaAlaPhe LeuLys AlaMetLysThrTyrLeu GluGluProAla Ala Leu lie Leu
380385390395 398
<210〉 19 <211〉 441 <212〉腿
〈213〉透明顫菌Vitreoscilla sp. CI <400〉 19
1 atgttagacc agcaaaccat taacatcatc aaagccactg ttcctgtatt gaaggagcat 61 ggcgttacca ttaccacgac tt.tttataaa aacttgtttg ccaaacaccc tgaagtacgt 121 cctttgtttg atatgggtcg ccaagaatct ttggagcagc ctaaggcttt ggcgatgacg 181 gtattggcgg cagcgc犯aa cattgaaaat ttgccagcta ttttgcctgc ggtc犯aaaa 241 attgcagtca aacattgtca agcaggcgtg gcagcagcgc attatccgat tgtcggtcaa 301 gaattgttgg gtgcgattaa agaagtattg ggcgatgccg caaccgatga cattttggac 361 gcgtggggca aggcttatgg cgtgattgca gatgtgttta ttcaeigtgga agcagatttg 421 tacgctcaag cggttgaata a
權利要求
1、一種具有生產(chǎn)L-谷氨酸能力的棒桿菌屬(Corynebacterium)細菌，其特征是在該棒桿菌屬細菌中導入了血紅蛋白基因。
2、 根據(jù)權利要求
l所述的棒桿菌屬細菌，其是具有生產(chǎn)L-谷氨酸能力 的谷氨酸棒桿菌(Caryy e/ acZ:ery"ffi g_/〃^ ic〃/ )。
3、 根據(jù)權利要求
1或2所述的棒桿菌屬細菌，其中所述的血紅蛋白基 因來自透明顫菌屬(^ freeze)。
4、 根據(jù)權利要求
3所述的棒桿菌屬細菌，其中所述微生物中L-谷氨酸 生物合成反應的酶的活性增強。
5、 根據(jù)權利要求
4所述的棒桿菌屬細菌，其中所述的L-谷氨酸生物合 成反應的酶選自谷氨酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸羧化酶或硫辛酸乙 酰轉移酶中的至少一種；優(yōu)選的，所述的L-谷氨酸生物合成反應酶是谷氨 酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶；更優(yōu)選的，其中所述的L-谷氨酸生物合成反 應酶是谷氨酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸羧化酶和硫辛酸乙酰轉移酶。
6、 根據(jù)權利要求
l-5任意一項所述的棒桿菌屬細菌，該微生物中催化 L-谷氨酸生物合成途徑的分支反應并產(chǎn)生不是L-谷氨酸的化合物的酶的活 性降低或缺乏。
7、 根據(jù)權利要求
6所述的棒桿菌屬細菌，其中采用低能離子注入誘變 方法使不生成L-谷氨酸化合物反應的酶的活性降低或缺乏。
8、 根據(jù)權利要求
6所述的棒桿菌屬細菌，其中催化L-谷氨酸生物合成 途徑的分支反應并產(chǎn)生不是L-谷氨酸的化合物的酶選自異檸檬酸裂解酶、 蘋果酸合成酶或硫辛酸琥珀酰轉移酶中的至少一種，優(yōu)選的，其中催化L-谷氨酸生物合成途徑的分支反應并產(chǎn)生不是L-谷氨酸的化合物的酶是異檸 檬酸裂解酶；或是異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合成酶；或是異檸檬酸裂解酶、 蘋果酸合成酶和硫辛酸琥珀酰轉移酶。
9、 根據(jù)權利要求
8所述的棒桿菌屬細菌，其中異檸檬酸裂解酶和蘋果 酸合成酶被弱化處理的棒桿菌屬細菌是保藏號為CGMCC No: 2368和CGMCCNo: 2366的菌株。
10、生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，該方法包括在谷氨酸生產(chǎn)常用的液體培養(yǎng) 基中培養(yǎng)權利要求
l-9任意一項所述的棒桿菌屬細菌，以在該培養(yǎng)基中產(chǎn)生 和積累L-谷氨酸，并從培養(yǎng)基中收集L-谷氨酸。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于棒桿菌屬，并且具有生產(chǎn)L-谷氨酸能力的微生物，以及從該培養(yǎng)基收集產(chǎn)生的L-谷氨酸。所使用的微生物菌株中導入了來自透明顫菌的血紅蛋白基因，提高了氧傳遞效率，增加了氧傳遞量。所使用的微生物菌株優(yōu)選的還是具有催化L-谷氨酸生物合成途徑的分支反應，并且產(chǎn)生不是L-谷氨酸的化合物的酶的活性減少或缺乏(其中使用了低能離子注入誘變的方法)，或者還具有催化L-谷氨酸生成的酶的活性增強的菌株。
文檔編號C12N1/21GKCN101580812SQ200810081863
公開日2009年11月18日 申請日期2008年5月13日
發(fā)明者段昭煒, 王德輝, 賈冬舒 申請人:長春大成實業(yè)集團有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan