專利名稱：:基因工程菌混合培養(yǎng)生產(chǎn)三種人α防御素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種利用基因工程菌混合培養(yǎng)生產(chǎn)人α防御素的方法，即將經(jīng)過(guò)基因修飾的人α防御素(Humanneutrophilρ印tides，HNP)1、2、3成熟肽編碼序列插入融合性原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得三種轉(zhuǎn)基因工程菌，在混合培養(yǎng)體系中生產(chǎn)三種人α防御素蛋白混合物。本發(fā)明提供用于本發(fā)明的方法及適用的工程菌。
背景技術(shù)：
：防御素是普遍存在于高等生物體中的一種微生物抗生肽，對(duì)病源微生物具有廣譜的毒殺效應(yīng)，是機(jī)體免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分(GancTetal,EurJHaematol,1990,441；張滿朝，國(guó)外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊(cè)，1994，68:70)。防御素主要由哺乳動(dòng)物體內(nèi)參與非特異性免疫的一些吞噬細(xì)胞，特別是嗜中性粒細(xì)胞(PMN)產(chǎn)生的，其它細(xì)胞包括NK細(xì)胞、Yδ細(xì)胞、B細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞及某些上皮細(xì)胞也能產(chǎn)生此類物質(zhì)。成熟防御素是分子量為34KD的非糖基多肽，一般由2934個(gè)氨基酸組成，分子內(nèi)的3個(gè)二硫鍵使防御素具有穩(wěn)定的β“片層結(jié)構(gòu)，在防御素分子間，通過(guò)疏水鍵和氫鍵的相互作用形成二聚體。目前對(duì)防御素的抑菌機(jī)理尚無(wú)定論。普遍認(rèn)為，防御素的細(xì)胞毒活性和抗微生物活性與其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有關(guān)，帶正電的防御素與帶負(fù)電的細(xì)菌細(xì)胞膜相互吸引，二聚或多聚的防御素穿膜形成跨膜的離子通道，從而擾亂了細(xì)胞膜的通透性及細(xì)胞能量狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化，呼吸作用受到抑制以及細(xì)胞ATP含量下降，最終使靶細(xì)胞死亡。防御素的抗病毒作用則是通過(guò)與病毒外殼蛋白結(jié)合而導(dǎo)致病毒失去生物活性(LehrerRIetal,AnnurevImmun,1993,11105；LehrerRIetal,JClinInvest，1989，84:553)。由于這種特殊的作用機(jī)理，使防御素具備兩個(gè)特點(diǎn)一是抗性譜廣，二是目的微生物難以對(duì)其產(chǎn)生抗性突變。因此，科學(xué)家們對(duì)防御素應(yīng)用前景十分看好。防御素在人體內(nèi)廣泛分布，包括α防御素β防御素兩類。已發(fā)現(xiàn)的α防御素有6種之多，有關(guān)基因結(jié)構(gòu)已經(jīng)基本清楚(SparkesRSetal，Genomic,1989，5:240)。早在1993年，日本科學(xué)家就報(bào)道防御素在離體情況下可抑制艾滋病毒的復(fù)制，但沒(méi)有證明在體內(nèi)防御素仍然有效(NakashimaHetal，AIDS，1993，7:1129)。1986年，科學(xué)家們觀察到人體免疫細(xì)胞⑶8分泌一些可抑制艾滋病病毒復(fù)制的未知因子(WalkerCMetal,Science,1986,234:1563)。近來(lái)，張林琦等在正常人群和感染HIV1的長(zhǎng)期生存者來(lái)源⑶8+T淋巴細(xì)胞刺激培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)了一族有2個(gè)或3個(gè)峰的分子，分子量分別為3371.9Da、3442.5Da和3486.5Da。用單克隆抗體識(shí)別技術(shù)及直接蛋白序列分析技術(shù)，最終確定這些小分子是人α防御素1、2和3。這些小分子只能在正常對(duì)照和長(zhǎng)期生存者中被檢測(cè)到，在處于進(jìn)展?fàn)顟B(tài)的HIV1感染者的刺激培養(yǎng)液中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)α防御素。實(shí)驗(yàn)還證實(shí)人工合成α防御素1和2的混合物(11)也對(duì)HIV-I病毒具有顯著的抑制效應(yīng)(Zhangetal,science,2002,298:995)。張林琦等的研究揭示了為什么少數(shù)感染艾滋病毒的人(約占感染者總數(shù)的-2%)可以自然存活多年不發(fā)病的秘密，同時(shí)也提示人三種人α防御素可能具有重要的協(xié)同作用。[0004]人α防御素1、2和3的發(fā)現(xiàn)和證實(shí)，使科學(xué)家在了解HIV/AIDS的發(fā)病機(jī)制方面邁出了一大步。但要想將防御素真正應(yīng)用于艾滋病治療，尚有很多工作要做。從人體內(nèi)提純的天然防御素具有很強(qiáng)的抗病毒活性，但提取資源有限，成本昂貴。化學(xué)合成法雖可方便地對(duì)多肽進(jìn)行修飾，但也存在成本過(guò)高的問(wèn)題?，F(xiàn)已獲得兩個(gè)商業(yè)化的產(chǎn)品α防御素1和α防御素2，但合成工藝復(fù)雜，且與天然提純品相比純度不夠，包含了許多雜蛋白，抗艾滋病病毒活性較低，僅為提純的天然防御素的1/10至l/20(Zhangetal,science,2002,298995)。因此，通過(guò)基因和蛋白質(zhì)工程技術(shù)來(lái)改善生產(chǎn)效率和產(chǎn)物活性，已成為防御素研究和應(yīng)用的關(guān)鍵。防御素在基因工程領(lǐng)域的應(yīng)用主要表現(xiàn)在兩方面一是研究出高效的細(xì)菌或酵母表達(dá)系統(tǒng)，大量生產(chǎn)防御素，應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域；另一個(gè)方面是分離動(dòng)物或昆蟲的防御素基因，將之應(yīng)用于植物抗病基因工程中(傅榮昭等，高技術(shù)通訊，1996，3:61)。截止目前，孫勇如等已經(jīng)分離出兔防御素基因(科學(xué)通報(bào)，1998,43:1519)，將兔α防御素基因?qū)胄∏蛟?，從轉(zhuǎn)基因小球藻中獲得了有活性的兔防御素NP1，解決了藻類基因工程表達(dá)(專利申請(qǐng)?zhí)?71123446，公開號(hào)CN1203278A；專利申請(qǐng)?zhí)?1121893，公開號(hào)CN1203277A)。但目前國(guó)內(nèi)外均尚無(wú)應(yīng)用大腸桿菌系統(tǒng)生產(chǎn)人α防御素的成功報(bào)道。1993年，Piers等曾將HNPl、昆蟲殺菌肽cecropin/melittin(CEME)雜合肽基因分別與4個(gè)不同的載體蛋白相融合，并在S.aureus中進(jìn)行表達(dá)；對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)量、細(xì)胞定位、蛋白降解情況進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，但遺憾的是沒(méi)得到具有抗菌活性的HNPl蛋白(Piersetal,gene,1993,1347；孫超等，多肽抗生素研究進(jìn)展，http://www.21ray.com/6-tech/lO.html)。因此，生產(chǎn)防御素的大腸桿菌高效表達(dá)體系還有待于進(jìn)一步研究。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是基因表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早、目前應(yīng)用廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)。自二十世紀(jì)七十年代中期Struhl等首次在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了有功能的活性表達(dá)以來(lái)，以質(zhì)粒、乳糖操縱子為基礎(chǔ)建立的大腸桿菌表達(dá)體系不斷得到發(fā)展和完善。與其他系統(tǒng)相比，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚，目標(biāo)基因表達(dá)水平高，培養(yǎng)周期短，抗污染能力強(qiáng)等特點(diǎn)，因而成為分子生物學(xué)研究和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中的重要工具(李育陽(yáng)等，基因表達(dá)技術(shù)，科學(xué)出版社，2001，1-13)。防御素對(duì)大腸桿菌細(xì)胞的毒性以及表達(dá)產(chǎn)物的活性問(wèn)題是限制其在原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)成功的主要原因。人α防御素在其體內(nèi)以特殊的機(jī)制避免對(duì)產(chǎn)生它的細(xì)胞本身的損傷。α防御素是先合成前原蛋白，暫時(shí)封閉其細(xì)胞毒性(ErikaVetal,JClinInvest,1996,97:1624)。另外，成熟的防御素是在嗜天青顆粒中形成，并且很少向外分泌，即使向外分泌，也被胞間液稀釋或與其它蛋白結(jié)合，從而不表現(xiàn)細(xì)胞毒活性。但如同其它多肽抗生素一樣，要用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)這些蛋白就比較困難。由于目標(biāo)蛋白對(duì)宿主本身產(chǎn)生殺滅作用，往往造成表達(dá)體系表達(dá)量低甚至無(wú)表達(dá)。因此，抑制或克服目標(biāo)蛋白對(duì)大腸桿菌本身毒性就成為首要面對(duì)的問(wèn)題。采用適宜表達(dá)方式以及選擇適宜的細(xì)菌株系構(gòu)建工程菌是克服目標(biāo)蛋白毒性以及成功應(yīng)用大腸桿菌系統(tǒng)生產(chǎn)人α防御素最重要的方面。對(duì)分子量較小且產(chǎn)物有細(xì)胞毒性的目標(biāo)基因進(jìn)行融合表達(dá)或串聯(lián)聚合表達(dá)是比較理想的方式。完整的表達(dá)系統(tǒng)由表達(dá)載體和宿主菌兩部分構(gòu)成。目前比較成熟的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)包括Iac和tac表達(dá)系統(tǒng)、PL和I3R表達(dá)系統(tǒng)、T7表達(dá)系統(tǒng)等。T7系統(tǒng)以Novagen公司的pET系列載體以及相應(yīng)的宿主菌(BL21系列)為代表(RobertMierdorfetal,NewsletterofNovagen,1994,1:1_4)，這類表達(dá)系統(tǒng)所用的載體具有可誘導(dǎo)的T7啟動(dòng)子，系統(tǒng)表達(dá)量高(可占細(xì)菌總蛋白的25%以上)，常用610個(gè)組氨酸形成融合蛋白，只增加幾個(gè)氨基酸，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響較小，但是往往本底表達(dá)(也稱滲漏表達(dá))水平較高，和一般菌株匹配不適宜毒性蛋白表達(dá)。與PET系列載體匹配的宿主菌主要是BL21系列，包括BL21、BL21(DE3)、BL21TrxB、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE等。BL21系列菌株具有Ion和ompT蛋白水解酶缺陷的優(yōu)點(diǎn)，可提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性。其中BL21(DE3)pLysS帶有質(zhì)粒pLysS，能編碼T7溶酶。T7溶酶可降低T7啟動(dòng)子調(diào)控的目的基因的本底表達(dá)水平，但不干擾由IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)水平，適宜毒性蛋白表達(dá)。PL和ra表達(dá)系統(tǒng)則是以溫度敏感性PL和ra啟動(dòng)子為中心構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)，成本低廉，但是表達(dá)蛋白容易降解，表達(dá)量低，不適宜毒性蛋白表達(dá)。Iac和tac表達(dá)系統(tǒng)以Amersham公司的pGEX系列載體為代表，在tac啟動(dòng)子、Lac操縱基因及SD序列下游相繼是谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GlutathioneS-transferaseGeneFusion，GST)基因序列以及多克隆位點(diǎn)?？寺〉耐庠椿蚺cGST基因相連，表達(dá)產(chǎn)物為GST融合蛋白。帶有GST標(biāo)簽的載體選擇了大腸桿菌偏愛的密碼子，容易表達(dá)毒性外源蛋白，并且純化方便。GST基因序列存在可避免mRNA復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，增加轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定性。因此，GST的存在有利于克服因細(xì)胞異源蛋白對(duì)宿主細(xì)胞本身殺滅而致的低效表達(dá)或無(wú)表達(dá)現(xiàn)象。另外，GST屬于多功能蛋白，有助于穩(wěn)定重組蛋白的折疊，可在溫和條件下除去，不易破壞目標(biāo)蛋白的功能及其抗原性(TheRecombinantProteinBook,Amersham,www.apbiotech.com)(PickettCB,etal,AnnRevBiochem，1989，58:743)。BL21系列菌株也適用于這類載體。改善表達(dá)產(chǎn)物的活性是利用工程菌成功生產(chǎn)藥用蛋白的另一重要方面。以包涵體形式表達(dá)目標(biāo)蛋白產(chǎn)量一般較高，但是融合蛋白復(fù)性艱難，活性產(chǎn)物得率很低。因此，在胞內(nèi)直接表達(dá)有生物活性的蛋白質(zhì)具有重要意義。雖然包涵體形成的理化因素仍然不清楚，但通過(guò)低溫培養(yǎng)、培養(yǎng)基適宜PH值的選擇及在培養(yǎng)體系中添加一些提高滲透壓的物質(zhì)等措施都能有助于形成有活性的蛋白質(zhì)。例如，YumikoShirano等在37°C培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)，得到?jīng)]有活性的Lipoxygenase，但在15°C條件下誘導(dǎo)16小時(shí)，得到了有活性的可溶蛋白(FEBSLetterS，1990，295:10)。2530°C是常用的培養(yǎng)溫度，在此溫度下細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，溶氧水平較高，太低溫度則會(huì)使降溫成本提高。另外，有報(bào)道在有甜菜堿的條件下高滲透壓有利于形成可溶的有活性蛋白質(zhì)。目前，應(yīng)用大腸桿菌系統(tǒng)生產(chǎn)真核來(lái)源藥用蛋白已取得了很大進(jìn)展。據(jù)報(bào)道，國(guó)際上已批準(zhǔn)的重組蛋白藥物中有34種采用該系統(tǒng)生產(chǎn)，在我國(guó)已用該系統(tǒng)生產(chǎn)人生長(zhǎng)素、胰島素、人組織型纖維酶原激活劑、白介素等。國(guó)內(nèi)關(guān)于人α防御素的研究也已取得了一些進(jìn)展。李景鵬等通過(guò)化學(xué)合成途徑獲得了人α防御素cDNA克隆(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，26383)，劉水平等也克隆了人類防御素基因cDNA片段(湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，27:17)，但是，目前以大腸桿菌系統(tǒng)為工具生產(chǎn)人α防御素，特別是協(xié)同生產(chǎn)三種防御素的技術(shù)尚未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌混合培養(yǎng)協(xié)同生產(chǎn)人α防御素蛋白的方法，包括用于該方法的適宜工程菌，系統(tǒng)部件組合以及主要技術(shù)路線。[0012]本發(fā)明提供的利用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌混合培養(yǎng)生產(chǎn)人α防御素蛋白的方法包括以下步驟1.使用由人α防御素成熟肽編碼序列經(jīng)優(yōu)化后，化學(xué)合成獲得的是mHNPl、mHNP2、mHNP3序列mHNPl1GCCTGCTATTGCCGTATTCCAGCCTGCATTGCAGGCGAA40CGTCGTTATGGCACCTGCATCTACCAGGGCCGTCTCTGG79GCATTCTGCTGCmHNP21TGCTATTGCCGTATTCCAGCCTGCATTGCAGGCGAA40CGTCGTTATGGCACCTGCATCTACCAGGGCCGTCTCTGG79GCATTCTGCTGCmHNP31GACTGCTATTGCCGTATTCCAGCCTGCATTGCAGGCGAA40CGTCGTTATGGCACCTGCATCTACCAGGGCCGTCTCTGG79GCATTCTGCTGC2.將mHNPl、mHNP2、mHNP3成熟肽編碼序列構(gòu)建到篩選出的抗細(xì)胞毒性的tac型原核表達(dá)載體PGEX4T1中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒分別為pGEX4Tl-mHNPl、pGEX4Tl_mHNP2、pGEX4Tl-mHNP3(見圖1、圖2、圖3)。3.將上述重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞BL21(DE3)pLysS,構(gòu)建成mHNP生產(chǎn)工程菌PHS1、PHS2、PHS3；4.將三種工程菌等量混合，在低溫條件下化學(xué)誘導(dǎo)混合工程菌表達(dá)異源蛋白。它們的特點(diǎn)是能抵抗表達(dá)蛋白對(duì)細(xì)胞的毒性，從而使表達(dá)量顯著提高。5.三種工程菌進(jìn)行等量混合培養(yǎng)，經(jīng)化學(xué)物質(zhì)異丙基硫代半乳糖苷的誘導(dǎo)表達(dá)人α防御素，可同時(shí)生產(chǎn)出三種接近天然的人α防御素蛋白的混合蛋白。6.α防御素蛋白的混合蛋白，可能對(duì)病原菌的抗性具有協(xié)同的作用，這種人α防御素可應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域。本發(fā)明所使用的DNA序列是依據(jù)已知三種人α防御素mRNA序列及氨基酸組成(Zhangetal，science，2002，298:995)，經(jīng)基因優(yōu)化設(shè)計(jì)而來(lái)，可翻譯出正確的人α防御素1氨基酸序列。這種經(jīng)過(guò)修飾的序列用大腸桿菌喜好密碼子替換了原序列中的稀有密碼子，具有更高的翻譯效率。除添加起始密碼子ATG外，在三種改造DNA序列中還使用了包括大腸桿菌常用終止密碼子TAA在內(nèi)的雙終止子，并配置了有利終止的側(cè)翼序列，TAAG的序列格式將最大限度地防止不良終止效應(yīng)的發(fā)生，為高效表達(dá)奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明在基因修飾和反復(fù)篩選的基礎(chǔ)上，選擇帶有tac啟動(dòng)子和GST標(biāo)簽序列的原核類表達(dá)載體(PGEX系列載體，Amersham公司產(chǎn)品)，將優(yōu)化了的基因序列GST基因序列之后BamHI和SalI位點(diǎn)之間，從而構(gòu)建了高效融合性表達(dá)載體。這種構(gòu)建方式利用了tac啟動(dòng)子的高效性，GST基因?qū)δ繕?biāo)蛋白基因轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定作用以及對(duì)目標(biāo)蛋白活性暫時(shí)的“封閉性”，一定程度上抑制和克服了目標(biāo)蛋白對(duì)大腸桿菌細(xì)胞本身的毒害作用，使以大腸桿菌為工具進(jìn)行人防御素生產(chǎn)成為可能。表達(dá)的任何蛋白質(zhì)可經(jīng)凝血酶切處理，獲得單純的目標(biāo)蛋白。本方法將獲得的重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)pLysS內(nèi)，組成完整的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。Ion和ompT蛋白水解酶缺陷型菌株的使用保證了翻譯蛋白的穩(wěn)定性，BL21(DE3)pLysS菌株可能降低本底轉(zhuǎn)錄水平，抑制了異源蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的毒害作用，利于人防御素基因的表達(dá)。本方法將三種可編碼人α防御素的工程菌混合在一起，在混合培養(yǎng)體系中化學(xué)誘導(dǎo)同時(shí)表達(dá)三種人α防御素蛋白。這些化學(xué)物質(zhì)包括異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-Beta-D-Thiogalactopyranoside,IPTG)、乳糖等。IPTG誘導(dǎo)效率高，可滿足抗體制備、生化性質(zhì)研究、結(jié)構(gòu)研究等需要，而乳糖誘導(dǎo)法以其安全性適宜于制備用于醫(yī)療目的重組人防御素。本發(fā)明首次提供了一種利用基因工程菌生產(chǎn)人α防御素混合物的方法，并提供了適宜該方法的轉(zhuǎn)基因工程菌。與目前應(yīng)用的化學(xué)合成、人工提取人防御素以及藻類生產(chǎn)動(dòng)物防御素的技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點(diǎn)(1)本法提供的轉(zhuǎn)基因工程菌構(gòu)建過(guò)程經(jīng)過(guò)優(yōu)化篩選，系統(tǒng)結(jié)構(gòu)完好，表達(dá)效率高。產(chǎn)物容易加工提純，開發(fā)周期短，適宜于發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)。(2)利用本法可一次性生產(chǎn)三種人α防御素，有利于發(fā)揮三種同源蛋白的協(xié)調(diào)作用，較單一防御素蛋白更適宜于醫(yī)學(xué)研究或臨床應(yīng)用。(3)本法提供技術(shù)產(chǎn)品為人體活性多肽，應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域時(shí)毒副作用可能性小，安全，不易發(fā)生人體免疫應(yīng)答反應(yīng)及因此而導(dǎo)致的藥效降低等現(xiàn)象。本發(fā)明首次提供了應(yīng)用基因工程菌同時(shí)生產(chǎn)三種人α防御素的技術(shù)方法，通過(guò)低溫誘導(dǎo)、融合表達(dá)方式生產(chǎn)出了有活性的人防御素，為α防御素的基因工程生產(chǎn)提供了新的途徑，將能在一定程度上解決人防御素蛋白來(lái)源不足的現(xiàn)狀。研究成果可滿足生產(chǎn)人防御素生化性質(zhì)以及制備相應(yīng)抗體等研究應(yīng)用的需要，也使人防御素的藥用開發(fā)和規(guī)模生產(chǎn)成為可能。新型藥物的大規(guī)模生產(chǎn)為目前難以醫(yī)治的疾病得以有效治療，特別是對(duì)艾滋病的控制和治療提供了新的思路和方法。圖1pGEX4Tl_mHNPl圖2pGEX4Tl_mHNP2圖3pGEX4Tl-mHNPl圖4mHNPl片段合成示意圖F1、F2為正義鏈片段，F(xiàn)3、F4為反義鏈片段。正義鏈片段和反義鏈片段相互錯(cuò)位交搭。圖5pUCmT-mHNPl陽(yáng)性克隆PCR鑒定。1-5及7-10均為陽(yáng)性菌落。6:DNAmarker；圖6pGEX4Tl載體圖譜圖7pGEX4Tl-mHNPl重組菌落PCR鑒定。1-5，7，9-10陽(yáng)性菌落[0052]6:DNAmarker,8假陽(yáng)性菌落圖8由P2、P4引物擴(kuò)增出的HNP2片段1:DNAmarker；2-7:PCR樣本圖9pGEX4Tl-mHNP2重組菌落PCR鑒定1-4陽(yáng)性菌落，5:DNAmarker圖10由P3、P4引物擴(kuò)增出的mHNP3片段1-4=PCR樣本號(hào)，5:DNAmarker圖11pGEX_mHNP3工程菌PCR鑒定1-4陽(yáng)性菌落，5:DNAmarker圖1215%SDS-PAGE鑒定人α防御素基因工程菌菌體中目的蛋白表達(dá)1，未誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因菌2h；2，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因菌2h；3，未誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因菌4h；4，蛋白標(biāo)準(zhǔn)；5，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因菌4h；6，未誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因菌6h；7，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因菌6h；8，誘導(dǎo)空載菌6h；9，未誘導(dǎo)空載菌6h。圖13混合培養(yǎng)體系中誘導(dǎo)表達(dá)mHNP蛋白對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響uninducedsample未誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因工程菌樣本，inducedsample誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因工程菌樣本，free-loadedcontrol空載對(duì)照菌。圖14提純mHNP蛋白的抗菌活性鑒定Sa:Staphylococcusaureus,金黃色葡萄球菌；Ecolj:E.coliBL21(DE3)，大腸桿菌BL21(DE3)。具體實(shí)施方式實(shí)施例1人α防御素基因工程菌的制備1、α防御素(HNP)成熟肽編碼序列優(yōu)化設(shè)計(jì)與化學(xué)合成從Genbank中查詢得知HNPl和ΗΝΡ2mRNA序列(NM_004084)、HNP3mRNA序列(NM005217)以及HNPl和HNP2成熟肽氨基酸序列(P59665)、HNP3成熟肽氨基酸序列(P59666)，HNPl、HNP2、HNP3成熟肽編碼序列僅有個(gè)別堿基序列的差異(見表1，斜體表示)，即HNPl前三個(gè)堿基為編碼甘氨酸的GCC，而HNP2缺少此氨基酸，HNP3序列第一個(gè)密碼子是編碼天冬氨酸的GAC。因此，先合成一個(gè)肽的編碼序列，其它的序列通過(guò)PCR方法擴(kuò)增獲得。表1GENBANK中HNP1、HNP2和HNP3成熟肽的編碼序列<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>通過(guò)序列分析，根據(jù)不同生物喜好密碼子及其稀有密碼子的差異性，對(duì)原序列進(jìn)行修飾改造。即剔除HNP中稀有密碼子，將它們替換為大腸桿菌喜好密碼子。為達(dá)到良好的翻譯終止效果，添加了TGA和TAA兩個(gè)終止密碼子，利于目的蛋白在大腸桿菌表達(dá)。修飾后HNP1序列見表2。表2HNP1成熟肽原編碼序列及重新設(shè)計(jì)修飾的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表中斜線部分為替換了的密碼子表3mHNPl寡核苷酸片段的設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>將重新設(shè)計(jì)的HNP1成熟肽編碼序列(以下簡(jiǎn)稱mHNPl)兩條互補(bǔ)鏈分成4個(gè)片段(F1-F4)，互補(bǔ)片段之間相互交搭。交由上海生工生物技術(shù)公司，用亞磷酰胺法，分別予以合成上述片段(見表3及圖4)。檢測(cè)純化后分裝，-20°C備用。合成上述片段后，先對(duì)F2、F4兩片段進(jìn)行5’端磷酸化。即取F2片段和F4各200pm，T4多核苷酸激酶40u，10mmol/LATP5ul,10ul10倍緩沖液[500mMTris_HCI(PH8.0)，IOOmMMgCI2,50mMDTT]，加水補(bǔ)足IOOul體積，37°C反應(yīng)2小時(shí)，80°CIOmin后漸冷至室溫，用酚液(酚氯仿異戊醇=25241)抽提，100%和70%乙醇沉淀，溶于20ulTE中。對(duì)F2和F4片段5’端磷酸化處理后，進(jìn)行4片段(F1-F4)連接反應(yīng)。將4個(gè)片段各200pm，用IOOul連接酶緩沖液溶解在一小管中，其中F2和F4己磷酸化，80°C2min后漸冷至室溫，加入40ulT4DNA連接酶，12°C反應(yīng)24h，連接產(chǎn)物用酚液和乙醇抽提處理。將所得樣品加入1.0%瓊脂糖點(diǎn)樣孔內(nèi)，同時(shí)加入DNAmarker,6080V電泳，紫外透射儀下檢測(cè)，切下目的條帶凝膠，用北京賽百盛基因技術(shù)有限公司UltrapUrePCR產(chǎn)物純化回收試劑盒回收。最后溶解于20ulTE中保存，并命名為mHNPl。2、合成HNP1序列的克隆·(1)載體及菌種pUCm-T克隆載體購(gòu)自上海生工公司。大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存?！?2)工具酶、marker及試劑盒Taq酶、X_gal、IPTG、dNTP、DNAmarker購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司。BamHI.Sall等限制性內(nèi)切酶、DNALigase購(gòu)自大連寶生物工程公司，UltrapurePCR產(chǎn)物純化回收試劑盒由北京賽百盛生物工程公司提供，PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。測(cè)序由上海申友公司完成。(3)mHNPl的引物以步驟1中設(shè)計(jì)的mHNPl序列為模板，利用01igo6.0軟件設(shè)計(jì)如下一對(duì)引物(Pl和P4)Pl5'GCGGGATCC/Ir^GCCTGCTATTGCCGTATTC3'BamHIP45'CGCGTCGACTTATCAGCAGCAGAATGCCCAG3'SalI下劃線部分為酶切位點(diǎn)，斜體為起始密碼子或終止密碼子。交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。(4)回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，連接到T載體上以步驟1化學(xué)合成后連接的mHNPl為模板，經(jīng)P1、P4引物對(duì)擴(kuò)增，PCR在FlexigenePCR儀[Techne(Cambridge)Ltd生產(chǎn)]上進(jìn)行，50ul反應(yīng)體系Taq酶1.Oul(2u/ul)，dNTPs(各10mM)4.0ul，10倍反應(yīng)緩沖液5.0ul[200mMTris-HCI(PH9.0),500mMKCI，20mMMgCI2,1%TritonX-100]，雙端引物(Fl和F4)各2.Oul，模板(mHNPl)(約含IngDNA)2.Oul，剩余體積用滅菌雙蒸水補(bǔ)足。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性lmin，然后94°C變性30s,550C30s，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，最后延伸IOmin補(bǔ)齊末端。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，約為llObp，用回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，與pUCmT載體進(jìn)行連接。IOul連接反應(yīng)體系組成為=T4DNA連接酶Iul，回收PCR產(chǎn)物5ul(約0.2pmol)，pUCmT載體Iul，10倍T4連接酶緩沖液Iul[660mMTris-HCI(PH7.6)，66mMMgCI2,IOOmMDTT，ImMATP],PEG4000lul，滅菌水lul。16°C，過(guò)夜連接。產(chǎn)物命名為pUCmT-mHNPl。按照《分子克隆》(J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯。分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)?？茖W(xué)出版社，2002，p96)中的方法制備DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，按常規(guī)熱激法將上述連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。即將連接液8ul加入放置在冰浴上至剛?cè)诨腄H5a感受態(tài)細(xì)胞200ul中，冰浴30min，然后在42°C恒溫水浴中精確熱激90s，立即取出置于冰浴2min，加入不含任何抗生素的LB培養(yǎng)液，37°C溫浴45min使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)抗生素抗性基因。最后將轉(zhuǎn)化菌液涂在含X-gal和IPTG的氨芐瓊脂平板上，培養(yǎng)過(guò)夜。次日進(jìn)行藍(lán)白班初步篩選。陽(yáng)性菌落篩選程序是從轉(zhuǎn)化平皿中挑取白斑多個(gè)(20個(gè))，另選少量藍(lán)斑(3個(gè))做對(duì)照，接種于含3ml氨芐的LB培養(yǎng)液過(guò)夜。次日提取質(zhì)粒，以藍(lán)斑質(zhì)粒為對(duì)照在白斑質(zhì)粒中挑選電泳條帶大小適合的滯后者，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖5)、BamHI和SalI雙酶切檢測(cè)，均得到預(yù)計(jì)的約lOObp的DNA片段。最后，挑選一個(gè)上述各步鑒定正確的菌落送上海申友公司測(cè)序。序列分析結(jié)果表明，克隆中有預(yù)期的HNP1編碼序列及終止密碼子側(cè)翼序列1GCGGGATCCATGGCCTGCTATTGCCGTATT31CCAGCCTGCATTGCAGGCGAACGTCGTTAT61GGCACCTGCATCTACCAGGGCCGTCTCTGG91GCATTCTGCTGCTGATAAGTCGACGCG將獲得的克隆pUCmT-mHNPl質(zhì)粒做甘油菌_70°C保存。3、HNP1表達(dá)基因工程菌(PHS1)的制備(1)載體及菌種重組質(zhì)粒pUCm-T/HNPl重組質(zhì)粒；大腸桿菌BL21(DE3)pLysS、tac啟動(dòng)子載體pGEX4Tl(Amersham公司產(chǎn)品，質(zhì)粒圖譜見圖6)由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院曾憲坤博士惠贈(zèng)。(2)工具酶、marker及試劑盒DNAmarker購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司。BamHI、Sail等限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購(gòu)自大連寶生物工程公司，UltrapureTMPCR產(chǎn)物純化回收試劑盒由北京賽百盛生物工程公司提供，PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。Molecularweightmarkersproteinskit(pharmaeia17—0446—01),購(gòu)自；！匕京if經(jīng)禾斗生物技術(shù)有限公司。(3)構(gòu)建質(zhì)粒pGEX4Tl-mHNPl用BamHI、SalI酶切已經(jīng)鑒定的pUCmT-mHNPl重組質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用賽百盛UltrapurePCR產(chǎn)物純化回收小片段即mHNP1片段。用BamHI、SalI酶切PEGX4T1，線性化的載體片段分別與回收的mHNP1片段在T4DNA連接酶作用下16°C過(guò)夜，獲得質(zhì)粒PGEX4T1-mHNP1。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞。挑取轉(zhuǎn)化菌落搖動(dòng)培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒后PCR擴(kuò)增(圖7)、BamHI和Sail雙酶切鑒定，并進(jìn)行序列測(cè)定，鑒定正確后，將該轉(zhuǎn)化菌命名為PHS1。4、HNP2和HNP3表達(dá)基因工程菌(PHS2和PHS3)的制備在對(duì)HNP1成熟肽編碼序列進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)HNP2、HNP3成熟肽編碼序列也做相似的修飾。修飾后HNP2和HNP3成熟肽編碼序列(以下分別簡(jiǎn)稱mHNP2、mHNP3)與原序列差異如下表。表4mHNP2、mHNP3與相應(yīng)的成熟肽原編碼序列比較11<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>[0119]表中斜線部分為替換了的密碼子(1)菌種與質(zhì)粒大腸桿菌BL21(DE3)pLysS、pGEX4T1載體(Amersham產(chǎn)品)均為東南大學(xué)醫(yī)院院遺傳中心曾憲坤博士惠贈(zèng)。(2)工具酶及試劑限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶分別購(gòu)自大連寶生物工程公司、上海生工公司、北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司。(3)引物的設(shè)計(jì)與合成分別以mHNP2和mHNP2為模板設(shè)計(jì)兩對(duì)三條PCR引物(即P2-P4，P3-P4)，均由寶生物公司合成。引物序列如下P25'P35'BamHIP45'SalIGCGGGATCCATGTGCTATTGCCGTATTCCAG3'GCGGGATCdGACTGCTATTGCCGTATTCC3'CGCGTCGACTTATCAGCAGCAGAATGCCCAG3'下劃線部分為酶切位點(diǎn)，斜體為起始密碼子或終止密碼子。4.1HNP2基因工程菌(PHS2)的制備(1)擴(kuò)增mHNP2片段除缺少編碼第一個(gè)氨基酸(甘氨酸)的密碼子GCC外，mHNP2基因序列與mHNPl序列完全一致，通過(guò)PCR上游引物(P2)設(shè)計(jì)可以去除該密碼子。因此，以重組質(zhì)粒pUCmT-mHNPl為模板，由P2、P4引物經(jīng)Termocycler(Biometra公司)PCR儀擴(kuò)增約0.lkb的mHNP2(圖8)。反應(yīng)體系為50ul，其中Taq酶1.Oul(2u/ul),dNTPs(10mM)4.Oul,10倍反應(yīng)緩沖液[200mMTris-HCI(PH9.0),500mMKCI,20mMMgCI2,1%TritonX-100]5.Oul,P2和P4引物各2.Oul，模板DNA2.Oul(約lngDNA)，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性lmin,然后94°C變性30s,54°C30s,72°C延伸lmin,共30個(gè)循環(huán)，最后延伸lOmin補(bǔ)齊末端。PCR反應(yīng)后1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)，約為llObp。(2)回收mHNP2片段[0136]用回收試劑盒純化回收l(shuí)OOulPCR產(chǎn)物，溶解于20ul滅菌水中。(3)mHNP2片段與載體的連接將回收的mHNP2PCR產(chǎn)物和pGEX4Tl分別以BamHI和SalI雙酶切，酶切后用PCR純化試劑盒再次進(jìn)行純化回收。將酶切后回收的目的基因和pGEX4T1按體積比51混合進(jìn)行連接。反應(yīng)體系為10ul，即加入目的DNA5ul(0.2pmol),pGEX4Tllul，T4DNA連接酶lul，10倍連接緩沖液[660mMTris-HCI(PH7.6),66mMMgCI2,lOOmMDTT,ImMATP]lul,16°C過(guò)夜連接。得到連接產(chǎn)物pGEX4Tl-mHNP2。(4)重組子的提取及鑒定將連接產(chǎn)物(pGEX4Tl-mHNP2)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)PlysS。取8ul連接產(chǎn)物加入200ul感受態(tài)菌中，0°C冰水浴30min，42°C水浴90s，冰水浴2min，加入800ulLB培養(yǎng)液，37°C振蕩培養(yǎng)lh后涂布于含50mg/ml氨芐抗性的LB板上。用PCR鑒定克隆，電泳結(jié)果顯示，利用P2、P4引物擴(kuò)增出與預(yù)期大小(約0.1Kb)的片段(圖9)。將鑒定的陽(yáng)性克隆抽提質(zhì)粒，并進(jìn)行BamHI和SalI雙酶切鑒定。最后，進(jìn)行測(cè)序分析。用DNAMAN軟件分析證實(shí)克隆序列與設(shè)計(jì)序列完全一致。將鑒定正確的轉(zhuǎn)化菌命名為PHS2。4.2HNP3基因工程菌(PHS3)的制備(l)mHNP3片段的擴(kuò)增mHNP3基因與mHNPl只是第一個(gè)密碼子不同，通過(guò)PCR上游引物(P3)設(shè)計(jì)可以改變?cè)撁艽a子。以重組質(zhì)粒pUCmT-mHNP1為模板，由P3、P4引物經(jīng)Termocycler(Biometra)PCR儀擴(kuò)增約0.1Kb的HNP3成熟肽編碼序列(圖10)。反應(yīng)體系為50ul，其中Taq酶1.Oul(2u/ul)，dNTPs(10mM)4.Oul，10倍PCR反應(yīng)緩沖液5.Oul，P3和P4引物各2.Oul，模板DNA(pUCmT-mHNPl)2.Oul，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性lmin，然后94°C變性30s，54°C30s，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，最后延伸lOmin補(bǔ)齊末端。PCR反應(yīng)后1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)，約為llObp。(2)回收mHNP3片段用回收試劑盒純化回收100ulPCR產(chǎn)物，溶解于20ul滅菌水中。(3)mHNP3片段與載體的連接將回收純化的mHNP3PCR產(chǎn)物和pGEX4Tl分別以BamHI和SalI雙酶切，酶切用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化。將酶切純化的目的基因和pGEX4T1按體積比51進(jìn)行連接。反應(yīng)體系為10ul，即加入目的DNA(mHNP3)5ul，pGEX4Tllul，T4DNA連接酶lul，連接緩沖液lul，16°C，連接過(guò)夜。得到連接產(chǎn)物pGEX4T-mHNP3。(4)重組子的提取及鑒定將連接產(chǎn)物(pGEX4Tl-mHNP3)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)PlysS。取8ul連接產(chǎn)物加入200ul感受態(tài)菌中，0°C冰水浴30min，42°C水浴90s，冰水浴2min，加入800ulLB培養(yǎng)液，37°C振蕩培養(yǎng)lh后涂布于含50mg/mlAmp抗性的LB板上。用PCR鑒定克隆，電泳結(jié)果顯示，利用P3、P4引物擴(kuò)增出與預(yù)期大小(約0.1Kb)的片段(圖11)。將鑒定的陽(yáng)性克隆抽提質(zhì)粒，并進(jìn)行BamHI和SalI雙酶切鑒定。最后，進(jìn)行測(cè)序分析。用DNAMAN分析證實(shí)克隆序列與設(shè)計(jì)序列完全一致。將鑒定正確的轉(zhuǎn)化菌命名為PHS3。實(shí)施例2三種人a防御素的混合表達(dá)及其活性檢測(cè)1、在混合培養(yǎng)體系中化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)人a防御素混合物[0152]將鑒定正確的人a防御素基因工程菌PHS1、PHS2、PHS3分別制備甘油菌并且在含氨芐的LB固體培養(yǎng)基上劃線保存。分別從三種菌板上挑取新鮮的單菌落加入3ml含氨芐的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日取三種菌的過(guò)夜培養(yǎng)物，等量混合?；靹蚝?，按體積接種到新的LB培養(yǎng)基中，在37°C劇烈振蕩培養(yǎng)3h左右至0D_^0.6。向培養(yǎng)菌液中加入1MIPTG，使其終濃度達(dá)到lmmol/L，低溫誘導(dǎo)(30°C)振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)后2h、4h、6h分別取小樣檢測(cè)蛋白表達(dá)，最后離心收集細(xì)胞。同時(shí)設(shè)非誘導(dǎo)對(duì)照以及空載菌對(duì)照。在混合培養(yǎng)體系中對(duì)HNP(包括HNP1、HNP2、HNP3)生產(chǎn)工程菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)菌處理后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果見圖12。其中各泳道樣本為1，未誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因菌2h；2，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因菌2h；3，未誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因菌4h；4，蛋白標(biāo)準(zhǔn)；5，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因菌4h；6，未誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因菌6h；7，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因菌6h；8，誘導(dǎo)空載菌6h；9，未誘導(dǎo)空載菌6h。從圖12可見，有pGEX4Tl-mHNP重組質(zhì)粒(pGEX4Tl-mHNPl、pGEX4Tl-mHNP2、pGEX4Tl_mHNP3)的BL21(DE3)PlysS菌(三種菌體混合物)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)2-6小時(shí)后，菌體裂解物增加了一條約29.5kDa的蛋白電泳條帶(分別見第2、5、7泳道)，和預(yù)計(jì)的蛋白質(zhì)分子量相符(GST蛋白分子量約為26KD，HNP成熟肽約3.5KD)，并且在誘導(dǎo)后2h就有了比較高的表達(dá)量，4h達(dá)到基本達(dá)到最大表達(dá)量。誘導(dǎo)的空載對(duì)照樣(第8泳道)也表達(dá)一個(gè)比融合蛋白略小的蛋白(總分子量28.2KDa，其中GST26.OKda,另加2.2KDa的多克隆位點(diǎn)序列編碼的段肽)。上清液中以及未誘導(dǎo)對(duì)照、空載對(duì)照樣中均無(wú)蛋白分子量大小適合的蛋白條帶。誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間-光密度曲線見圖13。取PHS1、PHS2、PHS3三種菌等量混合接種含氨卞青霉素的100mlLB培養(yǎng)基，37°C振搖培養(yǎng)到0D6000.6。然后，將菌一分為二，一半加1MIPTG(至終濃度lmmol/L)誘導(dǎo)，一半不加IPTG作處理對(duì)照菌。然后在低溫條件下(30°C)振搖培養(yǎng)，分別于lh、2h、4h、6h取3ml菌液測(cè)其0D_值并記錄數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌(未誘導(dǎo))作樣本對(duì)照。結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)基因工程菌未誘導(dǎo)對(duì)照細(xì)菌生長(zhǎng)曲線相比，誘導(dǎo)樣誘導(dǎo)開始時(shí)的0D_值與對(duì)照一致；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)lh后，誘導(dǎo)樣中的大腸桿菌生長(zhǎng)基本沒(méi)有受到太大影響，說(shuō)明此時(shí)期還沒(méi)有HNP融合蛋白產(chǎn)生；2h后，急劇下降，以后基本再?zèng)]有升高，說(shuō)明在誘導(dǎo)2-4h期間，大量產(chǎn)生HNP融合蛋白。上述結(jié)果提示HNP與GST基因融合表達(dá)，產(chǎn)生的融和蛋白仍具有一定的抑菌活性。2、人a防御素混合物的活性檢測(cè)(1)融和蛋白的提取和純化I、目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)以及細(xì)胞抽提物制備將HNP基因工程菌PHS1、PHS2、PHS3菌株分別接種于含Amp的LB培養(yǎng)基37°C活化過(guò)夜。次日按擴(kuò)大培養(yǎng)至0D_^0.6時(shí)等量混合，然后在混合培養(yǎng)菌液中加IPTG至終濃度為lmmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4h(30°C)。于4°C5000g離心15min收獲細(xì)菌。經(jīng)15%SDS-PAGE電泳檢測(cè)以及亞細(xì)胞定位方法(J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯。分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)?？茖W(xué)出版社，2002，pl244)確定目的蛋白主要存在于可溶性胞質(zhì)中。制備細(xì)菌抽提物的方法也參照《分子克隆》(J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯。科學(xué)出版社，2002，pl247)。將每100ml培養(yǎng)菌液離心收獲的菌體沉淀重懸浮在4mlPBS溶液中，加入溶菌酶至終濃度lmg/ml，冰上放置30min。加入10ml0.2%TritonX-100，劇烈振蕩混勻。加入Dnase和Rnase至終濃度5ug/ml，4°C振動(dòng)溫育lOmin。4°C3000g離心30min，去除不溶性細(xì)胞碎片。上清(細(xì)胞裂解物)轉(zhuǎn)移到一新管中，加入DTT至終濃度lmmol/L。上清液用0.45um濾膜過(guò)濾后進(jìn)行親和層析。II、融和蛋白的親和層析用GST瓊脂糖凝膠FF柱(北京卓冠群科技有限公司產(chǎn)品)在AKTAPrime層析儀(Amershanbiosciences產(chǎn)品)上進(jìn)行親和層析，提取融合蛋白。緩沖液組成如下緩沖液l(20mMpH7.4的PBS溶液)0.2MNaH2P0419ml，0.2MNa2HP0481ml加水至1000ml。緩沖液2(50mMTris-鹽酸緩沖液，pH8.0)0.1MTris50ml,0.1M鹽酸29.2ml，3070mg還原型谷胱甘肽，加水至1000ml。親和層析基本步驟如下A、GST瓊脂糖凝膠FF裝柱，0.7X2.5cm，柱床體積為1mlB、用緩沖液1平衡5個(gè)床體積，流速為lml/minC、將10ml細(xì)胞破碎液酵液用緩沖液1稀釋到20ml，0.45iim濾膜過(guò)濾，上樣。流速為lml/minD、用緩沖液1再洗10個(gè)床體積，流速為lml/minE、用緩沖液2洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰III、融合蛋白的裂解以及進(jìn)一步處理在用BCA法測(cè)定融合蛋白的含量后，用凝血酶(Novagen產(chǎn)品)將目的蛋白從GST融合蛋白切下(裂解條件是20°C下16小時(shí))。最后，再次進(jìn)行親和層析把GST和凝血酶去除，而得到純的目標(biāo)蛋白。有關(guān)操作按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。純化后的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，凍干，命名為mHNP并于-80°C保存。(2)抗菌實(shí)驗(yàn)A、菌種及材料金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)大腸桿菌(E.coliBL21(DE3))mHNP溶液配制純化mHNP蛋白混合物用0.01%乙酸分別配置成50yg/ml、100ug/ml、200ug/ml、500ug/ml的濃度。B、瓊脂糖彌散抗菌實(shí)驗(yàn)按照J(rèn)effreyTurner等(AntimicrobialAgentsAndChemoththerapy,1998,42(9))以及劉文超等(第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)。1997:18(6)525-527)進(jìn)行。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期E.coli(BL21(DE3))以及金黃色葡萄球菌各3X106CFU，各加入16ml42°C滅菌瓊脂培養(yǎng)基中(含營(yíng)養(yǎng)肉湯粉4.8mg，低電滲瓊脂糖160mg，0.02%TTOEN20，以lmmol/LPH7.4PBS配制)。混勻后分別倒入兩個(gè)直徑為14.5cm培養(yǎng)皿中，用打孔器在膠上打孔(直徑為3mm)，分別加入不同濃度的樣品5ul，濃度分別為HNP為50iig/ml、100ug/ml、200ug/ml、500ug/ml。陰性對(duì)照孔加0.01%乙酸。將平皿放入37°C溫箱中溫育3h，再鋪以16ml42°C滅菌瓊脂培養(yǎng)基，于37°C繼續(xù)溫育18h。以考馬斯亮藍(lán)染色(考馬斯亮藍(lán)R2502mg，甲醇27ml，甲醛15ml，水63ml)24h，活菌著藍(lán)色，死菌不著色。觀察以加樣孔為中心的殺菌環(huán)大小。C、結(jié)果用瓊脂糖彌散抗菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mHNP的殺菌活性。殺菌環(huán)大小表示其殺菌活性的強(qiáng)弱。結(jié)果見圖14。純化后的mHNP在50ug/ml的濃度就表現(xiàn)出較高的殺菌活性，隨著濃度增加而活性增強(qiáng)。不同菌株對(duì)防御素的敏感性有差異，對(duì)大腸桿菌的作用比對(duì)金黃色葡萄球菌的作用略強(qiáng)。SEQUENCELISTING<110>甘肅亞盛鹽化工業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司<120>基因工程菌混合培養(yǎng)生產(chǎn)三種人a防御素的方法<160>3<170>PatentInversion3.1<210>1<211>90<212>DNA<213>Homosapiens<400>1gcctgctattgccgtattccagcctgcattgcaggcgaacgtcgttatggcacctgcatc60taccagggccgtctctgggcattctgctgc90<210>2<211>87<212>DNA<213>Homosapiens<400>2tgctattgccgtattccagcctgcattgcaggcgaacgtcgttatggcacctgcatctac60cagggccgtctctgggcattctgctgc87<210>3<211>90<212>DNA<213>Homosapiens<400>3gactgctattgccgtattccagcctgcattgcaggcgaacgtcgttatggcacctgcatc60taccagggccgtctctgggcattctgctgc9016權(quán)利要求一種利用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌混合培養(yǎng)生產(chǎn)具有生物活性人α防御素蛋白的方法，其中包括使用人α防御素成熟肽優(yōu)化編碼序列mHNP1、mHNP2和mHNP3，分別將所述三序列構(gòu)建到適宜的tac型表達(dá)載體pGEX4T1中，再分別將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到篩選出的抗細(xì)胞毒性的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中，從而得到含外源基因的三種工程菌株P(guān)HS1、PHS2和PHS3，最后將獲到的三種工程菌株混合培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)人α防御素蛋白，其中，mHNP1、mHNP2、mHNP3序列分別為mHNP11GCCTGCTATTGCCGTATTCCAGCCTGCATTGCAGGCGAA40CGTCGTTATGGCACCTGCATCTACCAGGGCCGTCTCTGG79GCATTCTGCTGCmHNP21TGCTATTGCCGTATTCCAGCCTGCATTGCAGGCGAA40CGTCGTTATGGCACCTGCATCTACCAGGGCCGTCTCTGG79GCATTCTGCTGCmHNP31GACTGCTATTGCCGTATTCCAGCCTGCATTGCAGGCGAA40CGTCGTTATGGCACCTGCATCTACCAGGGCCGTCTCTGG79GCATTCTGCTGC。2.將權(quán)利要求1所述序列mHNPl、mHNP2和mHNP3分別構(gòu)建到篩選出的抗細(xì)胞毒性的tac型原核表達(dá)載體pGEX4Tl中所獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX4Tl-mHNPl、pGEX4Tl_mHNP2和pGEX4Tl-mHNP3。3.將權(quán)利要求2所述的pGEX4Tl-mHNPl、pGEX4Tl-mHNP2和pGEX4Tl_mHNP3分別轉(zhuǎn)入到抗細(xì)胞毒性的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中所獲得的三種工程菌株P(guān)HSl、PHS2和PHS3，它們的特點(diǎn)是能抵抗表達(dá)蛋白對(duì)細(xì)胞的毒性，從而使表達(dá)量提高。專利摘要本發(fā)明涉及一種利用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌混合培養(yǎng)生產(chǎn)具有生物活性的人α防御素蛋白的新方法。包括使用人α防御素成熟肽優(yōu)化編碼序列，將該序列構(gòu)建到適宜的tac型表達(dá)載體pGEX4T1中，再將其轉(zhuǎn)化入篩選出的抗細(xì)胞毒性的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中，從而構(gòu)建成含外源基因的三種工程菌株P(guān)HS1、PHS2、PHS3。它們的特點(diǎn)是均能抵抗表達(dá)蛋白對(duì)細(xì)胞的毒性，從而使表達(dá)量顯著提高。將三種工程菌進(jìn)行等量混合培養(yǎng)，經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)人α防御素，可同時(shí)生產(chǎn)出三種人α防御素蛋白的混合蛋白。用上述方法生產(chǎn)的蛋白可能對(duì)病原菌的抗性具有協(xié)同的作用。用本法生產(chǎn)α防御素可應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域。文檔編號(hào)C12P21/02GKCN1904036B發(fā)布類型授權(quán)專利申請(qǐng)?zhí)朇N200510112982公開日2010年9月1日申請(qǐng)日期2005年10月18日發(fā)明者周長(zhǎng)生,李春麗,陳其新,陳正華申請(qǐng)人:甘肅亞盛鹽化工業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan專利引用(1),非專利引用(3),