專利名稱:苧麻微衛(wèi)星dna標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子標(biāo)記技術(shù)，具體涉及一種苧麻的DNA分子遺傳標(biāo)記。
背景技術(shù)：
微衛(wèi)星(又稱為簡單重復(fù)序列，SSR)是由1～6個核苷酸組成的短序列串聯(lián)重復(fù)多次而組成的一段DNA，廣泛分布于真核基因組中。微衛(wèi)星序列兩側(cè)有保守的DNA序列，根據(jù)其兩側(cè)的保守序列設(shè)計(jì)引物，可用PCR擴(kuò)增出微衛(wèi)星位點(diǎn)的序列。由于微衛(wèi)星中重復(fù)單元的重復(fù)的次數(shù)不同，因而擴(kuò)增出的微衛(wèi)星序列的長度呈現(xiàn)多態(tài)性(即SSRLP或SSR)。由于其具有多態(tài)性豐富、重復(fù)性高、共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位、遺傳關(guān)系分析，品種鑒定等領(lǐng)域。如用微衛(wèi)星標(biāo)記分析苧麻品種的親源關(guān)系(Zhou等，2005，Progress in Natural Science，15137-142)、用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記進(jìn)行豬品種分類的專利申請“適于豬品種分類的豬微衛(wèi)星DNA標(biāo)記”(公開號CN 1370834A)。
苧麻(又稱為“中國草”，種名為Boehmeria nivea(L.)Gaud)屬于蕁麻科苧麻屬，是我國重要的纖維經(jīng)濟(jì)作物。苧麻的品種分類、遺傳關(guān)系分析等一般是根據(jù)形態(tài)、生理指標(biāo)進(jìn)行，準(zhǔn)確度低、且受生長季節(jié)、發(fā)育時期等的限制。苧麻的分子標(biāo)記的研究起步較晚，有研究者嘗試用RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)標(biāo)記進(jìn)行了苧麻品種親源關(guān)系分析，取得了成功(郭安平.RAPD.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，1999.)。但是，RAPD標(biāo)記在絕大多數(shù)情況下是顯性標(biāo)記，不能區(qū)別純合基因型與雜合基因型。如何解決苧麻品種分類、遺傳關(guān)系分析中存在的準(zhǔn)確度低及受生長季節(jié)、發(fā)育時期限制的問題，是開展苧麻研究迫切需要解決的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在分離克隆微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，建立苧麻的微衛(wèi)星DNA的技術(shù)體系并利用這些分子標(biāo)記進(jìn)行品種分類、遺傳關(guān)系分析和輔助育種。
實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)方案包括苧麻(CT/AG)n微衛(wèi)星富集文庫的構(gòu)建、含微衛(wèi)星序列的陽性克隆的篩選及測序，得到15個含有(CT/AG)n微衛(wèi)星克隆，確定了15個多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星標(biāo)記BN19、BN20、BN21、BN22，BN23，BN24、BN25、BN26、BN27、BN28、BN29、BN30、BN31、BN32、BN33；BN19為674個核甘酸、BN20為571個核甘酸、BN21為653個核甘酸、BN22，BN23，BN24均為760個核甘酸、BN25為529個核甘酸、BN26為472個核甘酸、BN27為338個核甘酸、BN28為366個核甘酸、BN29為542個核甘酸、BN30為670個核甘酸、BN31為1068個核甘酸、BN32為649個核甘酸、BN33為326個核甘酸。



圖1是用BN19位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增25個苧麻品種DNA的PAGE電泳圖圖2是用BN20位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增25個苧麻品種DNA的PAGE電泳圖圖3是用BN21位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增25個苧麻品種DNA的PAGE電泳圖圖4是用BN22位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增25個苧麻品種DNA的PAGE電泳圖圖5是用BN23位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增25個苧麻品種DNA的PAGE電泳圖圖6是用BN24位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增25個苧麻品種DNA的PAGE電泳圖圖7是用BN25位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增25個苧麻品種DNA的PAGE電泳圖圖8是用BN26位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增25個苧麻品種DNA的PAGE電泳圖圖9是用BN27位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增25個苧麻品種DNA的PAGE電泳圖圖10是用BN28位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增25個苧麻品種DNA的PAGE電泳圖圖11是用BN29位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增25個苧麻品種DNA的PAGE電泳圖圖12是用BN30位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增25個苧麻品種DNA的PAGE電泳圖圖13是用BN31位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增25個苧麻品種DNA的PAGE電泳圖圖14是用BN32位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增25個苧麻品種DNA的PAGE電泳圖圖15是用BN33位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增25個苧麻品種DNA的PAGE電泳圖具體實(shí)施方式
1苧麻(CT/AG)n微衛(wèi)星富集文庫的構(gòu)建(1)按郭安平等方法(參見郭安平等，1997，中國麻作，194-10)提取苧麻基因組DNA。用限制性內(nèi)切酶Mse I酶切苧麻基因組DNA，酶切產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠上電泳，紫外光下切下300-1000bp大小的DNA片段并用凝膠回收試劑盒(購自Qiagen公司)純化回收的酶切產(chǎn)物。
(2)將堿基互補(bǔ)的寡核苷酸PHC-1(5’-AGATGGAATTCGTACACTCGT-3’)和磷酸化的寡核苷酸PHC-2(5’-phos-TAACGAGTGTACGAATTCCATCT-3’)等摩爾混合，95℃變性5分鐘，60℃退火1小時，形成具有MseI粘性末端的接頭。
(3)將酶切產(chǎn)物和接頭用T4DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物用等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提一次，離心收集上清液。在上清液中加0.3M醋酸鈉(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉淀，70％乙醇清洗一次，真空抽干DNA后溶于50μl無菌水中。
(4)用生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針(CT)15與連接產(chǎn)物DNA片段雜交。具體操作為在總體積100μl雜交液(6×SSC，0.1％SDS)中加入500ng連接產(chǎn)物和100pmol生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針，并在95℃下變性10min，60℃雜交1小時。
(5)加入100μl(10μg/μl)磁珠(Dynabeads M-280，購自Dynal Biotech公司)，并在室溫放置30分鐘。
(6)用磁鐵吸附磁珠，棄上清。磁珠用400μl洗滌緩沖液(6×SSC，0.1％SDS)在60℃下洗滌15分鐘，然后在室溫下用分別用2×SSC和1×SSC溶液洗滌兩次，并棄上清。
(7)最后加入50μl無菌水，在90℃下保溫10分鐘，小心吸取上清，上清液即為含有(GA)n重復(fù)序列的單鏈DNA片段。以PHC-1為引物，以單鏈DNA片段為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得雙鏈目的片段。
(8)將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接到pMD18-T載體(購自大連寶生物公司)上，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化菌液涂抹在含有IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。
2.含微衛(wèi)星序列的陽性克隆的篩選、測序及微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)(1)挑取白色菌落并接種到3ml LB培養(yǎng)液中，于37℃培養(yǎng)過夜，然后提取質(zhì)粒。
(2)質(zhì)粒DNA為模板，采取PIMA方法(參見Lunt等，1999，Molecular Ecology，8891-894)篩選含有(CT/AG)n微衛(wèi)星序列的陽性克隆。
(3)將陽性克隆測序，分析是否含有(CT/AG)n重復(fù)序列。通過測序，共得到了16個含(CT/AG)n微衛(wèi)星序列的陽性克隆。
(4)根據(jù)微衛(wèi)星重復(fù)序列兩側(cè)的保守序列設(shè)計(jì)引物。
3.利用苧麻微衛(wèi)星DNA標(biāo)記分析苧麻品種間的遺傳差異將上述微衛(wèi)星標(biāo)記用于25個苧麻品種的分類，確定了15個多態(tài)性豐富、適于苧麻品種分類的微衛(wèi)星標(biāo)記BN19、BN20、BN21、BN22，BN23，BN24、BN25、BN26、BN27、BN28、BN29、BN30、BN31、BN32、BN33(表1)。具體操作過程如下(1)按郭安平等方法(參見郭安平等，1997，中國麻作，194-10)提取各個苧麻品種的DNA作為模板，進(jìn)行PCR。
(2)分別用BN19、BN20、BN21、BN22，BN23，BN24、BN25、BN26、BN27、BN28、BN29、BN30、BN31、BN32、BN33。15個位點(diǎn)的15對引物(引物序列見表1)擴(kuò)增這25個品種苧麻的DNA。
(3)將PCR產(chǎn)物在6％變性聚丙烯凝膠上電泳，然后進(jìn)行銀染并拍照，得到圖1-18。
(4)結(jié)果分析每個樣品的擴(kuò)增條帶按有或無記錄，擴(kuò)增條帶存在時賦值為1，否則賦值為0。采用SPSS10.0 for windows統(tǒng)計(jì)分析軟件中的系統(tǒng)聚類分析程序，距離測量選用相關(guān)系數(shù)距離法，用類間平均連鎖法(Between-groups linkage)進(jìn)行聚類分析并建立系統(tǒng)樹。
具體分析方法參見《系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)中的分子標(biāo)記》(鄒喻蘋、葛頌、王曉東編，科學(xué)出版社，2001年)中的方法進(jìn)行。
由附圖1-15可看出，本發(fā)明的15個微衛(wèi)星點(diǎn)的序列長度在供試的25個品種中都出現(xiàn)多態(tài)性，由此可見，本發(fā)明的這15個微衛(wèi)星標(biāo)記能用于苧麻的品種分類和遺傳關(guān)系分析。
表1引物特性表引物序列，退火溫度，片段大小


表1中F表示5’端引物，R表示3’端引物。
本發(fā)明提供了15個苧麻微衛(wèi)星位點(diǎn)的DNA序列及擴(kuò)增上述15個苧麻微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物序列和擴(kuò)增方法，15個苧麻微衛(wèi)星位點(diǎn)用于苧麻品種分類、遺傳關(guān)系分析和標(biāo)記輔助育種，重復(fù)性好，是一種可靠有效的分子標(biāo)記。
序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所<120>苧麻微衛(wèi)星DNA標(biāo)記<160>13<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>674<212>DNA<213>苧麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)<220>
<221>重復(fù)單元<222>(193)..(272)<220>
<221>重復(fù)單元<222>(441)..(456)<400>1taaattgtga aggccatttt gggccttcac tttgttgaat gcccaaccca tttatgggcc 60taacagcaag aaagctgtga aggctatttt cgaccttgtt ctagcgcctc ataagtggct 120aacgcccatt tgtatcttgg ccaaatgtgt aagaaggcct tgaacctagt agtgggccac 180ttaattactc aaagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag 240agagagagag agagagagag agagagagag aggggttttc tgagatgggc tagctcaaag 300tcaggtgggc ctggcgttgg cccgaaatga ccaaactcga cccgacccgg aagtgaccaa 360cctcgggtca agaagtgaca cgtggacaga agtacctaac tgtcagcctc aggtaatttc 420atggaagtgg ataaagaaac agagagagag agagagcgcg agattttagc gccttttaac 480cagacacaac cgttccaagt tttgaaaagc gctataaggg tgaatctgct ccacgacaga 540
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<221>重復(fù)單元<222>(340)..(411)<400>2taaggcttgt tggacctcca agtgagtccc taatacttat tataatatat tatatgttca 60aatactcagt tgggatcaaa acaactttgt tagagtcgct tcggagccaa aaaactattt 120tgaaggctat atttcgacaa aactagttat aacgatttac tttttgcgcg aaataaattt 180ttaagcttgg agtagtcaag agtggttgaa gctctaacca ctagagattt tgagaagcgc 240acagtatgag cgaaaatggg cttgtgggtt ttggtgtaga tggcaaagga aggtgaagaa 300caagcgtaga atgtcgaagc agagaacgcc atcgaagggg agagagagag agagagagag 360agagagagag agagagagag agagagagag aattctagaa aatctcttac ttgcttttta 420cttgtaatct ccagattagc aaagtcgaca cgtggcgcaa cggacatccc gagttgggat 480acccagtcac gtgcctcacg tgaagttggg acaaaatttt gtcccaacat ttacatttag 540cataagatag tgttactgtg atatcccgat t 571<210>3<211>653<212>DNA<213>苧麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)<220>
<221>重復(fù)單元<222>(32)..(36)<220>
<221>重復(fù)單元<222>(309)..(328)<220>
<221>重復(fù)單元<222>(328)..(363)<400>3caagtgaata tcaagcatat agcttcttct ttctctctct cgtttccctt tttcccttct 60tttcaggaca tttcagatac tttctggttt tatccaatgt tgcacaaaag aaaatatgat 120tcactaacat gtcaatacgg gaaagagaac tcaatcaaat caaatcaaat caaacgatat 180cacagacaac aatcacgtat catgaattac tggtcacaca tattcttgtg atagtcaaga 240ctagatcaag aaatcatgca ttttcctttt atacatagca gagaaaacct tagacttgta 300tatatgtctg tgtgtgtgtg tgtgtgtgag agagagagag agagagagag agagagagag 360agagagagag agagagagag agaattttgc acgtaactgg caataattgg ccgtgtattc 420caaaaaactt ggaaaatgaa ggcatagcca aaagcatctt caatcttcat ctccggggtc 480gattggtaat ttacacaatc ttcttcttat gatatgttat tgtttgatca aagaaatttt 540atgttgaacg atttttcatt gctgtttata acttcaggga aattacagaa atggacgctt 600catgtcctga ttatgattat catctttacc ctttgaccag cttgcagatt ggg 653<210>4<211>760<212>DNA<213>苧麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)<220>
<221>重復(fù)單元<222>(601)..(658)<400>4
taataataaa caataataat aataataata atcacctagc actggggact cttctgggta 60gctggggctc gagctcagtg ggcaagccca ggaagccatt gaagcggtcg aaggtcacgt 120gcgacacgtg cctgacctct gtgggccagc tgatctccaa cgccgacgac gaccccgacg 180ccgacgccga cgacgacgtc gacgacacgt cgtctctctc gacgctgcat gtgactatgg 240acttcctcag agccgtcacc agcacatcca cgatcgcgaa ctgatgagag ccattgccgt 300cgtctctgcc attatcgccg ccgtggtaaa gccgagcctt gctgctaaac ggcgtcgtca 360cggggttgta caacgcctcg tcttcgccgt cttcgtacaa ttcgttctcc gactcttctt 420cttcttcttc ttcttcttcg tcggattctt gttcgtctat gaagataggg ctgggtgggg 480ccgtgttgaa ctcggcgagc ccgcaagatt ttgaccggaa aagccgagtc atggcgagag 540gtcaagatca gagaaaccaa aacagagtag tgtttgtgtg tttgatttgt tttgagagtt 600gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaag 660agccggcctt ggaagaaaca agaaggagaa gagaaaagct tgatttttcc aagctaaaac 720gtaaggtaac ttagccagct tttcttatag tttgagtttt 760<210>5<211>529<212>DNA<213>苧麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)<220>
<221>重復(fù)單元<222>(306)..(347)<400>5taacaactca ccactgtgat ggaccaattg actcatcgtc aacagaatga ttgatcggct 60cactttacaa cgatcggtcg gctccttgca atgaccgatt ggtccagttg gctcgtcacc 120gacatgatga cgagttggtt ctccttctca acgttagatt ggctcgcttt ctggccacca 180acataatgat taaataaatt ttattctctc tcaactcata ccaataatta cttcacaaat 240
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<221>重復(fù)單元<222>(305)..(318)<220>
<221>重復(fù)單元<222>(335)..(348)<400>6taacccaact caagctgaag aaacttattc aatggtcacc gctaaccgct tttggtccca 60aatctttggg gttgcttttt ccaataaacg ttggttacat ttctttatgt tatttgtacc 120agtcactggt ttatggatga gtgctcttgg agtagtcggt ctggctttga atctacgtgc 180ctatgacttc gtttctcaag aaatccgtgc agcggaagat cctgaatttg agactttcta 240cacaaaaaat atcctcttaa tttgttgttt gtgtgtcagt gtttgtggtg atttcagggg 300agacagagag agagagagat tgtgagaaag agaaagagag agagagagat gaaagtgaag 360gctgaattat tggaaagata gatacagaga catgtcgttt gtgggttctg agttggaatt 420ggttgagata taatcatgcc ggccaatggc aatcacggaa agtttagttt tt 472<210>7<211>338<212>DNA
<213>苧麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)<220>
<221>重復(fù)單元<222>(220)..(235)<400>7taagatgtac caaagaaatt ggggggccag agaagcacaa gagagaggct aatctggaca 60taagaacccc caacactttg gaagtggaat caatatatgc ctctagaaca aagccatcaa 120gaaatcgatc atcagatctc aaacccttga agccgaaagg agaggcattt atactcaacc 180cacgcacaca gagccaaaat gaaaattgct ttacaccaaa gagagagaga gagagggagt 240aatgattcga ggcttagtga agagtagagt tgtgaaggat atttataggg tggcctaaaa 300ccctaggttg tgaacgatgc tgagaagata tcagctgc 338<210>8<211>366<212>DNA<213>苧麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)<220>
<221>重復(fù)單元<222>(264)..(273)<220>
<221>重復(fù)單元<222>(291)..(300)<400>8acaaaacctc cccaatcaat ttcaagtttg gaggccgacg atggtgaggt ggatggctgc 60ggcggctgtg cgattttcgg catagtccga cagtttccga tgacaaacca ctgctcaaaa 120tattcctctc gtcgagagct ttccaacggt accaagtatg catcaatcgg acttaggatg 180agaaagttat gagtgttcga attttgaaga atttttgaaa aaaataattg aggagagaaa 240gagaattcga atttagagaa gaaagagaga gagggtgaca gaaatagggg gaagaagaag 300
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<221>重復(fù)單元<222>(194)..(229)<220>
<221>重復(fù)單元<222>(230)..(241)<400>9taatcatcaa tccatgtcgt tttcagcctt gccgcttctt cagtaggtct cacttgttct 60ctaattgtcg ttttcacgtc tccttcgaca acaaaaacga cacgtcgttt acatcccccg 120ctctcgcagc ctcaaaaacc cccaaaaacc ccaacaaatc tccttcggcg tttagcttct 180cagattgaga cacagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagagg agagagagag 240aggggtgggt cagtacatgt ggcagattcg cacgtgcctc tttgtgccct tggaaaatgc 300ccaaaattag cacttggcct ctgcaaaaac tagtactttg agttgagcaa catatatgaa 360ttcacatttc cacgctaata cactatcttt cctattatct cttaaaagaa ataaaaaaaa 420tttccaaaat acgaaggaac aattttcatt gaaactacga taaatcaatg ttcctagaca 480tttgttgttg caaataccaa acataatcac tttcttcacc tcttgcatct tgaatttcct 540tt 542<210>10<211>670<212>DNA<213>苧麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)
<220>
<221>重復(fù)單元<222>(380)..(423)<400>10taagaaagac tttttttgac caaaatgatc atatcataca ttagtcaact tgattttgat 60aaaatcaagg agcttggcat ttgaagaata gttctatatg tactactttt tttttagaaa 120aaaatgtgat tgactttgat ataattaaac atttataaac cttttgaatt agcagagaaa 180agggcagttg gttattattg agctagctca atacagtttg gtcaggctga gaaaattggc 240gatataagta gatatctaat tttacctata ataagtcata ggcaaatgat gcactaaacg 300caaatttcca agatgattta agggtccaaa atccttttat acttaggtga gtttttagag 360agagtttcac ttgtgtcttt ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct 420ctctatctct atatccattt acagctccat tttctttatg aatgaatgtt gacgcacgct 480ttcacctaac tctgctttct aatctaaaat caagattgga agagttttat gttttctttt 540tcgacttcta gagataacat tttttttggg tattgcgtat gatgattgga tataaatgtt 600gactttttaa agggcttttt ttggcaccga aatgactatg gcgaagttgt tttgatccca 660aatgagtgtt 670<210>11<211>1068<212>DNA<213>苧麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)<220>
<221>重復(fù)單元<222>(683)..(714)<400>11taaaaaatgg agacaccatt atcatctaaa attcgaagaa aattcaaaag cagtgacagg 60agttgtagac ttacacccat acgtttgccc ttgcctccag ccagaagaat gaccgaaacg 120
cttttttcct ttactaaacc aaccttttca gcagaacaac aaaccaacaa acttggcttt 180gaaccaactc ttccacgtct cactgcacgc ccaacaattg caagaccatg taaagattca 240gaatctattt aggaaaacag accaaaaaaa aaaaaaaggg gactacttgc ctgggaatgg 300aagattgaaa tgcggaagtg tgtgagaaag agggatagtc ctcacatcgg aagaaaaagc 360agaaaaggtg aggctcagac ggagagtggg agtgggtatg gccatatctg ttttagtgtt 420ttcggattgg aagtggcatt cactgccact gctgactttg atacgcagag cacaacgcaa 480cacagaatga agttcgggcg gcgatggatg gcttggggtt tctcgagacg atgggcggtg 540gtcggagggg aaggtacgcc gcgattctca gcggcagagg cgacggcgtt cggcagtgat 600tttgggtggt tcaattttgg gtttctctcg gaaaaagatg gcggtgaccg actttgttgc 660cggcagttgg ataacaaaga tcgagagaga gagagagaga gagagagaga gagagtgagt 720acgctgttcc tggaagtagt agtttccttg gaggcgacag ccgaggcgat cgatggcttg 780gccggtctcg cggatccaga atccgacggt gtaggttgct ttgcccaaag tcccatctta 840gcgagctcgg agtcgtcgtc ttcagtgggg atttaggttt ctgagtcaaa cagaccaaga 900ttttgatttc gggagaagag aaatgatacc cgagaaagcg ggggattggg gtataaaacg 960acgactcacc ggtcgtggat gttttttttt gacaattacg tgattcccat tttaccaggg 1020gacgaattca tctatcctaa agattccgta ccgactcaat tcaacttg 1068<210>12<211>649<212>DNA<213>苧麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)<220>
<221>重復(fù)單元<222>(331)..(346)<220>
<221>重復(fù)單元<222>(349)..(376)
<400>12taatcgcctt actagttgct gtactgatat acttgggagc gaagaaaaga aaaatgatca 60agctcaagga gaaattcttt gtagaaaatg gaggattgat gttacaacaa caacttgcta 120gtagaagacc agtcgagacg acaaaaatat tttctgagga cgaactgaga agcgccacaa 180acaattacca ccaaaagaga gttctaggag aaggaggatt tggaatagtg tataaaggaa 240tatttccaga tcaaagggtt gttgcaatta ataacacctc aaaaaagctc agaaaaaaaa 300aaaaaccaga aaccaaaatc atgtttgttt gagagagaga gagagaggga gagagagaga 360gagagagaga gagagagtcc aagtctcttt gtccttctac gccagcctct gacacgtgct 420ctcatggggt tgtcctattc tcatctcatc tcatcatgct tggccttggc ctttgccttc 480ccaatttttc ctctgtaaca ctcttctatt caaaataatc tcatattgtt gatattcaat 540caaaagaaga ggcgctattg tttatttgtt ttcatactgc aaattctacg cgtatatgta 600cgcacatgaa aatgtattag agttattatt gcgttattta taagtgaga 649<210>13<211>326<212>DNA<213>苧麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)<220>
<221>重復(fù)單元<222>(26)..(43)<400>13attctctctc ttcaaaggta aagtttctct ctctctctct ctcctttttt ttttctgtga 60atgtatagta atggaatgaa tgtcaagaaa ccatgctcat gcaagttctg cgatgatagt 120tttggtgacg ggtttcgctt ctgttctctt agtttgtgcc gaatttagca ttttcgtagg 180catttcttag ggtcggaagg tagtgattgg agattctagt ttcggtaatg gcggatcttt 240aggttctact ctctgattgt ggtttttttc tgtatggttg tgttcgttgc gtgttggatc 300tgtgggaaat tttggatttt ttttgg 326
權(quán)利要求
1.一種苧麻微衛(wèi)星標(biāo)記，其特征在于，所述微衛(wèi)星標(biāo)記的編號分別為BN19、BN20、BN21、BN22、BN23、BN24、BN25、BN26、BN27、BN28、BN29、BN30、BN31、BN32、BN33其核甘酸序列是BN19taaattgtga aggccatttt gggccttcac tttgttgaat gcccaaccca tttatgggcc 60taacagcaag aaagctgtga aggctatttt cgaccttgtt ctagcgcctc ataagtggct 120aacgcccatt tgtatcttgg ccaaatgtgt aagaaggcct tgaacctagt agtgggccac 180ttaattactc aaagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag 240agagagagag agagagagag agagagagag aggggttttc tgagatgggc tagctcaaag 300tcaggtgggc ctggcgttgg cccgaaatga ccaaactcga cccgacccgg aagtgaccaa 360cctcgggtca agaagtgaca cgtggacaga agtacctaac tgtcagcctc aggtaatttc 420atggaagtgg ataaagaaac agagagagag agagagcgcg agattttagc gccttttaac 480cagacacaac cgttccaagt tttgaaaagc gctataaggg tgaatctgct ccacgacaga 540ttcgatttca tcattacttt cgaacccaaa agacttcaat tgacgaaagc cttctttatc 600taattgataa acaatatttt tgacacccgc aaatccatat aagtgcaata cttcagattt 660tttcacgatc attt 674BN20taaggcttgt tggacctcca agtgagtccc taatacttat tataatatat tatatgttca 60aatactcagt tgggatcaaa acaactttgt tagagtcgct tcggagccaa aaaactattt 120tgaaggctat atttcgacaa aactagttat aacgatttac tttttgcgcg aaataaattt 180ttaagcttgg agtagtcaag agtggttgaa gctctaacca ctagagattt tgagaagcgc 240acagtatgag cgaaaatggg cttgtgggtt ttggtgtaga tggcaaagga aggtgaagaa 300caagcgtaga atgtcgaagc agagaacgcc atcgaagggg agagagagag agagagagag 360agagagagag agagagagag agagagagag aattctagaa aatctcttac ttgcttttta 420cttgtaatct ccagattagc aaagtcgaca cgtggcgcaa cggacatccc gagttgggat 480acccagtcac gtgcctcacg tgaagttggg acaaaatttt gtcccaacat ttacatttag 540cataagatag tgttactgtg atatcccgat t 571BN21caagtgaata tcaagcatat agcttcttct ttctctctct cgtttccctt tttcccttct 60tttcaggaca tttcagatac tttctggttt tatccaatgt tgcacaaaag aaaatatgat 120tcactaacat gtcaatacgg gaaagagaac tcaatcaaat caaatcaaat caaacgatat 180cacagacaac aatcacgtat catgaattac tggtcacaca tattcttgtg atagtcaaga 240ctagatcaag aaatcatgca ttttcctttt atacatagca gagaaaacct tagacttgta 300tatatgtctg tgtgtgtgtg tgtgtgtgag agagagagag agagagagag agagagagag 360agagagagag agagagagag agaattttgc acgtaactgg caataattgg ccgtgtattc 420caaaaaactt ggaaaatgaa ggcatagcca aaagcatctt caatcttcat ctccggggtc 480gattggtaat ttacacaatc ttcttcttat gatatgttat tgtttgatca aagaaatttt 540atgttgaacg atttttcatt gctgtttata acttcaggga aattacagaa atggacgctt 600catgtcctga ttatgattat catctttacc ctttgaccag cttgcagatt ggg 653BN22，BN23，BN24taataataaa caataataat aataataata atcacctagc actggggact cttctgggta 60gctggggctc gagctcagtg ggcaagccca ggaagccatt gaagcggtcg aaggtcacgt 120gcgacacgtg cctgacctct gtgggccagc tgatctccaa cgccgacgac gaccccgacg 180ccgacgccga cgacgacgtc gacgacacgt cgtctctctc gacgctgcat gtgactatgg 240acttcctcag agccgtcacc agcacatcca cgatcgcgaa ctgatgagag ccattgccgt 300cgtctctgcc attatcgccg ccgtggtaaa gccgagcctt gctgctaaac ggcgtcgtca 360cggggttgta caacgcctcg tcttcgccgt cttcgtacaa ttcgttctcc gactcttctt 420cttcttcttc ttcttcttcg tcggattctt gttcgtctat gaagataggg ctgggtgggg 480ccgtgttgaa ctcggcgagc ccgcaagatt ttgaccggaa aagccgagtc atggcgagag 540gtcaagatca gagaaaccaa aacagagtag tgtttgtgtg tttgatttgt tttgagagtt 600gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaag 660agccggcctt ggaagaaaca agaaggagaa gagaaaagct tgatttttcc aagctaaaac 720gtaaggtaac ttagccagct tttcttatag tttgagtttt 760BN25taacaactca ccactgtgat ggaccaattg actcatcgtc aacagaatga ttgatcggct 60cactttacaa cgatcggtcg gctccttgca atgaccgatt ggtccagttg gctcgtcacc 120gacatgatga cgagttggtt ctccttctca acgttagatt ggctcgcttt ctggccacca 180acataatgat taaataaatt ttattctctc tcaactcata ccaataatta cttcacaaat 240atcatttttc tacttctttt atcttttctc tctaggctct ctctttcttc cgatcttctt 300tcttttctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctgg aattctcgct 360ccctctctgt ttcatctctc acactctccc tctctctcat atctgctctg atcactatac 420aacggggtta gactttggag tttgaatatg ttattacgct tgatgttggc tgttctctct 480tctaagctca aaactgaaat actttttttt ttactggtat tgatagaat 529BN26taacccaact caagctgaag aaacttattc aatggtcacc gctaaccgct tttggtccca 60aatctttggg gttgcttttt ccaataaacg ttggttacat ttctttatgt tatttgtacc 120agtcactggt ttatggatga gtgctcttgg agtagtcggt ctggctttga atctacgtgc 180ctatgacttc gtttctcaag aaatccgtgc agcggaagat cctgaatttg agactttcta 240cacaaaaaat atcctcttaa tttgttgttt gtgtgtcagt gtttgtggtg atttcagggg 300agacagagag agagagagat tgtgagaaag agaaagagag agagagagat gaaagtgaag 360gctgaattat tggaaagata gatacagaga catgtcgttt gtgggttctg agttggaatt 420ggttgagata taatcatgcc ggccaatggc aatcacggaa agtttagttt tt 472BN27taagatgtac caaagaaatt ggggggccag agaagcacaa gagagaggct aatctggaca 60taagaacccc caacactttg gaagtggaat caatatatgc ctctagaaca aagccatcaa 120gaaatcgatc atcagatctc aaacccttga agccgaaagg agaggcattt atactcaacc 180cacgcacaca gagccaaaat gaaaattgct ttacaccaaa gagagagaga gagagggagt 240aatgattcga ggcttagtga agagtagagt tgtgaaggat atttataggg tggcctaaaa 300ccctaggttg tgaacgatgc tgagaagata tcagctgc 338BN28acaaaacctc cccaatcaat ttcaagtttg gaggccgacg atggtgaggt ggatggctgc 60ggcggctgtg cgattttcgg catagtccga cagtttccga tgacaaacca ctgctcaaaa 120tattcctctc gtcgagagct ttccaacggt accaagtatg catcaatcgg acttaggatg 180agaaagttat gagtgttcga attttgaaga atttttgaaa aaaataattg aggagagaaa 240gagaattcga atttagagaa gaaagagaga gagggtgaca gaaatagggg gaagaagaag 300aagaaaagga aaagaaaagg ggaaaaagaa aaagaaaaag tgatgtaatg ggttggtgag 360tgtatt 366BN29taatcatcaa tccatgtcgt tttcagcctt gccgcttctt cagtaggtct cacttgttct 60ctaattgtcg ttttcacgtc tccttcgaca acaaaaacga cacgtcgttt acatcccccg 120ctctcgcagc ctcaaaaacc cccaaaaacc ccaacaaatc tccttcggcg tttagcttct 180cagattgaga cacagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagagg agagagagag 240aggggtgggt cagtacatgt ggcagattcg cacgtgcctc tttgtgccct tggaaaatgc 300ccaaaattag cacttggcct ctgcaaaaac tagtactttg agttgagcaa catatatgaa 360ttcacatttc cacgctaata cactatcttt cctattatct cttaaaagaa ataaaaaaaa 420tttccaaaat acgaaggaac aattttcatt gaaactacga taaatcaatg ttcctagaca 480tttgttgttg caaataccaa acataatcac tttcttcacc tcttgcatct tgaatttcct 540tt 542BN30taagaaagac tttttttgac caaaatgatc atatcataca ttagtcaact tgattttgat 60aaaatcaagg agcttggcat ttgaagaata gttctatatg tactactttt tttttagaaa 120aaaatgtgat tgactttgat ataattaaac atttataaac cttttgaatt agcagagaaa 180agggcagttg gttattattg agctagctca atacagtttg gtcaggctga gaaaattggc 240gatataagta gatatctaat tttacctata ataagtcata ggcaaatgat gcactaaacg 300caaatttcca agatgattta agggtccaaa atccttttat acttaggtga gtttttagag 360agagtttcac ttgtgtcttt ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct 420ctctatctct atatccattt acagctccat tttctttatg aatgaatgtt gacgcacgct 480ttcacctaac tctgctttct aatctaaaat caagattgga agagttttat gttttctttt 540tcgacttcta gagataacat tttttttggg tattgcgtat gatgattgga tataaatgtt 600gactttttaa agggcttttt ttggcaccga aatgactatg gcgaagttgt tttgatccca 660aatgagtgtt 670BN31taaaaaatgg agacaccatt atcatctaaa attcgaagaa aattcaaaag cagtgacagg 60agttgtagac ttacacccat acgtttgccc ttgcctccag ccagaagaat gaccgaaacg 120cttttttcct ttactaaacc aaccttttca gcagaacaac aaaccaacaa acttggcttt 180gaaccaactc ttccacgtct cactgcacgc ccaacaattg caagaccatg taaagattca 240gaatctattt aggaaaacag accaaaaaaa aaaaaaaggg gactacttgc ctgggaatgg 300aagattgaaa tgcggaagtg tgtgagaaag agggatagtc ctcacatcgg aagaaaaagc 360agaaaaggtg aggctcagac ggagagtggg agtgggtatg gccatatctg ttttagtgtt 420ttcggattgg aagtggcatt cactgccact gctgactttg atacgcagag cacaacgcaa 480cacagaatga agttcgggcg gcgatggatg gcttggggtt tctcgagacg atgggcggtg 540gtcggagggg aaggtacgcc gcgattctca gcggcagagg cgacggcgtt cggcagtgat 600tttgggtggt tcaattttgg gtttctctcg gaaaaagatg gcggtgaccg actttgttgc 660cggcagttgg ataacaaaga tcgagagaga gagagagaga gagagagaga gagagtgagt 720acgctgttcc tggaagtagt agtttccttg gaggcgacag ccgaggcgat cgatggcttg 780gccggtctcg cggatccaga atccgacggt gtaggttgct ttgcccaaag tcccatctta 840gcgagctcgg agtcgtcgtc ttcagtgggg atttaggttt ctgagtcaaa cagaccaaga 900ttttgatttc gggagaagag aaatgatacc cgagaaagcg ggggattggg gtataaaacg 960acgactcacc ggtcgtggat gttttttttt gacaattacg tgattcccat tttaccaggg 1020gacgaattca tctatcctaa agattccgta ccgactcaat tcaacttg 1068BN32taatcgcctt actagttgct gtactgatat acttgggagc gaagaaaaga aaaatgatca 60agctcaagga gaaattcttt gtagaaaatg gaggattgat gttacaacaa caacttgcta 120gtagaagacc agtcgagacg acaaaaatat tttctgagga cgaactgaga agcgccacaa 180acaattacca ccaaaagaga gttctaggag aaggaggatt tggaatagtg tataaaggaa 240tatttccaga tcaaagggtt gttgcaatta ataacacctc aaaaaagctc agaaaaaaaa 300aaaaaccaga aaccaaaatc atgtttgttt gagagagaga gagagaggga gagagagaga 360gagagagaga gagagagtcc aagtctcttt gtccttctac gccagcctct gacacgtgct 420ctcatggggt tgtcctattc tcatctcatc tcatcatgct tggccttggc ctttgccttc 480ccaatttttc ctctgtaaca ctcttctatt caaaataatc tcatattgtt gatattcaat 540caaaagaaga ggcgctattg tttatttgtt ttcatactgc aaattctacg cgtatatgta 600cgcacatgaa aatgtattag agttattatt gcgttattta taagtgaga 649BN33attctctctc ttcaaaggta aagtttctct ctctctctct ctcctttttt ttttctgtga 60atgtatagta atggaatgaa tgtcaagaaa ccatgctcat gcaagttctg cgatgatagt 120tttggtgacg ggtttcgctt ctgttctctt agtttgtgcc gaatttagca ttttcgtagg 180catttcttag ggtcggaagg tagtgattgg agattctagt ttcggtaatg gcggatcttt 240aggttctact ctctgattgt ggtttttttc tgtatggttg tgttcgttgc gtgttggatc 300tgtgggaaat tttggatttt ttttgg 326
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的苧麻微衛(wèi)星標(biāo)記，其特征在于所述BN19、BN20、BN21、BN22-23-24、BN25、BN26、BN27、BN28、BN29、BN30、BN31、BN32、BN33十五個位點(diǎn)的引物序列為BN19-FGCT AAC GCC CAT TTG TAT CTT GBN19-RGGC CCA CCT GAC TTT GAG CBN20-FTGG CAA AGG AAG GTG AAG AAC AAGBN20-RTGA GGC ACG TGA CTG GGT ATC CBN21-FAGA TGC TTT TGG CTA TGCBN21-RTCA AAC GAT ATC ACA GAC AACBN22-FGCC CAG GAA GCC ATT GAA GCBN22-RGAC GAC GGC AAT GGC TCT CABN23-FTGC CGT CGT CTC TGC CAT TAT CGBN23-RGCC CCA CCC AGC CCT ATC TTC ABN24-FCTT CTT CGTCGG ATT CTT GTT CBN24-RGCT TTT CTC TTC TCC TTC TTG TTTBN25-FCTC TCT CAA CTC ATA CCA ATA ATBN25-RAGA GAA CAG CCA ACA TCA ABN26-FCGT GCC TAT GAC TTC GTT TCT CBN26-RTTT CCA ATA ATT CAG CCT TCA CTTBN27-FGGA CAT AAG AAC CCC CAA CAC TBN27-RGGC CAC CCT ATA AAT ATC CTT CACBN28-FTTC CGA TGA CAA ACC ACT GCTBN28-RACA CTC ACC AAC CCA TTA CAT CACBN29-FCTT GCC GCT TCT TCA GTA GGT CTGBN29-RGGC ATT TTC CAA GGG CAC AABN30-FAAT TAG CAG AGA AAA GGG CAG TTBN30-RAAA GCG TGC GTC AAC ATT CABN31-FAAG GTA CGC CGC GAT TCT CBN31-RTGG GCA AAG CAA CCT ACA CCBN32-FCGC CAC AAACAA TTA CCA CCA ABN32-RAAT AGG ACA ACC CCA TGA GAG CACBN33-FAAG GTA AAG TTT CTC TCT CTC TCBN33-RAGA ATC TCC AAT CAC TAC CTT
專利摘要
本發(fā)明涉及一種苧麻的DNA分子遺傳標(biāo)記，提供了15個苧麻微衛(wèi)星位點(diǎn)的DNA序列及擴(kuò)增上述15個苧麻微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物序列和擴(kuò)增方法，15個苧麻微衛(wèi)星位點(diǎn)用于苧麻品種分類、遺傳關(guān)系分析和標(biāo)記輔助育種，重復(fù)性好，是一種可靠有效的分子標(biāo)記。
文檔編號C12P19/00GKCN1814787SQ200510032422
公開日2006年8月9日 申請日期2005年11月24日
發(fā)明者揭雨成, 蔣彥波, 周建林, 張健 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan