專(zhuān)利名稱(chēng):一種減少假陽(yáng)性結(jié)果的方法
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明提供了用于去除來(lái)自某些分子的液體污染的方法和化合物。特別是，本發(fā)明指向保持試劑不含所述分子的方法和化合物。更特別地，本發(fā)明指向確保樣品中目標(biāo)分子的核酸擴(kuò)增反應(yīng)避免假陽(yáng)性結(jié)果的方法和化合物。
現(xiàn)有技術(shù)背景以核酸分析為基礎(chǔ)用于診斷或研究的微生物檢測(cè)仍然日趨重要。這是由于一方面，核酸經(jīng)常以非常小的濃度存在，另一方面，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)核酸存在于很多其他的固體和溶解的物質(zhì)中，例如在細(xì)胞裂解后，這些難以分離和測(cè)定核酸，特別是在允許對(duì)特異的被分析物進(jìn)行檢測(cè)的生物特異性分析中。因此在大多數(shù)情況下，這些微生物檢測(cè)包括對(duì)待檢測(cè)的特征性DNA分子進(jìn)行至少一個(gè)擴(kuò)增步驟。需要兩條寡核苷酸引物選擇性結(jié)合的眾所周知的檢測(cè)是在US 4,683,195中描述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。這種方法在脫氧核苷三磷酸的存在下在幾個(gè)循環(huán)中通過(guò)熱穩(wěn)定性聚合酶將特異性核酸區(qū)域選擇性地?cái)U(kuò)增至可檢測(cè)的水平。其他可能的擴(kuò)增反應(yīng)是連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR；Wu，D.Y.和Wallace，R.B.，Genomics 4(1989)560-569以及Barany，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)189-193)；聚合酶連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Barany，PCR Methods and Applic.1(1991)5-16)；Gap-LCR(PCT專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)WO 90/01069)；修復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(歐洲專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)439 182 A2)、3SR(Kwoh，D.Y.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)1173-1177；Guatelli，J.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)1874-1878；PCT專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)WO 92/0880A)，和NASBA(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,130,238)。更進(jìn)一步的，還有鏈置換擴(kuò)增(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA)和Qβ-擴(kuò)增(相關(guān)綜述參見(jiàn)例如Whelen，A.C.和Persing.D.H.，Annu.Rev.Microbiol.50(1996)349-373；Abramson，R.D.和Myers，T.W.，Current Opinion in Biotechnology 4(1993)41-47)。
由于這些技術(shù)導(dǎo)致核酸分子急驟擴(kuò)增，因此即使來(lái)自為所述擴(kuò)增反應(yīng)所必需的試劑的非所需核酸分子對(duì)樣品的最輕微污染，也可能導(dǎo)致大量的假擴(kuò)增產(chǎn)物，類(lèi)似于例如假陽(yáng)性診斷。當(dāng)待測(cè)樣品中存在細(xì)菌以及所使用的一些試劑被這種細(xì)菌污染，或被來(lái)自這種細(xì)菌的核酸污染時(shí)，就可能在微生物檢測(cè)中發(fā)生突出的這種現(xiàn)象的實(shí)例。在這種情況下，在檢測(cè)中來(lái)自樣品的目標(biāo)核酸分子與來(lái)自污染試劑的非所需分子是一樣的。
因此，對(duì)于無(wú)污染的核酸擴(kuò)增反應(yīng)環(huán)境的要求是至關(guān)重要的。
在科學(xué)文獻(xiàn)和專(zhuān)利申請(qǐng)中，描述了對(duì)來(lái)自核酸的溶液進(jìn)行凈化的一些方法。這些方法包括化學(xué)處理，例如使用次氯酸鈉(Prince，A.M.和Andrus，L，Biotechniques 12(1992)358-360)、表面活性劑、或氧化劑(WO2002/060539)。另外的一些策略使用消化酶進(jìn)行處理(Fox，J.C.等人，J.Virol.Meth.33(1991)375-3823)或UV照射(Fox，J.C.等人，J.Virol.Meth.33(1991)375-3823)。上述的相關(guān)策略可從一些綜述中找到(Abravaya，K.等人，Nucleic Acid Ampl.Technol.第9章(1997)125-133；Corless，C.E.等人，J.Clin.25 Microbiol. 38(2000)1747-1752；Klaschik，S.等人，Mol.Biotechnol.22(2002)231-242)。
一般用于從復(fù)雜的生物液體中分離或隔離例如DNA等的另一種方法是使用DNA結(jié)合材料。DNA結(jié)合材料的最重要實(shí)例是玻璃表面，這是由于其在存在離液劑時(shí)能夠可逆地結(jié)合DNA(Vogelstein，B.，和Gillespie，D.，Proc.Nad.Acad.Sci.USA 76(1979)615-619)。但是，這個(gè)方法并不區(qū)分單鏈和雙鏈DNA。US 04/121336描述了使核酸與大量的固體基質(zhì)結(jié)合單元相結(jié)合的方法。
更為普遍地，可使用陽(yáng)離子表面來(lái)結(jié)合帶電荷的DNA分子，由此例如EP 0 281390描述了一種用于核酸分離的聚陽(yáng)離子支持物，WO01/94573描述了帶電薄膜或WO 00/69872描述了pH依賴(lài)型離子交換基質(zhì)。WO 02/48164中公開(kāi)了位于固體支持物上的用于可逆地結(jié)合DNA的帶有可轉(zhuǎn)換電荷的聚合體。與陽(yáng)離子表面相類(lèi)似，聚陽(yáng)離子實(shí)體也具有某些DNA結(jié)合親和力。Stewart，等人，J.Phys.Org.Chem.5(1992)461-466中報(bào)道了一種隨著陽(yáng)離子電荷的增加而提高結(jié)合溶液中DNA的親和性的多胺。Doré等人JACS 126(2004)4240-4244)描述了陽(yáng)離子復(fù)合物在雙鏈和單鏈核酸之間的選擇性。
而且本領(lǐng)域眾所周知，雙鏈(ds)DNA結(jié)合分子可區(qū)分單鏈和雙鏈DNA。這里應(yīng)特別提及小溝結(jié)合劑(MBGs)、抗-ds DNA抗體和嵌入劑。
MGB類(lèi)似于吡咯脒抗生素偏端霉素或紡錘菌素，通過(guò)氫鍵結(jié)合到小溝上，而并不通過(guò)嵌入作用相互影響(Fish，E.L.等人，Biochemistry 27(1988)6026-6032).Boger，D.L.等人，J.Am.Chem.Soc.123(2001)5878-5891研究了偏端霉素、紡錘菌素、和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)與固定在微量滴定板上的雙鏈DNA的結(jié)合。US2002/0095073描述了使用MGB作為探針，通過(guò)酰胺或硫醇鍵固定在固相支持物上，使其與DNA結(jié)合，以確定一種或多種醫(yī)學(xué)癥狀的誘因。Li，M.等人Bioorg.Med.Chem.Letters 12(2003)4351-4354描述了一種通過(guò)共價(jià)酰胺鍵結(jié)合到表面氨基上的DAPI衍生物。
已知抗-ds DNA抗體能夠區(qū)分單鏈和雙鏈DNA，因此將其用作例如固定于固相支持物上的DNA雜交探針，由此通過(guò)色度檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證抗體的存在(Mantero，G.等人，Clin.Chem.37(1991)422-429)。WO2002/074993描述了一種使用活化的硫醇單層將抗DNA抗體固定在包金的玻璃片上的方法。專(zhuān)利EP 0 792 376涉及核酸擴(kuò)增反應(yīng)領(lǐng)域，而且公開(kāi)了通過(guò)生物素/鏈霉親和素鍵將抗雜交抗體固定到表面上的方法。
在現(xiàn)有技術(shù)中，也使用固定化的抗體來(lái)可逆地結(jié)合細(xì)胞或細(xì)胞的聚集體，例如細(xì)菌。為了分離食品病原體，已經(jīng)有基于被抗體官能化的珠的商業(yè)產(chǎn)品(DYNAL Biotech或MATRIX Microscience Ltd)。WO 91/19003公開(kāi)了一種使用表面上的抗體來(lái)檢測(cè)污染的方法。
PROFOS GmbH公開(kāi)了使用與載體偶聯(lián)的噬菌體尾蛋白質(zhì)來(lái)結(jié)合細(xì)胞(WO 01/09370、WO 02/06117)或內(nèi)毒素(WO 04/01418)。Koepsel和Russell(Koepsel，R.R.And Russell，A.J.，Biomacromolecules 4(2003)850-855)公開(kāi)了用來(lái)捕獲細(xì)菌的原生質(zhì)膜上的抗體。對(duì)于非特異的細(xì)胞，WO 03/33698描述了使用帶電荷的聚合物的方法。
過(guò)去已經(jīng)集中研究過(guò)結(jié)合于雙鏈DNA堆疊的堿基對(duì)之間的一些有機(jī)小分子的嵌入特性(Brana，M.E.等人，Curr.Pharm.Design 7(2001)1745-1780)。WO 2002/82078描述了由嵌入劑和信號(hào)分子產(chǎn)生的復(fù)合物，以便檢測(cè)固相支持物上雙鏈DNA的存在。在US2002/0006617中描述了附加在支持物上的嵌入劑用于分離單鏈和雙鏈DNA的用途。US 2001/0026921描述了一種帶有通過(guò)氨基功能團(tuán)連接到表面的嵌入劑和帶有熒光團(tuán)的第二個(gè)嵌入劑的核酸雜交檢測(cè)組合物。
US 2003/0130499公開(kāi)了例如使用可摻入固相的放線菌素D或溴化乙錠作為嵌入劑來(lái)結(jié)合核酸。
發(fā)明概述用于將來(lái)自溶液生物分子(例如核酸)結(jié)合到固相支持物的表面的很多方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，但是這些備選方法中沒(méi)有一個(gè)可適用于特殊應(yīng)用的凈化方法。
因此，本發(fā)明指向用于檢測(cè)樣品中生物分子的方法和化合物，其凈化試劑為所述檢測(cè)所必需的，和/或保持所述試劑不含生物分子，由此在特定實(shí)驗(yàn)背景下使凈化過(guò)程恒定發(fā)揮作用。尤為特別地，本發(fā)明指向通過(guò)在實(shí)際的核酸擴(kuò)增之前永久存在的核酸結(jié)合化合物來(lái)確保核酸擴(kuò)增的效率而不擴(kuò)增非目標(biāo)核酸分子和/或潛在地存在于所述試劑中的目標(biāo)核酸分子的改進(jìn)方法和化合物。
本發(fā)明的一個(gè)方面是用于檢測(cè)樣品中生物分子的方法，其避免檢測(cè)到潛在地存在于為檢測(cè)樣品中的生物分子所必需的試劑中的生物分子，包括步驟a)提供潛在地包括所述生物分子的樣品，b)提供偶聯(lián)于固相表面的結(jié)合部分，c)提供為檢測(cè)生物分子所必需的試劑，d)向所述樣品中加入所述試劑，e)檢測(cè)所述樣品中的生物分子，以及其中，在步驟c)或在步驟d)或在步驟c)和d)中，所述的試劑在環(huán)境下與所述的結(jié)合部分物理接觸，由此潛在地存在于所述試劑中的所述生物分子結(jié)合到偶聯(lián)于所述固相表面的所述結(jié)合部分上。
本發(fā)明也涉及擴(kuò)增目標(biāo)核酸分子的方法，包括步驟a)提供潛在地包括目標(biāo)核酸分子的樣品，b)提供偶聯(lián)于固相表面的核酸結(jié)合部分，c)提供為擴(kuò)增所述的目標(biāo)核酸分子所必需的試劑，d)向所述樣品中加入所述試劑，
e)擴(kuò)增所述樣品中的所述目標(biāo)核酸分子，并且其中，在步驟c)或在步驟d)或在步驟c)和d)中，所述的試劑在環(huán)境下與所述的核酸結(jié)合部分物理接觸，由此潛在地存在于所述試劑中的所述生物分子結(jié)合到偶聯(lián)于所述固相表面的所述核酸結(jié)合部分上。
在本發(fā)明的備選實(shí)施方案中，步驟a)至c)可以以這些步驟的任何其他可能的順序來(lái)進(jìn)行。
貫穿本發(fā)明的“結(jié)合部分”是能夠可逆地結(jié)合生物分子或生物區(qū)室的分子復(fù)合物。如果其能夠結(jié)合核酸，那么它們就被稱(chēng)為核酸結(jié)合部分。如果其對(duì)雙鏈核酸的親和性高于單鏈核酸，則被稱(chēng)為雙鏈核酸結(jié)合部分。短語(yǔ)雙鏈核酸結(jié)合部分或′ds-DNA結(jié)合劑′在本發(fā)明中具有等同的意義。本發(fā)明的上下文中，短語(yǔ)核酸(NA)概括了脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)以及類(lèi)似于肽核酸(PNA)或鎖定的核酸(LNA)的核酸類(lèi)似物。
生物區(qū)室是指細(xì)胞或細(xì)胞的集合體。由于細(xì)胞在細(xì)胞膜中具有特定的蛋白質(zhì)和聚合體，結(jié)合部分對(duì)這些分子結(jié)構(gòu)具有親和性，而便于可逆地結(jié)合細(xì)胞或細(xì)胞集合體。而且，帶陰性電荷的細(xì)胞膜與陽(yáng)性結(jié)合部分的靜電相互作用能夠用于可逆地結(jié)合生物區(qū)室。
在本發(fā)明中自始至終，結(jié)合部分都是偶聯(lián)到固相表面上的。這種固相的表面可以是任意形狀的，因此包括例如蓋玻片的平坦表面、例如檢測(cè)試管的曲面、容器或移液管吸頭、小顆粒例如磁珠的表面，或多孔材料例如玻璃毛的表面。在本發(fā)明中自始至終，容器是指單一的反應(yīng)容器，例如Eppendorf帽或離心管。作為固相材料，所有的材料都可能在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，只要這種固相材料的表面包括針對(duì)所述結(jié)合部分的偶聯(lián)基團(tuán)，或只要這個(gè)固相材料的表面可以被所述結(jié)合部分的偶聯(lián)基團(tuán)功能化。在一些情況中，在偶聯(lián)結(jié)合部分之前，有必要給所述表面提供功能性包被。這種功能性包被是例如聚合物涂層。
在在本發(fā)明的上下文中，結(jié)合部分與固相表面的偶聯(lián)包括共價(jià)鍵(例如硅烷偶聯(lián))、酰胺鍵或環(huán)氧化物偶聯(lián)、例如His標(biāo)簽和鰲合物之間的配位結(jié)合、例如生物素/鏈霉親和素鍵的生物親和結(jié)合。
“樣品中的生物分子”是指潛在地存在于待檢測(cè)的所述樣品中的目標(biāo)分子，因此，其也被稱(chēng)為“樣品中的目標(biāo)分子”。而且，特定的非目標(biāo)分子也可能存在于所述樣品中而可能干擾目標(biāo)分子的檢測(cè)。不能通過(guò)本發(fā)明避免這些最初存在于樣品中的非目標(biāo)分子。如果目標(biāo)分子和非目標(biāo)分子是核酸分子，則相應(yīng)地將其稱(chēng)作目標(biāo)核酸分子和非目標(biāo)核酸分子。非目標(biāo)核酸分子是與目標(biāo)核酸分子具有不同序列的分子。
此外，為了檢測(cè)所述目標(biāo)分子必需的試劑是可能含有非目標(biāo)分子或目標(biāo)分子，或同時(shí)含有這兩種分子的溶液，如果將這些分子引入所述樣品成為污染，可能在例如診斷檢測(cè)中干擾樣品中目標(biāo)分子的檢測(cè)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，潛在地存在于試劑中的非目標(biāo)分子還包括含有目標(biāo)和/或非目標(biāo)核酸分子的細(xì)胞。本發(fā)明自始至終通過(guò)短語(yǔ)“潛在地存在于試劑中的生物分子”來(lái)概括這些潛在地存在于試劑中的非目標(biāo)分子和/或目標(biāo)分子。
關(guān)于核酸，潛在地存在于試劑中的目標(biāo)分子包括核酸分子本身以及相應(yīng)的擴(kuò)增子和細(xì)胞中的核酸。本發(fā)明自始至終使用短語(yǔ)“潛在地存在于試劑中的核酸分子”來(lái)概括所有潛在地存在于試劑中的可能的核酸分子污染，也就是只有目標(biāo)核酸分子、只有非目標(biāo)核酸分子、或同時(shí)有目標(biāo)和非目標(biāo)核酸分子。
試劑包括為檢測(cè)樣品中目標(biāo)分子所必需的所有物質(zhì)，即例如緩沖液、酶、抗體、引物、探針、標(biāo)記、核苷酸和/或脫氧核苷酸。
可能初始就存在例如非目標(biāo)分子和/或目標(biāo)分子的所述試劑的污染，或可在一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)步驟中引入這些分子，例如通過(guò)加入已污染的試劑，或僅僅通過(guò)使試劑與周?chē)h(huán)境接觸。試劑的污染可能引起非目標(biāo)分子和目標(biāo)分子進(jìn)入所述樣品而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。
在本發(fā)明中，所述試劑的可能污染包括細(xì)胞或細(xì)胞集合體，因此在本發(fā)明的范圍內(nèi)細(xì)胞或細(xì)胞集合體也理解為非目標(biāo)分子。作為突出的實(shí)例，在此提及PCR試劑的細(xì)菌污染物，因?yàn)檫@些試劑的細(xì)菌污染會(huì)向溶液中添加雙鏈(ds)DNA。如果試劑中的細(xì)菌污染與將通過(guò)檢測(cè)樣品中特異性目標(biāo)分子而驗(yàn)證的相同，那么這可能在基于目標(biāo)核酸PCR擴(kuò)增的診斷性檢測(cè)中產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。在這種情況下，非來(lái)源于檢測(cè)下的樣品的目標(biāo)核酸分子會(huì)使得PCR結(jié)果增大。
當(dāng)在特定條件下結(jié)合部分與試劑物理性地接觸時(shí)，發(fā)生從試劑中去除非目標(biāo)分子和/或目標(biāo)分子的污染，由此非目標(biāo)分子和/或目標(biāo)分子可逆地結(jié)合到結(jié)合部分上。
貫穿本發(fā)明，短語(yǔ)物理接觸應(yīng)被理解為，所述的結(jié)合部分與所述試劑在緩沖液、壓力、溫度、放射或機(jī)械應(yīng)力的特定條件下相接觸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知，有機(jī)分子之間的結(jié)合一般都是可逆的，并且依賴(lài)于周?chē)彌_溶液的條件。因此，要提供特定的條件來(lái)確保非目標(biāo)分子和/或目標(biāo)分子與結(jié)合部分結(jié)合的條件。本發(fā)明自始至終，物理接觸包括將載玻片或顆粒浸入到試劑中，用試劑填充例如試管，或使試劑流過(guò)例如移液管吸頭。
在本發(fā)明的范圍中，所有的檢測(cè)模式都可能用于目標(biāo)分子的檢測(cè)，只要其能夠檢測(cè)有機(jī)分子。
在DNA的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知適用的檢測(cè)方法在標(biāo)準(zhǔn)的教科書(shū)中有描述，如Sambrook等人Molecular Cloning，ALaboratory Manual(2nd Addition，Cold Spring Harbour LaboratoryPress，Cold Spring Harbour，NY)或Ausubel等人Current Protocolsin Molecular Biology(1987)J.Wiley and Sons，NY)。
在蛋白質(zhì)的情況下，適用的檢測(cè)方法在如下教科書(shū)中有描述，TijssenPractice and theory of enzyme immunoassays(1985，Elsevier，Amsterdam，Netherlands)and Aslam & DentBioconjugation(2000，Macmillian Reference，倫敦，英國(guó))。
對(duì)于目標(biāo)核酸分子的擴(kuò)增，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有檢測(cè)技術(shù)，例如PCR、LCR或復(fù)制酶擴(kuò)增都可包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面與固相材料有關(guān)，其中雙鏈核酸結(jié)合部分偶聯(lián)到所述固相材料的表面。固相材料和以特定數(shù)量偶聯(lián)到其表面的結(jié)合部分的復(fù)合物可以是根據(jù)本發(fā)明的固相材料和結(jié)合部分的任意組合。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是所述固相材料用于擴(kuò)增樣品中的目標(biāo)核酸，避免潛在地存在于為擴(kuò)增所述樣品中所述目標(biāo)核酸分子所必需的試劑中的核酸分子擴(kuò)增的用途。目標(biāo)核酸分子的擴(kuò)增包括擴(kuò)大樣品中核酸分子數(shù)目的任何可能性。實(shí)例是提供核酸拷貝數(shù)相對(duì)于循環(huán)數(shù)指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)的PCR和LCR，或是提供核酸拷貝數(shù)相對(duì)于反應(yīng)時(shí)間線性增長(zhǎng)的復(fù)制酶擴(kuò)增。
本發(fā)明還涉及包括根據(jù)本發(fā)明為進(jìn)行目標(biāo)核酸擴(kuò)增所必需的試劑和所述固相材料的試劑盒。
附圖簡(jiǎn)述
圖1生物素化的ds-NA結(jié)合劑(MGB)圖2ds-NA結(jié)合劑的特性(MGB，肽和嵌入劑)圖3使用偶聯(lián)于Dynabeads的ds-NA結(jié)合劑通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)測(cè)定來(lái)自細(xì)菌DNA的凈化效率。
圖4連接到Dynabeads的ds-NA結(jié)合劑對(duì)hg DNA的凈化效率，通過(guò)PCR擴(kuò)增測(cè)定。
圖5使用3個(gè)偶聯(lián)于Dynabeads的ds-NA結(jié)合劑通過(guò)PCR擴(kuò)增測(cè)定來(lái)自質(zhì)粒DNA的凈化效率。
圖6利用UV吸收率以時(shí)間依賴(lài)性方式評(píng)估雙-PEG-偏端霉素/SA-磁珠復(fù)合物對(duì)于雙鏈和單鏈寡核苷酸的選擇性。
圖7利用PCR擴(kuò)增以時(shí)間依賴(lài)性方式評(píng)估3種ds-NA結(jié)合劑對(duì)于雙鏈和單鏈寡核苷酸的選擇性。
圖8利用雙-PEG-偏端霉素/SA-磁珠復(fù)合物凈化來(lái)自細(xì)菌DNA的溶液，并通過(guò)PCR擴(kuò)增定量。
圖9利用雙-PEG-偏端霉素/SA-包被的試管凈化來(lái)自細(xì)菌DNA的溶液，并通過(guò)PCR擴(kuò)增定量。
圖10利用幾種細(xì)菌結(jié)合物/SA-磁珠復(fù)合物通過(guò)PCR擴(kuò)增測(cè)定的兩個(gè)細(xì)菌濃度下的凈化效率。
發(fā)明詳述本發(fā)明的一個(gè)方面是用于檢測(cè)樣品中生物分子的方法，其避免檢測(cè)到潛在地存在于為檢測(cè)樣品中的生物分子所必需的試劑中的生物分子，包括步驟a)提供潛在包括所述生物分子的樣品，b)提供偶聯(lián)于固相表面的結(jié)合部分，c)提供為檢測(cè)生物分子所必需的試劑，d)向所述樣品中加入所述試劑，e)檢測(cè)樣品中的生物分子，并且其中，在步驟c)或在步驟d)或在步驟c)和d)中，所述的試劑在環(huán)境下與所述的結(jié)合部分物理接觸，由此潛在地存在于所述試劑中的所述生物分子結(jié)合到偶聯(lián)于所述固相表面的所述結(jié)合部分上。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是用于檢測(cè)樣品中生物分子的方法，其避免檢測(cè)到潛在地存在于為檢測(cè)樣品中的生物分子所必需的試劑中的生物分子，包括步驟a)提供偶聯(lián)于固相表面的結(jié)合部分，b)提供為檢測(cè)生物分子所必需的試劑，c)向潛在地包括所述目標(biāo)分子的樣品中加入所述的試劑，d)檢測(cè)所述樣品中的生物分子，并且其中，在步驟b)或在步驟c)或在步驟b)和c)中，所述的試劑與環(huán)境下與所述的結(jié)合部分物理接觸，由此潛在地存在于所述試劑中的所述生物分子結(jié)合到偶聯(lián)于所述固相表面的所述結(jié)合部分上。
在本發(fā)明中自始至終，試劑是指為檢測(cè)所述目標(biāo)分子所必需的所有試劑，包括例如緩沖溶液、酶、抗體、引物、探針、標(biāo)記、核苷酸和/或寡核苷酸的物質(zhì)。由于這些試劑都要被加入樣品中，所以確保所使用的試劑沒(méi)有被非目標(biāo)分子以及目標(biāo)分子污染是十分重要的，以便于在檢測(cè)樣品中的目標(biāo)分子時(shí)避免假陽(yáng)性結(jié)果。
上述用于檢測(cè)樣品中目標(biāo)分子的檢測(cè)方法避免了檢測(cè)到潛在地存在于所述試劑中的生物分子，減少了由于污染所引起的假陽(yáng)性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)。
潛在地存在于所述試劑中的生物分子選自目標(biāo)分子、非目標(biāo)分子、以及同時(shí)存在的目標(biāo)分子和非目標(biāo)分子。非目標(biāo)分子和/或目標(biāo)分子與所述結(jié)合部分的結(jié)合優(yōu)選是可逆的，因此，在特定條件下發(fā)生結(jié)合，并且能夠通過(guò)改變所述的條件而釋放出來(lái)。優(yōu)選能夠通過(guò)改變緩沖液濃度、溫度或機(jī)械壓力方面的條件而變換非目標(biāo)分子和/或目標(biāo)分子的結(jié)合和釋放。最優(yōu)選地，在室溫和適度的鹽濃度下發(fā)生非目標(biāo)分子和/或目標(biāo)分子的結(jié)合。
有機(jī)分子之間結(jié)合的條件和相互作用的類(lèi)型是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。對(duì)于蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，相互作用在教科書(shū)TijssenPractice andtheory of enzyme immunoassays(1985，Elsevier，阿姆斯特丹，荷蘭)以及Aslam和DentBioconjugation(2000，Macmillian Reference，倫敦，英國(guó))中有描述。DNA與其他有機(jī)分子的相互作用在標(biāo)準(zhǔn)的教科書(shū)中都有描述，例如Sambrook等人Molecular Cloning，ALaboratory Manual(2nd Addition，Cold Spring Harbour LaboratoryPress，Cold Spring Harbour，NY)或Ausubel等人Current Protocolsin Molecular Biology(1987，J.Wiley和Sons，NY)。
ds DNA與類(lèi)似于小溝結(jié)合劑或嵌入劑的ds-NA結(jié)合劑的結(jié)合可以在含鹽溶液如氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂或Tris緩沖液中進(jìn)行，而在較低鹽濃度下的結(jié)合親和性更高，優(yōu)選使用10-100mM的鹽濃度。而且，優(yōu)選在室溫和非變性的pH，優(yōu)選pH6-8下進(jìn)行結(jié)合步驟(Zimmer，G.等人，Prog.Biophys.Molec.Biol.47(1986)37-112；Pauluhn，J.等人Ber.Bunsenges.Phys.Chem.82(1978)1265-1278)。
對(duì)于ds DNA與結(jié)合ds-DNA的抗體的結(jié)合，可以使用TBS緩沖液，優(yōu)選為室溫下pH7.4的25mM Tris和150mM氯化鈉(DiPietro，S.M.等人，Biochemistry 42(2003)6218-6227)。蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合的親和性隨著鹽濃度的增加而降低(Record，M.T.等人，J.Mol.BioL 107(1976)145-158)。
此外，可在“現(xiàn)有技術(shù)背景”的章節(jié)和本發(fā)明的實(shí)施例中引用的文獻(xiàn)和專(zhuān)利中找到適于雙鏈DNA與不同的ds-DNA結(jié)合劑相結(jié)合的條件。
在本發(fā)明所述的優(yōu)選方法中，使?jié)撛诘卮嬖谟谒鲈噭┲械乃錾锓肿优c偶聯(lián)于所述固相表面的所述結(jié)合部分相結(jié)合的所述條件包括于室溫下，10-200mM的鹽濃度，最優(yōu)選10-50mM，非變性pH，最優(yōu)選pH6-8，5-90分鐘的孵育時(shí)間，最優(yōu)選60分鐘。
在本發(fā)明所述的另一個(gè)優(yōu)選方法中，在添加步驟之前將檢測(cè)樣品中的所述生物分子所必需的所述試劑混合，由此所述試劑與所述結(jié)合部分在環(huán)境下物理接觸，并由此潛在地存在于所述試劑中的所述生物分子與偶聯(lián)于所述固相表面的所述結(jié)合部分相結(jié)合。
由于在通常情況下，為了進(jìn)行目標(biāo)分子的檢測(cè)，需要特定比率的兩種或多種試劑在添加至樣品前混合所述試劑是更為有利的，這樣試劑與所述結(jié)合部分，優(yōu)選在所有時(shí)間都進(jìn)行物理接觸。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，以適當(dāng)?shù)牧恳来螌⒃噭┘尤氲綐悠分校@樣每個(gè)試劑都與所述的結(jié)合部分，優(yōu)選在所有的時(shí)間都進(jìn)行物理接觸。
在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述的固相表面是容器或移液管吸頭的內(nèi)表面。
在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，在加入樣品前，在其表面偶聯(lián)有結(jié)合部分的容器中提供、保存和/或混合要檢測(cè)所述目標(biāo)分子所必需的試劑。若將試劑從一個(gè)容器轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)容器中，或如果將試劑最終加入樣品中，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中使用其表面偶聯(lián)有結(jié)合部分的移液管吸頭。根據(jù)本發(fā)明的用結(jié)合部分功能化的固相優(yōu)選是塑料裝置，類(lèi)似于例如試管或移液管吸頭，或玻璃裝置，例如反應(yīng)容器。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方法中，所述固相表面是指珠子的表面或多孔材料的表面。
在本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案中，將其表面偶聯(lián)有結(jié)合部分的珠子加入含有某種試劑的容器中。提供用于特定孵育時(shí)間的適當(dāng)條件，非目標(biāo)分子和/或目標(biāo)分子結(jié)合到結(jié)合部分上，并且上清液包括優(yōu)選不含非目標(biāo)分子和目標(biāo)分子的試劑。最優(yōu)選地，這些珠子是磁珠，例如商業(yè)化的磁性Dynabeads(Dynal Biotech S.A.，奧斯陸，挪威)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，使用多孔材料表面偶聯(lián)有結(jié)合部分的所述多孔材料來(lái)去除試劑內(nèi)的非目標(biāo)分子和/或目標(biāo)分子。優(yōu)選地，將多孔材料成型為過(guò)濾器，而所述的過(guò)濾器能夠與例如注射器組合，用于在從一個(gè)容器向另一個(gè)容器或向樣品轉(zhuǎn)移試劑期間，去除試劑中的非目標(biāo)分子和/或目標(biāo)分子。本發(fā)明所述的可能偶聯(lián)結(jié)合部分的多孔固相優(yōu)選是多孔無(wú)機(jī)材料，例如玻璃毛或可控孔度的玻璃。備選的是多孔塑料，比如聚乙烯(PE)或聚丙烯(PP)或聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚丙烯腈(PAT)、或聚偏二氟乙烯(PVDF)或聚苯乙烯。在本發(fā)明的另一個(gè)備選實(shí)施方案中，使用多孔有機(jī)材料，例如多孔聚合物或共聚物材料。
在本方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的結(jié)合部分通過(guò)共價(jià)鍵或生物親和鍵，優(yōu)選生物素/鏈霉親和素鍵與所述固相表面偶聯(lián)。
所述結(jié)合部分與所述固相表面的偶聯(lián)包括共價(jià)鍵，例如硅烷偶聯(lián)到羥基表面，或氨基偶聯(lián)到環(huán)氧化物，硫醇連接到金屬例如金上，例如組氨酸標(biāo)簽和鰲合劑之間的配位結(jié)合，例如生物素/鏈霉親和素的生物親和連接或生物素/抗生物素蛋白鍵。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述固相表面被包括針對(duì)結(jié)合部分的偶聯(lián)位點(diǎn)的聚合物層所覆蓋。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述結(jié)合部分的結(jié)合親和性使得試劑中的生物分子含量的減少系數(shù)至少為102，優(yōu)選至少為103。
試劑中的生物分子含量包括試劑中的目標(biāo)分子的含量和/或非目標(biāo)分子的含量，其依賴(lài)于存在于所述試劑中的核酸分子的類(lèi)型。
本發(fā)明中自始至終所使用的短語(yǔ)“結(jié)合親和性”用于定量測(cè)定結(jié)合非目標(biāo)分子和/或目標(biāo)分子的能力。某個(gè)結(jié)合部分減少非目標(biāo)分子和/或目標(biāo)分子量的能力可能取決于環(huán)境條件，即例如緩沖液的組成或溫度。在本發(fā)明的范疇內(nèi)，調(diào)整結(jié)合部分和環(huán)境條件的組合，以實(shí)現(xiàn)試劑內(nèi)非目標(biāo)分子含量和/或目標(biāo)分子含量的減少系數(shù)為至少102，優(yōu)選系數(shù)為至少103。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的方法進(jìn)一步包括下列步驟f)將與所述結(jié)合部分締合的生物分子洗脫下來(lái)，以及g)檢測(cè)所述洗脫的生物分子。
由于本發(fā)明所述的非目標(biāo)分子和/或目標(biāo)分子與結(jié)合部分的結(jié)合是可逆的，就有可能在凈化后檢測(cè)結(jié)合的分子，以研究所用試劑內(nèi)的污染，或在制備步驟期間引入的污染。如果改變緩沖液的濃度、溫度、pH、變性試劑或機(jī)械壓力方面的結(jié)合條件，就會(huì)發(fā)生所述的洗脫。優(yōu)選在適度的溫度和鹽濃度以及堿性pH下從所述結(jié)合部分上釋放非目標(biāo)分子和/或目標(biāo)分子。對(duì)于結(jié)合部分與非目標(biāo)分子和/或目標(biāo)分子之間的靜電相互作用，可以通過(guò)提高鹽濃度和相應(yīng)屏蔽作用的增強(qiáng)而獲得釋放。一般來(lái)說(shuō)可通過(guò)提高溫度而實(shí)現(xiàn)非目標(biāo)分子和/或目標(biāo)分子與結(jié)合部分的偶聯(lián)。
在本發(fā)明所述的另一個(gè)優(yōu)選方法中，所述目標(biāo)分子和所述非目標(biāo)分子是核酸分子，最優(yōu)選地，試劑中的所述目標(biāo)分子和所述非目標(biāo)分子是雙鏈核酸分子。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，結(jié)合部分是能夠連接雙鏈核酸分子的部分。
如果結(jié)合部分結(jié)合了雙鏈核酸分子，將其稱(chēng)為雙鏈核酸結(jié)合部分。在整個(gè)本發(fā)明中短語(yǔ)雙鏈核酸結(jié)合部分或′ds-NA結(jié)合劑′是等同的。
在本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合部分是聚陽(yáng)離子實(shí)體、小溝結(jié)合劑、嵌入劑或抗雙鏈核酸的抗體。
聚陽(yáng)離子實(shí)體是帶有多個(gè)電荷的大分子。就聚合體或肽來(lái)說(shuō)，這個(gè)聚陽(yáng)離子實(shí)體包括一定數(shù)量的單體，每個(gè)單體具有正電荷或負(fù)電荷，或是中性的。因此，這樣的聚陽(yáng)離子實(shí)體的特點(diǎn)在于其所帶的凈電荷，即為所有單體電荷的總和。實(shí)例是肽或聚胺酰衍生物。小溝結(jié)合劑(MGBs)，例如偏端霉素或甲基-咪唑-聚酰胺衍生物，是結(jié)合到雙鏈核酸的小溝上的分子。嵌入劑，例如放線菌素D或溴化乙錠，是結(jié)合在雙鏈核酸的堆疊的堿基對(duì)之間的分子。已知抗-dsDNA的抗體只選擇性地結(jié)合雙鏈DNA，而不結(jié)合單鏈DNA。這些種類(lèi)的ds-DNA結(jié)合劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，附加的信息包括在“現(xiàn)有技術(shù)背景”的章節(jié)中。
在本發(fā)明所述的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品中目標(biāo)分子的檢測(cè)是基于核酸擴(kuò)增反應(yīng)。
合適的DNA檢測(cè)方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，并且在標(biāo)準(zhǔn)的教科書(shū)中有描述，如Sambrook等人Molecular Cloning，ALaboratory Manual(2nd Addition，Cold Spring Harbour LaboratoryPress，Cold Spring Harbour，NY)或Ausubel等人CurrentProtocols in Molecular Biology(1987)J.Wiley和Sons，NY)。檢測(cè)方法可包括但不限于，特殊染料例如溴化乙錠的結(jié)合或嵌入，其嵌入雙鏈DNA中并在此后改變其熒光。也可任意地在限制性消化后通過(guò)電泳方法而分離純化DNA然后顯示。也可使用基于探針的分析，其中使寡核苷酸與特異性序列雜交并且隨后檢測(cè)雜交物。也可在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的進(jìn)一步的步驟之后進(jìn)行DNA測(cè)序。另一個(gè)方法是將不同的DNA序列應(yīng)用于硅芯片上，使這些硅芯片與特異的探針結(jié)合，并且當(dāng)互補(bǔ)的序列結(jié)合時(shí)產(chǎn)生信號(hào)。
對(duì)目標(biāo)核酸分子的擴(kuò)增包括擴(kuò)增樣品中核酸分子的拷貝數(shù)的任何可能。實(shí)例是使核酸拷貝數(shù)對(duì)于循環(huán)數(shù)呈幾何增長(zhǎng)的PCR或LCR擴(kuò)增，或是使核酸拷貝數(shù)對(duì)于反應(yīng)時(shí)間呈線性增長(zhǎng)的復(fù)制酶擴(kuò)增。另外可能的擴(kuò)增反應(yīng)已經(jīng)在′現(xiàn)有技術(shù)背景′一章中進(jìn)行了描述。
在所述核酸擴(kuò)增前的所有準(zhǔn)備步驟中，例如緩沖液的準(zhǔn)備、儲(chǔ)液的稀釋、酶、核苷酸、引物和探針的提供、成分的混合和/或?qū)⒃噭┮埔褐劣糜跀U(kuò)增的反應(yīng)容器中，都包括了污染樣品的一定風(fēng)險(xiǎn)。因此，在連接到固相表面的結(jié)合部分的幫助下，在所述的核酸擴(kuò)增前應(yīng)盡可能多地完成這些準(zhǔn)備步驟。
用于DNA的特別優(yōu)選的檢測(cè)方法是所謂的“同源性“分析。”同源性“分析系統(tǒng)包括報(bào)告分子或在目的序列擴(kuò)增時(shí)能產(chǎn)生信號(hào)的標(biāo)簽?！巴葱浴狈治鱿到y(tǒng)的實(shí)例是TaqMan系統(tǒng)，其已經(jīng)在US5,210,015、US 5,804,375和US 5,487,972中有詳細(xì)闡述。簡(jiǎn)單地說(shuō)，該方法是基于雙標(biāo)記探針和Taq DNA聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性。探針與通過(guò)PCR過(guò)程而擴(kuò)增的目標(biāo)序列互補(bǔ)，并且在每個(gè)聚合酶循環(huán)步驟中，探針位于兩個(gè)PCR引物之間。該探針上結(jié)合有兩個(gè)熒光標(biāo)記。一個(gè)是報(bào)告染料，例如6-羧基熒光素(FAM)，其發(fā)射光譜由于在空間上接近第二個(gè)熒光染料6-羥基-四甲基-若丹明(TAMRA)通過(guò)發(fā)生能量轉(zhuǎn)移而淬滅。在每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)過(guò)程中，在延長(zhǎng)初始DNA鏈的過(guò)程中，Taq DNA聚合酶代替和降解退火的探針，后者是由于該聚合酶固有的5′-3′核酸外切酶活性。該機(jī)制也使得報(bào)告染料從TAMRA的淬滅活性中釋放出來(lái)。因而該熒光活性隨著探針斷裂的增加而增強(qiáng)，這與生成PCR產(chǎn)物的量成比例。因此，可以通過(guò)檢測(cè)釋放的熒光標(biāo)記的強(qiáng)度來(lái)測(cè)定擴(kuò)增的目標(biāo)序列。
利用所謂的“分子信標(biāo)”(US 6,103,476)使熒光染料分子之間能量轉(zhuǎn)移的相似原理應(yīng)用于“同源性分析”。這些發(fā)夾形狀的核酸分子具有內(nèi)部淬滅的熒光團(tuán)，當(dāng)其結(jié)合目標(biāo)核酸時(shí)，熒光團(tuán)的熒光就會(huì)恢復(fù)(US 6,103,476)。將其設(shè)計(jì)成分子的環(huán)部分是與PCR過(guò)程中的目標(biāo)序列內(nèi)的區(qū)域互補(bǔ)的探針序列。通過(guò)使探針序列末端上的互補(bǔ)臂序列退火形成莖。熒光部分連接到臂的末端，淬滅部分連接到另一個(gè)臂的末端。莖使得這兩個(gè)部分互相緊密接近，導(dǎo)致由于能量轉(zhuǎn)移使熒光團(tuán)的熒光淬滅。由于淬滅劑部分是非熒光生色團(tuán)，并且放出其從作為熱源的熒光團(tuán)獲得的能量，探針不能發(fā)出熒光。當(dāng)探針遇到目標(biāo)分子，它形成比莖雜合體更長(zhǎng)更穩(wěn)定的雜合體，并且其硬度和長(zhǎng)度排除了莖雜交體的同時(shí)存在。因此，分子信標(biāo)經(jīng)歷了自發(fā)的構(gòu)象重組，迫使莖分開(kāi)，并導(dǎo)致熒光團(tuán)和淬滅劑相互間移開(kāi)，恢復(fù)可檢測(cè)到的熒光。
通過(guò)在LightCycler儀器中使用的模式(參見(jiàn)例如US 6,174,670)來(lái)提供用于“同源性”分析體系的更多實(shí)例，其中一些有時(shí)候被稱(chēng)為“相吻探針”。此外，該原理是基于兩個(gè)相互作用的染料，其特征在于通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移供體染料激發(fā)受體染料。例示的方法使用了兩個(gè)修飾的寡核苷酸作為雜交探針，其與PCR過(guò)程中目標(biāo)序列的鄰近的內(nèi)部序列雜交。5′-定位的修飾的寡核苷酸在其3’末端有一個(gè)供體染料作為標(biāo)簽。3′定位的修飾的寡核苷酸在其5′末端有一個(gè)受體染料。在擴(kuò)增循環(huán)過(guò)程中，在兩個(gè)修飾的寡核苷酸與目標(biāo)序列按從頭至尾的方向退火后，使供體和受體染料緊密接近。通過(guò)單色光脈沖的方式特異性地激發(fā)供體染料時(shí)，檢測(cè)到受體染料熒光，從而提供了對(duì)PCR產(chǎn)物形成的量的測(cè)定。
另一個(gè)分析方式是所謂的“陣列”模式?！瓣嚵小笔茄b置上的可設(shè)定地址的定位排列(例如US 5,143,854、US 6,022,963、US6,156,501、WO 90/15070、WO 92/10092)。位置數(shù)能夠從幾個(gè)到至少幾十萬(wàn)個(gè)。更重要的是，每個(gè)位置代表一個(gè)完全獨(dú)立的反應(yīng)位點(diǎn)。每個(gè)位置都攜帶一種核酸，例如“低聚的化合物”，其可作為第二核酸，特別是目標(biāo)核酸的結(jié)合伴侶。其制造方法在EP-A-0 476 014，Hoheisel，J.D.，TIBTECH 15(1997)465-469、WO 89/10977、WO89/11548、US 5,202,231、US 5,002,867、WO 93/17126中有描述。進(jìn)一步的研發(fā)已經(jīng)提供了在非常小的區(qū)域內(nèi)制備非常大的寡核苷酸探針陣列的方法(US 5,143,854、WO 90/15070、WO 92/10092)。微型制備的大量寡核苷酸探針的陣列，稱(chēng)為“DNA芯片”，為廣泛的多樣性應(yīng)用提供了重要的保證(例如US 6,156,501和US 6,022,963)。該方法的基本步驟是分離來(lái)自對(duì)照和處理樣品的核酸并且在擴(kuò)增過(guò)程中用不同的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。更詳細(xì)的是，根據(jù)US 5,545,522、US 5,716,785、US 5,891,636和US 6,291,170中描述的方法進(jìn)行，其中用包括細(xì)菌T7啟動(dòng)子的引物合成雙鏈cDNA，在存在核糖核苷三磷酸時(shí)轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的RNA，由此使標(biāo)記連接到某些核苷三磷酸上。然后任選地使這些標(biāo)記的核酸片段化、混合、并與陣列的低聚化合物雜交。
之后使用光學(xué)設(shè)備來(lái)測(cè)定每個(gè)染料對(duì)于每個(gè)單個(gè)點(diǎn)的相對(duì)強(qiáng)度。兩個(gè)探針之間熒光水平的比率顯示了樣品之間基因表達(dá)的比率。通過(guò)這些方法，研究者能夠同時(shí)評(píng)估一整套基因，而不是一次只查找一個(gè)基因的效果。之后可通過(guò)傳統(tǒng)的方法，例如northern印跡或定量實(shí)時(shí)PCR追蹤特異性基因的高差異性表達(dá)?？山M合來(lái)自多個(gè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)用于指定其他未知功能基因的功能性信息。在不同狀態(tài)下顯示出相似表達(dá)圖譜的基因很可能參與了共同的生理或代謝途徑。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了成簇分析程序，其容許檢測(cè)反映功能信息的共表達(dá)的基因群。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，所述結(jié)合部分是能夠結(jié)合生物區(qū)室的部分。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑內(nèi)的污染是生物區(qū)室，而結(jié)合部分能夠與這些生物區(qū)室相結(jié)合。生物區(qū)室是細(xì)胞或細(xì)胞的集合體。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，潛在地存在于試劑中并含有目標(biāo)和/或非目標(biāo)核酸分子的細(xì)胞或細(xì)胞的集合體是非目標(biāo)分子。由于細(xì)胞在細(xì)胞膜內(nèi)具有特定的蛋白質(zhì)或聚合物，本發(fā)明該實(shí)施方案的結(jié)合部分對(duì)這些細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有特定的親和性，以便于可逆的結(jié)合細(xì)胞或細(xì)胞集合體。本發(fā)明該實(shí)施例的可能結(jié)合部分包括，膜化合物的抗體、或細(xì)胞結(jié)合蛋白質(zhì)，優(yōu)選纖連蛋白，或這些結(jié)合蛋白的功能性部分。
另一個(gè)實(shí)施方案中，用于結(jié)合細(xì)胞或細(xì)胞集合體的結(jié)合部分是可以與膜結(jié)構(gòu)，優(yōu)選染料分子或兩性分子組裝在一起的結(jié)合部分。另外，小溝結(jié)合物(MGB)可用作結(jié)合細(xì)胞或細(xì)胞集合體的結(jié)合部分。染料的實(shí)例包括功能化的結(jié)晶紫、亞甲基蘭和番紅O，使染料以與固相表面偶聯(lián)。能夠結(jié)合細(xì)胞膜的兩性分子的實(shí)例包括，例如十二烷基磺酸鈉(SDS)、膽固醇或十二(烷)?；?xì)胞溶素，也被功能化以便與固相表面偶聯(lián)。合適的MGBs是例如偏端霉素或甲基-咪唑-聚酰胺衍生物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于結(jié)合細(xì)胞或細(xì)胞集合體的結(jié)合部分是多聚陽(yáng)離子實(shí)體。這些多聚陽(yáng)離子實(shí)體，優(yōu)選聚陽(yáng)離子肽或聚合物通過(guò)與細(xì)胞膜的多個(gè)負(fù)電荷的靜電相互作用而結(jié)合細(xì)胞。也使這些聚陽(yáng)離子實(shí)體功能化以與固相表面偶聯(lián)。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的結(jié)合部分是能夠結(jié)合雙鏈核酸分子和生物區(qū)室的部分。本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)可能的變種是特異于細(xì)胞或細(xì)胞集合體的結(jié)合部分與特異于潛在地存在于所述試劑中的雙鏈核酸分子的結(jié)合部分的組合。因此，可以使用兩種或多種不同的部分或使用一種能夠結(jié)合雙鏈核酸分子和生物區(qū)室兩者的結(jié)合部分來(lái)實(shí)施本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案。根據(jù)本發(fā)明的該實(shí)施方案的方法能夠結(jié)合基于細(xì)胞或細(xì)胞集合體和基于在單個(gè)準(zhǔn)備步驟中潛在地存在于所述試劑中的雙鏈核酸分子的污染物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及擴(kuò)增樣品中目標(biāo)核酸分子的方法，包括步驟a)提供潛在地包括目標(biāo)核酸分子的樣品，b)提供偶聯(lián)于固相表面的核酸結(jié)合部分，
c)提供為擴(kuò)增所述目標(biāo)核酸分子所必需的試劑，d)將所述試劑加入所述的樣品中，e)擴(kuò)增所述樣品中的所述目標(biāo)核酸分子，并且其中，在步驟c)或在步驟d)或在步驟c)和d)中，所述試劑與所述核酸結(jié)合部分在環(huán)境下物理接觸，由此潛在地存在于所述試劑中的所述核酸分子結(jié)合到偶聯(lián)于所述固相表面的所述核酸結(jié)合部分上。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及擴(kuò)增目標(biāo)核酸分子的方法，其避免擴(kuò)增潛在地存在于為擴(kuò)增樣品中所述目標(biāo)核酸分子所必需的所述試劑中的核酸分子，包括步驟a)提供潛在地包括目標(biāo)核酸分子的樣品，b)提供偶聯(lián)于固相表面的核酸結(jié)合部分，c)提供為擴(kuò)增所述目標(biāo)核酸分子所必需的試劑，d)向所述樣品加入所述的試劑，e)擴(kuò)增所述樣品中的所述目標(biāo)核酸分子，并且其中，在步驟c)或在步驟d)或在步驟c)和d)中，所述的試劑與所述核酸結(jié)合部分在環(huán)境下物理接觸，由此潛在地存在于所述試劑中的所述核酸分子結(jié)合到偶聯(lián)于所述固相表面的所述核酸結(jié)合部分上。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及擴(kuò)增樣品中的目標(biāo)核酸分子的方法，包括步驟a)提供偶聯(lián)于固相表面的核酸結(jié)合部分，b)提供為擴(kuò)增所述目標(biāo)核酸分子所必需的試劑，c)向潛在地包括目標(biāo)核酸分子的樣品中加入所述試劑，d)擴(kuò)增所述樣品中的所述目標(biāo)核酸分子，以及其中，在步驟b)或在步驟c)或在步驟b)和c)中，所述試劑與所述的核酸結(jié)合部分在環(huán)境下物理接觸，由此潛在地存在于所述試劑中的所述核酸分子結(jié)合到偶聯(lián)于所述固相表面的所述核酸結(jié)合部分上。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及擴(kuò)增樣品中的目標(biāo)核酸分子的方法，其避免擴(kuò)增潛在地存在于為擴(kuò)增樣品中所述目標(biāo)核酸分子所必需的所述試劑中的核酸分子，包括步驟
a)提供偶聯(lián)于固相表面的核酸結(jié)合部分，b)提供為擴(kuò)增所述目標(biāo)核酸分子所必需的試劑，c)向潛在包括目標(biāo)核酸分子的樣品中加入所述試劑，d)擴(kuò)增所述樣品中的所述目標(biāo)核酸分子，以及其中，在步驟b)或在步驟c)或在步驟b)和c)中，所述試劑與所述核酸結(jié)合部分在環(huán)境下物理接觸，由此潛在地存在于所述試劑中的所述核酸分子結(jié)合到偶聯(lián)于所述固相表面的所述核酸結(jié)合部分上。
為了擴(kuò)增核酸分子，有幾種試劑是必需的，包括緩沖溶液、酶、引物、探針、標(biāo)簽和/或核苷酸。由于要將這些試劑加入樣品中，因此確保所使用的這些試劑沒(méi)有被非目標(biāo)核酸分子以及核酸目標(biāo)分子所污染是很重要的，這樣可以避免檢測(cè)樣品內(nèi)的目標(biāo)分子時(shí)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。
潛在地存在于所述試劑中的核酸分子選自只含目標(biāo)核酸分子、只含非目標(biāo)核酸分子、以及同時(shí)含有目標(biāo)和非目標(biāo)核酸分子。上面提到的用于擴(kuò)增樣品中的目標(biāo)核酸分子，并避免擴(kuò)增潛在地存在于所述試劑中的非目標(biāo)核酸分子和/或目標(biāo)核酸分子的擴(kuò)增方法，降低了由于污染而帶來(lái)的假陽(yáng)性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)。
優(yōu)選地，在上述包括室溫和適度鹽濃度的條件下發(fā)生非目標(biāo)核酸分子和/或目標(biāo)核酸分子的結(jié)合。
在根據(jù)本發(fā)明的擴(kuò)增目標(biāo)核酸分子的另一個(gè)優(yōu)選方法中，在加入步驟d)之前混合要擴(kuò)增所述目標(biāo)核酸分子所必需的所述試劑，由此所述試劑與所述核酸結(jié)合部分在環(huán)境下物理接觸，由此潛在地存在于所述試劑中的核酸分子結(jié)合到偶聯(lián)于所述固相表面的所述核酸結(jié)合部分上。
上述關(guān)于目標(biāo)分子的檢測(cè)，要擴(kuò)增目標(biāo)核酸分子需要一種以上的試劑，因此在加入樣品前，混合所述的試劑是有利的，由此試劑與所述的結(jié)合部分，優(yōu)選在所有的時(shí)間都進(jìn)行物理接觸?？梢栽跀U(kuò)增期間，例如在實(shí)時(shí)PCR中，或在擴(kuò)增后對(duì)所擴(kuò)增的目標(biāo)核酸分子進(jìn)行檢測(cè)。
在根據(jù)本發(fā)明擴(kuò)增核酸分子的優(yōu)選方法中，所述固相材料的表面是容器或移液管吸頭的內(nèi)表面。
在根據(jù)本發(fā)明的擴(kuò)增核酸分子的另一個(gè)優(yōu)選方法中，所述固相材料的表面是珠子的表面或多孔材料的表面。
上述關(guān)于目標(biāo)分子的檢測(cè)，優(yōu)選在加入樣品前，在其表面偶聯(lián)有結(jié)合部分的容器中提供、保存和/或混合要擴(kuò)增所述目標(biāo)核酸分子所必需的試劑。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，如果將試劑從一個(gè)容器轉(zhuǎn)移到另一個(gè)容器，或是將試劑最終加入樣品中，則使用其表面偶聯(lián)有結(jié)合部分的移液管吸頭。將所述珠子的表面偶聯(lián)有結(jié)合部分的珠子加入到，例如含有某些試劑的容器中，以結(jié)合非目標(biāo)核酸分子和/或目標(biāo)核酸分子，并且獲得優(yōu)選沒(méi)有污染的上清液。也使用多孔材料的表面偶聯(lián)有結(jié)合部分的所述多孔材料來(lái)除去試劑內(nèi)的污染。優(yōu)選地，使多孔材料成型為濾器，而所述的濾器可與注射器組合，用于在將試劑從一個(gè)容器轉(zhuǎn)移到另一個(gè)容器或最終加入樣品中時(shí)，從試劑中除去非目標(biāo)核酸分子和/或目標(biāo)核酸分子。
在根據(jù)本發(fā)明的擴(kuò)增目標(biāo)核酸分子的優(yōu)選方法中，試劑中的所述非目標(biāo)核酸分子和所述的目標(biāo)核酸分子是雙鏈核酸分子，優(yōu)選雙鏈DNA分子。
在根據(jù)本發(fā)明擴(kuò)增核酸分子的另一個(gè)優(yōu)選方法中，所述核酸結(jié)合部分是雙鏈核酸結(jié)合部分。
上述關(guān)于目標(biāo)分子的檢測(cè)中已經(jīng)描述了可能的雙鏈核酸結(jié)合部分。為了能夠使雙鏈核酸分子結(jié)合ds-NA結(jié)合劑，需要將溫度控制在雜交的解鏈溫度以下。
在根據(jù)本發(fā)明擴(kuò)增目標(biāo)核酸分子的更優(yōu)選方法中，所述雙鏈核酸結(jié)合部分對(duì)單鏈核酸分子的親和性低于其對(duì)雙鏈核酸分子的親和性。
如前所述，本發(fā)明中自始至終，結(jié)合親和性是對(duì)結(jié)合部分結(jié)合非目標(biāo)分子和/或目標(biāo)分子的能力的定量測(cè)量。注意，結(jié)合親和性可能依賴(lài)于環(huán)境條件，即例如緩沖液的組成或溫度。對(duì)于將區(qū)別雙鏈核酸和單鏈核酸的ds-NA結(jié)合劑來(lái)說(shuō)，針對(duì)這兩個(gè)分子類(lèi)型的結(jié)合親和性必須是不同的。因此，在本發(fā)明的范疇中，將ds-NA結(jié)合劑和環(huán)境條件調(diào)整至能夠?qū)崿F(xiàn)這種親和性的差異。
以定量的方式測(cè)定ds-DNA結(jié)合劑的這種親和性差異的方法是，提供分別包括相同量的單鏈和雙鏈DNA分子的兩個(gè)樣品。將兩個(gè)樣品與相同數(shù)量的ds-DNA結(jié)合劑在相同的反應(yīng)條件下孵育一定時(shí)間后，定量樣品中剩下的單鏈和雙鏈DNA分子。樣品中剩余量的比例是ds-DNA結(jié)合劑對(duì)單鏈和雙鏈DNA的親和性差異。
更普遍的，ds-DNA結(jié)合劑的親和性差異必須足夠大才可能以有效的方式結(jié)合存在于含有大量短的、單鏈引物分子的試劑中的少量長(zhǎng)的雙鏈核酸分子。如果ds-DNA結(jié)合劑的親和性差異不夠大，那么短的單鏈引物分子將占據(jù)所有的結(jié)合部分，而長(zhǎng)的雙鏈核酸分子將留在試劑中(見(jiàn)實(shí)施例8)。
在根據(jù)本發(fā)明擴(kuò)增目標(biāo)核酸分子的另一個(gè)優(yōu)選方法中，所述雙鏈核酸結(jié)合部分的結(jié)合親和性使得試劑內(nèi)雙鏈核酸含量的降低系數(shù)至少為102，更優(yōu)選系數(shù)為至少103。
雙鏈核酸的含量包括試劑中雙鏈目標(biāo)核酸分子的含量和/或雙鏈非目標(biāo)分子核酸的含量，取決于所述試劑中存在的核酸分子的類(lèi)型。
根據(jù)擴(kuò)增目標(biāo)核酸分子方法的另一個(gè)實(shí)施方案，所述的雙鏈核酸結(jié)合部分是多聚陽(yáng)離子實(shí)體、小溝結(jié)合劑、嵌入劑或抗雙鏈核酸的抗體。
根據(jù)擴(kuò)增目標(biāo)核酸分子方法的優(yōu)選實(shí)施方案，所述的聚陽(yáng)離子實(shí)體是結(jié)合核酸的聚酰胺衍生物。
根據(jù)擴(kuò)增目標(biāo)核酸方法的更優(yōu)選實(shí)施方案，所述的結(jié)合核酸的聚酰胺衍生物帶有正的凈電荷，優(yōu)選每個(gè)單體帶有至少0.1個(gè)正的凈電荷，更優(yōu)選每個(gè)單體帶有至少0.2個(gè)正的凈電荷。
如上所定義的，聚陽(yáng)離子實(shí)體是帶有多個(gè)電荷的大分子。對(duì)于聚合物或肽來(lái)說(shuō)，這個(gè)聚陽(yáng)離子實(shí)體包括特定數(shù)量的單體，每個(gè)單體帶有正電荷、負(fù)電荷、或是中性的。因此，這樣的聚陽(yáng)離子實(shí)體的特征就由其凈電荷體現(xiàn)，凈電荷是所有單體電荷的總和。為了比較帶有不同數(shù)量的單體單位的聚陽(yáng)離子實(shí)體，在單體單位的這種數(shù)量上使凈電荷標(biāo)準(zhǔn)化，提供“每個(gè)單體的正凈電荷”的數(shù)量。這些聚陽(yáng)離子實(shí)體提供對(duì)雙鏈和單鏈核酸之間的特定選擇性，也就是聚陽(yáng)離子實(shí)體對(duì)雙鏈核酸比對(duì)單鏈核酸有更高的親和性。無(wú)需理論化，這個(gè)效應(yīng)也許來(lái)自于雙鏈和單鏈核酸分子中電荷的差異。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)長(zhǎng)的雙鏈核酸(例如細(xì)菌DNA)存在于含有短的單鏈核酸(例如引物)的試劑中時(shí)，基于試劑中雙鏈和單鏈核酸之間電荷差異的選擇性就更加顯著了。
根據(jù)擴(kuò)增目標(biāo)核酸分子方法的優(yōu)選實(shí)施方案，所述的小溝結(jié)合劑是偏端霉素、紡錘菌素、甲基-咪唑-聚酰胺衍生物或4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)衍生物。
根據(jù)擴(kuò)增目標(biāo)核酸分子方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述嵌入劑為吖啶衍生物，優(yōu)選吖啶黃素衍生物或菲啶鎓化合物，優(yōu)選溴化乙錠衍生物。
上述的小溝結(jié)合劑和嵌入劑以及其它分子也可用于本發(fā)明，例如在Demeunynck等人(編輯)DNA and RNA binders(Vol.1 & 2，2003，Wiley-VCH，Weinheim)的教科書(shū)中所描述的。
在根據(jù)本發(fā)明的擴(kuò)增目標(biāo)核酸分子的另一個(gè)優(yōu)選方法中，所述的雙鏈核酸結(jié)合部分通過(guò)共價(jià)鍵或通過(guò)生物親和鍵，優(yōu)選生物素/鏈霉親和素鍵，與所述固相材料的表面偶聯(lián)。
在根據(jù)本發(fā)明擴(kuò)增目標(biāo)核酸分子的另一個(gè)優(yōu)選方法中，生物素化的雙鏈核酸結(jié)合部分連接到鏈霉親和素包被的固相表面。
由于一些已經(jīng)用鏈霉親和素功能化的固相材料可商業(yè)購(gòu)買(mǎi)，因此使用這種生物親和鍵的標(biāo)準(zhǔn)體系是有利的。例如鏈霉親和素包被的DynabeadsM-280(Dynal Biotech S.A.，產(chǎn)品號(hào)112.06，Oslo，挪威)或鏈霉親和素包被的PCR管(Roche目錄號(hào)1741772，RocheDiagnostics GmbH，曼海姆)。此外，用生物素基團(tuán)修飾的不同的有機(jī)分子已經(jīng)廣泛用于本領(lǐng)域(見(jiàn)教科書(shū)Kessler(編輯)Nonradioactivelabeling and detection ofbiomolecules，1992，Springer Verlag，海德?tīng)柋?。
在根據(jù)本發(fā)明擴(kuò)增目標(biāo)核酸分子的另一個(gè)優(yōu)選方法中，該方法進(jìn)一步包括步驟f)將與所述核酸結(jié)合部分締合的核酸分子洗脫下來(lái)，以及g)檢測(cè)所述洗脫的核酸分子。
根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)優(yōu)選方法，提供了凈化后對(duì)結(jié)合非目標(biāo)核酸分子和/或目標(biāo)核酸分子進(jìn)行檢測(cè)的時(shí)機(jī)，用以了解所用試劑的污染或在檢測(cè)過(guò)程期間引入的污染。可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，例如PCR擴(kuò)增或某些陣列技術(shù)來(lái)檢測(cè)洗脫的核酸分子。
在根據(jù)本發(fā)明擴(kuò)增目標(biāo)核酸分子的更優(yōu)選方法中，步驟f)中的洗脫包括溫度處理、離子強(qiáng)度的變化、pH的改進(jìn)或變性試劑。
可以通過(guò)溫度處理、離子強(qiáng)度的變化、pH改進(jìn)和/或變性試劑來(lái)進(jìn)行所述的對(duì)結(jié)合非目標(biāo)核酸分子和/或目標(biāo)核酸分子的洗脫作用。對(duì)于以ds-NA結(jié)合劑作為結(jié)合部分以及后續(xù)的雙鏈DNA作為結(jié)合分子來(lái)說(shuō)，洗脫作用相當(dāng)于對(duì)DNA雜合物的變性，其中使溫度提高到解鏈溫度以上或堿性pH條件是優(yōu)選的。
在根據(jù)本發(fā)明的擴(kuò)增目標(biāo)核酸分子的另一個(gè)優(yōu)選方法中，所述目標(biāo)核酸的擴(kuò)增是PCR擴(kuò)增。
在根據(jù)本發(fā)明擴(kuò)增目標(biāo)核酸分子的又一個(gè)優(yōu)選方法中，所述的試劑包括寡核苷酸、核苷酸、酶和緩沖溶液。
在根據(jù)本發(fā)明擴(kuò)增目標(biāo)核酸分子的更優(yōu)選方法中，所述的寡核苷酸包括引物和探針，且所述的酶包括DNA聚合酶和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)。
在根據(jù)本發(fā)明擴(kuò)增目標(biāo)核酸分子的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述目標(biāo)核酸分子的擴(kuò)增是用于樣品的微生物感染檢測(cè)中的核酸擴(kuò)增。
樣品微生物感染檢測(cè)的實(shí)例是膿毒病檢測(cè)，用于檢測(cè)格蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，例如金黃色葡萄球菌或肺炎鏈球菌，和格蘭氏陰性菌，例如大腸桿菌或產(chǎn)氣腸桿菌。這種檢測(cè)都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并包括幾個(gè)步驟從獲得潛在地含有細(xì)菌細(xì)胞的生物樣品開(kāi)始，裂解細(xì)胞，以及最后分離遺傳物質(zhì)用于擴(kuò)增。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及固相材料，其中雙鏈核酸結(jié)合部分偶聯(lián)于所述固相材料的表面。
由固相材料和偶聯(lián)于其表面的一定數(shù)量的ds-NA結(jié)合劑構(gòu)成的復(fù)合物可以是本發(fā)明所述的固相材料和結(jié)合部分的任意組合。這個(gè)固相的表面可以是任意形狀的，因此包括例如蓋玻片的平坦表面、例如試管、容器或移液管吸頭的彎曲表面、例如磁珠的小顆粒表面、或例如玻璃毛的多孔材料表面。本發(fā)明中自始至終，容器是指單一的反應(yīng)容器，例如Eppendorf帽或離心管。作為固相材料，所有的材料都可能在本發(fā)明的范疇內(nèi)，只要這個(gè)固相材料的表面包括用于所述結(jié)合部分的結(jié)合基團(tuán)，或只要這種固相材料的表面被用于所述結(jié)合部分的結(jié)合基團(tuán)功能化。在一些情況下，有必要在結(jié)合部分偶聯(lián)前提供具有功能性包被的表面。這種功能性包被是例如聚合物涂層。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及固相材料，其中雙鏈核酸結(jié)合部分偶聯(lián)于所述固相材料的表面，而所述的固相材料是容器、珠子、或移液管吸頭。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述的固相材料是珠子或多孔材料。
在根據(jù)本發(fā)明的固相材料的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述雙鏈核酸結(jié)合部分對(duì)單鏈核酸分子的親和性低于其對(duì)雙鏈核酸分子的親和性。
在根據(jù)本發(fā)明的固相材料的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述雙鏈核酸結(jié)合部分的結(jié)合親和性使試劑內(nèi)雙鏈核酸含量的降低系數(shù)為至少102，優(yōu)選系數(shù)為至少103。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述的雙鏈核酸結(jié)合部分是聚陽(yáng)離子實(shí)體、小溝結(jié)合劑、嵌入劑或抗雙鏈核酸的抗體。
根據(jù)本發(fā)明所述的固相材料的更優(yōu)選實(shí)施方案，所述的聚陽(yáng)離子實(shí)體是結(jié)合核酸的聚酰胺衍生物。
根據(jù)本發(fā)明所述的固相材料的更優(yōu)選實(shí)施方案，所述核酸結(jié)合聚酰胺衍生物帶有正的凈電荷，優(yōu)選每個(gè)單體帶有至少0.1個(gè)正的凈電荷，更優(yōu)選每個(gè)單體帶有至少0.2個(gè)正的凈電荷。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述小溝結(jié)合劑是偏端霉素、紡錘菌素、甲基-咪唑-聚酰胺衍生物或4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)衍生物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述的嵌入劑是吖啶衍生物，優(yōu)選吖啶黃素衍生物或菲啶化合物，優(yōu)選溴化乙錠衍生物。
在根據(jù)本發(fā)明的固相材料的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的雙鏈核酸結(jié)合部分通過(guò)共價(jià)鍵或通過(guò)生物親和鍵，優(yōu)選生物素/鏈霉親和素鍵與固相材料的表面相偶聯(lián)。
在根據(jù)本發(fā)明的固相材料的更優(yōu)選實(shí)施方案中，生物素化的雙鏈核酸結(jié)合部分連接到鏈霉親和素包被的固相表面上。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是固相材料，其中聚陽(yáng)離子實(shí)體或嵌入劑作為雙鏈核酸結(jié)合部分而結(jié)合到所述固相材料的表面上。
在根據(jù)本發(fā)明的固相材料的優(yōu)選實(shí)施方案中，生物素化的聚陽(yáng)離子實(shí)體或生物素化的嵌入劑作為雙鏈核酸結(jié)合部分結(jié)合到鏈霉親和素包被的固相表面上。
本發(fā)明的另外一個(gè)方面是固相材料，其中結(jié)合部分與所述固相材料的表面偶聯(lián)，所述的固相材料能夠結(jié)合生產(chǎn)區(qū)室并且其中所述的固相材料是容器或移液管吸頭。
如前面所述，生物區(qū)室是細(xì)胞或細(xì)胞的集合體，本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案的結(jié)合部分對(duì)這些分子結(jié)構(gòu)具有某種親和性從而可逆地結(jié)合細(xì)胞或細(xì)胞的集合體。
在根據(jù)本發(fā)明的用于與生物區(qū)室結(jié)合的固相材料的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的結(jié)合部分是小溝結(jié)合物，抗體、染料、兩親性實(shí)體或聚陽(yáng)離子實(shí)體。
用于本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案的可能的結(jié)合部分包括膜化合物的抗體或細(xì)胞結(jié)合蛋白質(zhì)，優(yōu)選纖連蛋白或這些結(jié)合蛋白的功能性部件。還可能是與膜結(jié)合裝配在一起的結(jié)合部分，優(yōu)選染料分子或兩親性分子。另外，小溝結(jié)合物(MGB)也可用作結(jié)合細(xì)胞或細(xì)胞集合體的結(jié)合部分。染料的實(shí)例包括經(jīng)過(guò)官能化的結(jié)晶紫、亞甲基蘭和番紅O，以便與固體表面偶聯(lián)。能夠結(jié)合細(xì)胞膜的兩親性分子的實(shí)例包括例如十二碳烷基硫酸鈉(SDS)膽甾醇或月桂?；?細(xì)胞溶素，也已經(jīng)官能化以便與固體表面偶聯(lián)。合適的MGBs是例如偏端霉素或甲基-咪唑-聚酰胺衍生物。而且，聚陽(yáng)離子實(shí)體可以被用作結(jié)合細(xì)胞或細(xì)胞集合體的結(jié)合部分。這些聚陽(yáng)離子實(shí)體，優(yōu)選聚陽(yáng)離子肽或聚合物通過(guò)與細(xì)胞膜的多個(gè)負(fù)電荷的靜電相互作用而結(jié)合細(xì)胞。這些聚陽(yáng)離子實(shí)體也被官能化以便與固體表面偶聯(lián)。
在根據(jù)本發(fā)明的用來(lái)結(jié)合生物區(qū)室的固相材料的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物素?；慕Y(jié)合部分與鏈霉親和素包被的固相表面相結(jié)合。
本發(fā)明的又一個(gè)方面是固相材料，其中染料、兩親性實(shí)體、聚陽(yáng)離子實(shí)體或小溝結(jié)合物作為用于結(jié)合生物區(qū)室的結(jié)合部分被偶聯(lián)到所述固相材料的表面。優(yōu)選所述的結(jié)合部分是生物素化的并且所述的生物素化的結(jié)合部分結(jié)合到鏈霉親和素包被的固相材料的表面。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及固相材料，其中結(jié)合部分結(jié)合到能夠結(jié)合雙鏈核酸分子和生物區(qū)室的所述固相材料的表面。
在本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案中，所述的結(jié)合部分是能夠結(jié)合雙鏈核酸分子和生物區(qū)室的部分。本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)可能的變種是對(duì)細(xì)胞或細(xì)胞集合體特異的結(jié)合部分與對(duì)雙鏈核酸分子特異的結(jié)合部分的組合。因此，本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案可以使用兩種或多種不同的結(jié)合部分或使用一種能夠結(jié)合雙鏈核酸的分子和生物區(qū)室兩者的結(jié)合部分來(lái)實(shí)施。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案的固相材料能夠在單個(gè)的制備步驟中結(jié)合基于細(xì)胞或細(xì)胞集合體和潛在地存在于所述試劑中的雙鏈核酸分子的污染。
在用來(lái)結(jié)合雙鏈核酸分子和生物區(qū)室的固相材料的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的固相材料是珠子、多孔材料、容器或移液管吸頭。
在用來(lái)結(jié)合雙鏈核酸分子和生物區(qū)室的固相材料的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，兩種或多種結(jié)合部分被偶聯(lián)到所述固相材料的表面。
在用來(lái)結(jié)合雙鏈核酸分子和生物區(qū)室的固相材料的一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的兩種或多種結(jié)合部分選自小溝結(jié)合物、嵌入劑、抗體、染料、兩親性實(shí)體或聚陽(yáng)離子實(shí)體。
在用來(lái)結(jié)合雙鏈核酸分子和生物區(qū)室的固相材料的另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物素化的結(jié)合部分結(jié)合到鏈霉親和素包被的固相的表面。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及根據(jù)本發(fā)明的固相材料用于擴(kuò)增樣品中的目標(biāo)核酸的用途，其中避免了擴(kuò)增潛在地存在于為擴(kuò)增所述樣品中所述目標(biāo)核酸分子所必需的試劑中的核酸分子。
因此根據(jù)本發(fā)明的固相材料用于擴(kuò)增樣品中目標(biāo)核酸的用途，其避免擴(kuò)增潛在地存在于所述試劑中的非目標(biāo)和/或目標(biāo)核酸，從而降低了由于污染造成的假陽(yáng)性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)。
在本發(fā)明所述的優(yōu)選用途中，所述目標(biāo)核酸的擴(kuò)增是PCR擴(kuò)增。
在本發(fā)明所述的另一個(gè)優(yōu)選用途中，所述的目標(biāo)核酸擴(kuò)增是檢測(cè)樣品的微生物感染的一部分。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及試劑盒，其包括為進(jìn)行目標(biāo)核酸擴(kuò)增所必需的試劑，以及本發(fā)明所述的固相材料。
在本發(fā)明所述的優(yōu)選試劑盒中，所述的試劑包括寡核苷酸、核苷酸、酶和緩沖溶液。
在本發(fā)明所述的更優(yōu)選試劑盒中，所述的寡核苷酸包括引物和探針，并且所述的酶包括DNA聚合酶和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)。
在本發(fā)明所述的另一個(gè)優(yōu)選試劑盒中，所述的固相材料包括移液管吸頭和容器。
實(shí)施例1
小溝結(jié)合劑(MGB)、肽和嵌入劑的合成材料從Novabiochem(Merck Biosciences AG，Lufelfingen，瑞士)購(gòu)買(mǎi)rink酰胺樹(shù)脂和Fmoc-Glu(生物素基-PEG)-OH。從Fluka購(gòu)買(mǎi)4-(Fmoc-氨基)-1-甲基吡咯-2-羧酸(Fmoc-Amp-OH)和4-(Fmoc-氨基)-1-甲基-1H-咪唑-2-羧酸(Fmoc-Im-OH)，并從Bachem(Bubendorf，瑞士)購(gòu)買(mǎi)Fmoc-Orn-OH和Fmoc-Nva-OH。所有其他的氨基酸購(gòu)買(mǎi)自Applied Biosystems(Foster City，美國(guó))。HBTU和HOBt來(lái)自Iris Biotech(Marktredwitz，德國(guó))。從Merck AG(Darmstadt，德國(guó))獲得肽合成溶劑(DMF，NMP)，類(lèi)似的其他全部溶劑均為商業(yè)上提供的最高生化級(jí)別。
常規(guī)合成方法利用FastMoc化學(xué)反應(yīng)，手工或在Applied Biosystems Inc.433肽合成儀上合成所有的化合物。除非另有注釋?zhuān)褂靡訦OBt/HBTU和DIPEA活化1h的Fmoc氨基酸(1mmol)進(jìn)行一般的偶聯(lián)反應(yīng)。使用在DMF中的20％哌啶處理樹(shù)脂2×5min而有效地去除Fmoc。如下保護(hù)三功能的氨基酸側(cè)鏈Arg(Pmc)、Asn(Trt)、Asp(OtBu)、Gln(Trt)、Glu(OtBu)、Lys(Boc)、Ser(tBu)、Thr(tBu)、Trp(Boc)、Tyr(tBu)。
1.小溝結(jié)合劑MGB1Bi-PEG-偏端霉素H-Glu(生物素基-PEG)-Nva-Om-Nva-Amp-Amp-Amp-Arg-NH2在將第一個(gè)精氨酸常規(guī)錨定在濃度為0.25mmol的rink酰胺樹(shù)脂上后(0.43mmol/g)，隨后去除其Fmoc基團(tuán)，繼續(xù)用NMP、異丙醇和NMP洗滌樹(shù)脂。將DIPEA(DMF中為2M)加入Fmoc-Amp-OH(2mmol)和HOBt/HBTU(1∶1；2mmol)的溶液中?；罨?分鐘后，將混合物加入樹(shù)脂中。將懸浮液振蕩3小時(shí)，用DMF和異丙醇徹底洗滌樹(shù)脂。該過(guò)程重復(fù)3次直到所有的3個(gè)Amp殘基都摻入序列。如上所述切除Fmoc基團(tuán)，使用雙連接在正常連接條件下，通過(guò)Nva、Orn、Nva和Glu(生物素基-PEG)延長(zhǎng)肽鏈。在切去N端Fmoc基團(tuán)并且用DMF洗滌樹(shù)脂后，用2.8ml(每100mg樹(shù)脂)含有TFA、三乙基硅烷和乙二硫醇(0.8/0.5/1.5)的混合物切割樹(shù)脂。將樹(shù)脂過(guò)濾，用300ml冷的二異丙醚從洗提液中沉淀出肽。用乙醚洗滌沉淀，真空干燥，溶于乙酸/水(1/5)，用于在vydac polygosil上進(jìn)行制備性的HPLC純化。
LC-ESI-MSm/z＝1410.12[M+H]+，C64H104N20O14S的計(jì)算值為Mr＝1409.59Da。
MGB2雙-PEG-偏端霉素(無(wú)Arg)H-Glu(生物素基-PEG)-Nva-Om-Nva-Amp-Amp-Amp-NH2除了Fmoc-Arg(Pmc)不是作為第一個(gè)氨基酸連接到樹(shù)脂上外，根據(jù)所描述的用于MGB1的方法合成這種物質(zhì)。
LC-ESI-MSm/z＝1253.74[M+H]+；C58H92N16O13S的計(jì)算值為Mr＝1253.51Da。
MGB3雙-PEG-咪唑-衍生物H-Glu(生物素基-PEG)-Nva-Om-Nva-Im-Im-Im-Arg-NH2除了Fmoc-Amp-OH由4-(Fmoc-氨基)-1-甲基-1H-咪唑-2-羧酸(Fmoc-Im-OH)所代替外，根據(jù)所描述的用于雙-PEG-偏端霉素的方法合成這種物質(zhì)。
使用1.2ml含有TFA、水、苯甲硫醚、乙二硫醇(1/0.05/0.05/0.1)的混合物(每100mg的樹(shù)脂)來(lái)從樹(shù)脂上實(shí)現(xiàn)切割。如上所述進(jìn)行檢查和純化。
LC-ESI-MSm/z＝1412.86[M+H]+；C61H101N23O14S的計(jì)算值為Mr＝1411.9Da。
MGB4雙-PEG-咪唑-衍生物(短的)H-Glu(生物素基-PEG)-Im-Im-Im-Arg-NH2除了Fmoc-Glu(生物素基-PEG)-OH直接與Im連接外，根據(jù)所描述的用于MGB3的方法合成這種物質(zhì)。
LC-ESI-MSm/z＝1100.5[M+H]+；C46H73N19O11S的計(jì)算值為Mr＝1100.20Da。
2.肽
根據(jù)所描述的一般步驟進(jìn)行合成。如用于咪唑偏端霉素化合物所描述的方法實(shí)現(xiàn)從樹(shù)脂進(jìn)行切割，并用制備性的HPLC純化該物質(zhì)。
肽1H-Glu(生物素基-PEG)-QGRVEVLYRGSWGTVA-NH2LC-ESI-MSm/z＝1168.06[M+2H]2+；C104H168N30O29S的計(jì)算值為Mr＝2334.1Da。
肽2H-Glu(生物素基-PEG)-IGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2LC-ESI-MSm/z＝1116.58[M+3H]3+；C154H269N43O37S的計(jì)算值為Mr＝3346.7Da。
肽3雙-ZU-KKNKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRA-NH2LC-ESI-MSm/z＝696.6[M+7H]7+；Mr＝4869.2Da.
肽4雙-XUZU-KKNKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTS-NH2Mr＝5639.8Da肽5雙-XUZU-PWPLYGNEGLGWAGWLLSPRGSRPSWGPTDPRRRSR-NH2Mr＝4728.8Da肽6雙-XUUUU-QPGPPSEKAWQPGWT-NH2Mr＝2303.6Da肽7BXUZU-GGGGDDLGANDELISFKDEGEQEEK(Amid)Mr＝3219.44g/mol肽8H-Glu(生物素基-PEG)-(Arg-Gly)5-NH2LC-ESI-MSm/z＝411.39[M+4H]4+；C65H121N31O17S的計(jì)算值為Mr＝1640.9Da。
肽9H-Glu(生物素基-PEG)-(Arg-Gly)15-NH2LC-ESI-MSm/z＝755.8[M+5H]5+；C145H271N81O37S的計(jì)算值為Mr＝3773.3Da。
肽10H-Glu(生物素基-PEG)-(Lys-Gly)5-NH2
LC-ESI-MSm/z＝501.51[M+3H]3+；C65H121N21O17S的計(jì)算值為Mr＝1501.4Da。
肽11H-Glu(生物素基-PEG)-(Lys-Gly)15-NH2LC-ESI-MSm/z＝839.43[M+4H]4+；C145H271N51O37S的計(jì)算值為Mr＝3354.6Da。
肽12H-Glu(生物素基-PEG)-(Arg)20-NH2LC-ESI-MSm/z＝617.61[M+6H]6+；C145H286N86O27S的計(jì)算值為Mr＝3699.5Da。
縮寫(xiě)氨基酸和肽的命名法是根據(jù)IUPAC-IBU委員會(huì)對(duì)生化命名法(Europ.J.Biochem.138(1984)9-37)的提議。
ABI 應(yīng)用生物系統(tǒng)Amp 氨甲基吡咯-2-羧酸Boc 叔丁基羰基Da 道爾頓DIPEA 二異丙基乙胺DMF 二甲基甲酰胺ESI-MS 電噴霧電離質(zhì)譜Fmoc 9-芴甲基羰基HBTU 2-(1-氫-1-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽HOBt 1-羥基苯并三唑HPLC 高效液相色譜Im 氨甲基-1H-咪唑-2-羧酸MS 質(zhì)譜NMP N-甲基吡咯OtBu O-叔丁基PEG 聚乙二醇Pmc 2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；鵗FA 三氟乙酸Trt 三苯基甲基3.嵌入劑吖啶黃素-生物素共軛物2，7-雙(氨基)-9-(生物素基氨基乙胺基)吖啶 Toronto Reasearch Chemicals，North York，加拿大；目錄號(hào)A191100；Mr＝493.64Da(C25H31N7O2S)實(shí)施例2將幾個(gè)生物素化的ds DNA-結(jié)合劑(實(shí)施例1)固定到包被有鏈霉親和素的DynabeadsM-280(Dynal Biotech S.A.，產(chǎn)品號(hào).112.06，奧斯陸，挪威；生物素的結(jié)合容量為650pmol/mg；這些實(shí)施例自始至終都使用SA-磁珠)上，按照如下步驟進(jìn)行操作將200μl(2mg)懸浮的DynabeadsM-280轉(zhuǎn)移到PP試管中。將該試管置于磁鐵上1-2分鐘。去除上清液后，用500μl的洗滌和結(jié)合緩沖液洗滌珠子2次(5mM Tris-HCl pH7.5；0.5mM EDTA；1.0M NaCl)。之后，加入200μl洗滌和結(jié)合緩沖液以及2μl(2000pmol)生物素化的ds DNA-結(jié)合劑(c＝1000pmol/μl)，置于Eppendorf恒溫混勻儀上于室溫下孵育60分鐘。提供磁鐵從反應(yīng)后的珠子中去除上清液，之后用500μl洗滌和結(jié)合緩沖液洗滌珠子5次。將反應(yīng)后的珠子貯存在洗滌和結(jié)合緩沖液中備用(終濃度1mg反應(yīng)后的珠子/100μl洗滌和結(jié)合緩沖液)。
實(shí)施例3將小溝結(jié)合劑MGB1、MGB3和肽3(實(shí)例1)固定到鏈霉親和素包被的DynabeadsM-280(Dynal產(chǎn)品號(hào).112.06，奧斯陸，挪威；生物素的結(jié)合容量650pmol/mg；這些實(shí)施例自始至終都使用SA-磁珠)上，按照如下步驟進(jìn)行操作
將200μl(2mg)懸浮的DynabeadsM-280轉(zhuǎn)移到PP試管中。將此試管置于磁鐵上1-2分鐘。在去除上清液之后，用200μl的洗滌和結(jié)合緩沖液(5mM Tris-HCl pH7.5；0.5mM EDTA；1.0M NaCl)洗滌珠子2次。之后，加入200μl洗滌和結(jié)合緩沖液以及20μl(20μmol)生物素化的ds DNA結(jié)合劑，置于Eppendorf恒溫混勻儀上于室溫下孵育60分鐘。提供磁鐵從反應(yīng)后的珠子中去除上清液，之后用200μl洗滌和結(jié)合緩沖液洗滌珠子3-4次。將反應(yīng)后的珠子貯存在洗滌和結(jié)合緩沖液中備用(終濃度1mg反應(yīng)后的珠子/100μl洗滌和結(jié)合緩沖液)。
實(shí)施例4將小溝結(jié)合劑MGB1、MGB3和肽3(圖1和圖2)固定到鏈霉親和素包被的PCR管上(Roche目錄號(hào)1741772，Roche DiagnosticsGmbH，曼海姆；生物素結(jié)合容量61.5pmol/200μl管)，按照如下步驟進(jìn)行操作用緩沖液(50mM Tris-HCl pH8.1；LC膿毒病 試劑盒，鑒定號(hào)為04493613，Roche Diagnostics GmbH，德國(guó))洗滌試管2次，之后加入195μl緩沖液和5μl生物素化的ds-NA結(jié)合劑(在10mM Tris，pH8.0中；c＝1000pmol/μl)。于37℃(水浴)孵育20分鐘后，小心地用吸管除去上清液，并用緩沖液洗滌試管3-4次。
實(shí)施例5在本實(shí)驗(yàn)中使用若干小溝結(jié)合劑/SA-磁珠復(fù)合物除去來(lái)自細(xì)菌DNA(表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis))的污染。
對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，將50μl(0.5mg)的MGB/SA-磁珠復(fù)合物(見(jiàn)實(shí)施例2)轉(zhuǎn)移到滅菌和硅烷化的試管中，用250μl的緩沖液(10mMTris-HCl pH8.0)洗滌大約4次，完全去除上清液。之后，向每個(gè)試管加入40μl表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的DNA溶液(DNA標(biāo)準(zhǔn)來(lái)自LC膿毒病試驗(yàn)，Roche鑒定號(hào)為04493613)。在室溫下孵育期間混合試管60分鐘。通過(guò)PCR在Light Cycler 1.2上分析上清液。通過(guò)在50mM Tris-HCl緩沖液pH8.1中的細(xì)菌DNA(表皮葡萄球菌儲(chǔ)液；c＝105cp/10μl)的1∶10稀釋液系列獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
利用Light Cycler葡萄球菌試劑盒M級(jí)(Roche目錄號(hào)3 376419，Roche Diagnostics GmbH，曼海姆)在Light Cycler Version 1.2上進(jìn)行定量反應(yīng)，按照如下循環(huán)條件95℃變性10分鐘，之后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，包括50℃下15秒進(jìn)行熒光測(cè)量獲得曲線，72℃下10秒以及95℃下10秒。循環(huán)后快速冷卻到40℃，再以0.1℃/min的斜率使溫度升高到95℃，通過(guò)連續(xù)熒光測(cè)定進(jìn)行解鏈分析。
圖3中總結(jié)了該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中1.7×104cp得到了凈化?？傊穗?和肽7外，所有結(jié)合劑的凈化效率都在103-104之間。
實(shí)施例6使用Light Cycler對(duì)照試劑盒DNA(Roche目錄號(hào)2158833，Roche Diagnostics GmbH，曼海姆)，Light Cyler DNA Master雜交探針(Roche目錄號(hào)2 015 102，Roche Diagnostics GmbH，曼海姆)和LightCycler 1.2儀器(Roche目錄號(hào)2 011 468；軟件版本LC 3.5)來(lái)評(píng)估幾個(gè)ds DNA結(jié)合劑分子的凈化效率。
在每個(gè)凈化實(shí)驗(yàn)中，用0.5mg的ds DNA結(jié)合劑/SA-磁珠復(fù)合物(制備同實(shí)施例2)凈化含有60μl hg DNA的溶液(用于對(duì)照反應(yīng)的模板來(lái)自Light Cycler對(duì)照試劑盒DNA(β-球蛋白基因的110bp片段))。將來(lái)自試劑盒的hg DNA在10mM pH8.0的Tris中制得1∶10系列的稀釋溶液來(lái)獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
在Eppendorf恒溫混勻儀上于室溫孵育60分鐘后，按照試劑盒的操作手冊(cè)對(duì)上清液進(jìn)行PCR分析。
在Light Cycler儀器上進(jìn)行定量反應(yīng)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的程序進(jìn)行檢測(cè)，并采用下述循環(huán)條件95℃下變性30秒，之后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，包括55℃下10秒進(jìn)行熒光測(cè)量獲得曲線，72℃下5秒以及95℃下0秒，最后以20℃/s的斜率冷卻到40℃。使用來(lái)自試劑盒的hg DNA的系列稀釋液評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖4中總結(jié)了本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中1.2×104cp得到了凈化?？傊?，除了肽6和肽7外，所有結(jié)合劑的凈化效率都在102-104之間。
實(shí)施例7
使用細(xì)小病毒B19定量試劑盒(Roche目錄號(hào)3 246 809，RocheDiagnostics GmbH，德國(guó))和LightCycler 1.2儀器(Roche目錄號(hào)2011468，Roche Diagnostics GmbH，德國(guó)；軟件版本LC 3.5)來(lái)測(cè)定3個(gè)ds-NA(MGB1、MGB3和肽3)結(jié)合劑的凈化效率。
對(duì)于每個(gè)凈化實(shí)驗(yàn)，將來(lái)自實(shí)施例3的10μl(0.1mg)ds-NA結(jié)合劑/SA磁珠復(fù)合物轉(zhuǎn)移到PP試管中，用10mM pH8.0的Tris洗滌2次。去除上清液后，加入20μl含質(zhì)粒DNA的溶液(細(xì)小病毒DNA標(biāo)準(zhǔn)，來(lái)自細(xì)小病毒B19定量試劑盒Roche目錄號(hào)3 246 809，RocheDiagnostics GmbH，德國(guó))。置于混勻儀上(Thermomixer Comfort，目錄號(hào)5350000.013，Eppendorf，德國(guó))于室溫下孵育60min，按照試劑盒操作指導(dǎo)通過(guò)PCR分析上清液。
在Light Cycler儀器上進(jìn)行定量，并按照試劑盒操作手冊(cè)上的步驟進(jìn)行分析，無(wú)需加入內(nèi)對(duì)照，使用下列循環(huán)條件95℃下變性10分鐘，之后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，包括60℃下15秒進(jìn)行熒光測(cè)量獲得曲線，72℃下10s以及95℃下10s。最后以20℃/s的斜率冷卻到40℃。使用來(lái)自試劑盒的DNA標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖5中概述了這些凈化實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線?？傊@得了下述的凈化效率4×102(對(duì)于MGB1)，2.6×102(對(duì)于MGB3)和1.6×103(對(duì)于肽3)。
表實(shí)施例7的結(jié)果
實(shí)施例8
為了評(píng)估3個(gè)不同的ds-NA結(jié)合劑(MGB1，MGB3和肽3)對(duì)于雙鏈和單鏈寡核苷酸的時(shí)間依賴(lài)性方式的選擇性而進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。
用ds-NA結(jié)合劑/SA-磁珠復(fù)合物(來(lái)自實(shí)施例3)以時(shí)間依賴(lài)性的方式凈化兩個(gè)單鏈寡核苷酸溶液(5′-CCC ATC CCC AAA AAC ACAAAC CAC A PO4-3′；c＝14,189OD/ml[49,9μM]溶于10mM Tris ph8.0中)，一個(gè)加入質(zhì)粒DNA，另一個(gè)不加(細(xì)小病毒DNA標(biāo)準(zhǔn)，來(lái)自Light Cycler細(xì)小病毒B19定量試劑盒，Roche目錄號(hào)3 246 809，Roche Diagnostics GmbH，曼海姆)。1、6和48小時(shí)后使用UV-吸光度(UVIKON 931分光光度計(jì)，Kontron，德國(guó))來(lái)測(cè)定上清液中的寡核苷酸濃度，而且對(duì)于含有質(zhì)粒DNA的溶液，通過(guò)上述實(shí)施例中描述的PCR評(píng)估其凈化效率。為了進(jìn)行對(duì)照，僅在緩沖液中(TBE緩沖液10mM Tris-HCl pH8.0)凈化含有質(zhì)粒DNA的溶液并同樣用PCR定量。
將細(xì)小病毒B19質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)DNA(c＝5×105cp/μl)加入單鏈寡核苷酸溶液(比率1∶4(v/v))。對(duì)于圖6和圖7的每個(gè)實(shí)驗(yàn)，將100μl(1mg)置于洗滌和結(jié)合緩沖液中的的雙-PEG-偏端霉素/SA-磁珠轉(zhuǎn)移到硅烷化并滅菌的PP試管中，用10mM pH8.0的Tris洗滌兩次，并完全去除上清液。之后，將200μl的寡核苷酸溶液都加入到含有珠子的兩個(gè)不同試管中，并在1、6、和48小時(shí)后測(cè)定寡核苷酸溶液的吸光率(λ＝260nm)以確定上清液的濃度。另外，在Light Cycler 1.2上，使用所有的3個(gè)ds-NA結(jié)合劑(圖7)按照前述實(shí)驗(yàn)中描述的方法通過(guò)PCR對(duì)含有和不含有單鏈寡核苷酸的質(zhì)粒DNA溶液進(jìn)行分析。
圖6和圖7中總結(jié)了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。從吸光率實(shí)驗(yàn)(圖6)中，可以看出在ss寡核苷酸存在時(shí)，雙-PEG-偏端霉素/SA磁珠復(fù)合物的ds DNA結(jié)合選擇性。甚至在存在大量的單鏈寡核苷酸時(shí)，從樣品中有效地去除了ds DNA分子。LightCycler定量(圖7)證實(shí)了，在ss寡核苷酸存在時(shí)如果使用生物素化的肽3作為ds-NA結(jié)合劑，ds DNA的時(shí)間依賴(lài)的選擇性結(jié)合是最好的。
實(shí)施例9在本實(shí)驗(yàn)中，使用雙-PEG-偏端霉素/SA磁珠復(fù)合物去除來(lái)自細(xì)菌DNA的污染(肺炎鏈球菌DNA，來(lái)自LC膿毒病試劑盒，Id.nr.04493613，Roche Diagnostics GmbH，德國(guó))，之后從珠子上洗脫結(jié)合的DNA。
對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，將10μl(0.1mg)的雙-PEG-偏端霉素/SA磁珠復(fù)合物(來(lái)自實(shí)施例3)轉(zhuǎn)移到滅菌并硅烷化的試管中，用緩沖液(50mMTris-HCl pH8.1)洗滌2次，再重懸于20μl相同的緩沖液中。通過(guò)在50mM Tris-HCl緩沖液pH8.1中制得1∶10的細(xì)菌DNA(肺炎鏈球菌儲(chǔ)液c＝106cp/μl)系列稀釋液而獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
之后向每個(gè)試管中加入20μl肺炎鏈球菌DNA溶液。在室溫下混合孵育期間，使試管混合60分鐘。在Light Cycler 1.2上通過(guò)PCR法分析上清液。使用Light Cycler膿毒病試劑盒(Id.nr.04493613，Roche Diagnostics GmbH，德國(guó))在Light Cycler Version 1.2(目錄號(hào)2011468，Roche Diagnostics GmbH，德國(guó)；軟件版本LC 3.5)上進(jìn)行定量反應(yīng)，按照下列循環(huán)條件進(jìn)行95℃變性10分鐘，之后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，包括60℃下25秒的熒光測(cè)量獲得曲線，72℃下40秒以及95℃下20秒。循環(huán)之后快速冷卻到40℃再以0.1℃/min的斜率使溫度升高到95℃，通過(guò)連續(xù)熒光測(cè)定進(jìn)行解鏈分析。
去除上清液后，用PCR水(來(lái)自膿毒病試劑盒)洗滌每個(gè)試管(含有雙-PEG-偏端霉素/SA-磁珠復(fù)合物)兩次。之后加入40μl的10mMNaOH，并將試管在混勻儀(Thermomixer Comfort，目錄號(hào)5350000.013，Eppendorf，德國(guó))上在室溫下孵育60分鐘。通過(guò)PCR分析從珠子上洗脫的含有DNA的上清液。
圖8中總結(jié)了本實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線，證明了去除細(xì)菌DNA污染的功效。凈化后，上清液含有17cp/μl，而從珠子洗脫的結(jié)合分子的上清液含有340cp/μl。
表實(shí)施例9的結(jié)果
實(shí)施例10在本實(shí)驗(yàn)中，在雙-PEG-偏端霉素/SA-包被的試管中進(jìn)行細(xì)菌DNA(肺炎鏈球菌DNA，來(lái)自LC膿毒病試劑盒，Id.nr.04493613，Roche Diagnostics GmbH，德國(guó))的凈化，隨后從試管中洗脫結(jié)合的DNA。
制備緩沖液(TBE緩沖液50mM Tris-HCl pH8.1)中的肺炎鏈球菌DNA(肺炎鏈球菌儲(chǔ)液c＝106cp/μl)的溶液(比率1∶1(c/v))。通過(guò)細(xì)菌DNA在50mM Tris-HCl pH8.1緩沖液中以1∶10的稀釋系列獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
向每個(gè)試管(雙-PEG-偏端霉素/SA-包被的試管復(fù)合物，來(lái)自實(shí)施例4)加入40μl制得的溶液，在混勻儀(Thermomixer Comfort，目錄號(hào)5350000.013，Eppendorf，德國(guó))上在室溫下孵育60分鐘。使用Light Cycler膿毒病試劑盒在Light Cycler 1.2(目錄號(hào)2011468.Roche Diagnostics GmbH，德國(guó)；軟件版本LC 3.5)上通過(guò)PCR分析上清液，按照下列循環(huán)條件進(jìn)行定量反應(yīng)95℃變性10分鐘，之后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，包括60℃下25秒的熒光測(cè)量獲得曲線，72℃下40秒和95℃下20秒。循環(huán)之后快速冷卻到40℃再以0.1℃/min的斜率使溫度升高到95℃，通過(guò)連續(xù)熒光測(cè)定進(jìn)行解鏈分析。
去除上清液后，用PCR水(來(lái)自 膿毒病試劑盒)洗滌每個(gè)試管兩次。之后加入40μl的10mM NaOH并使試管在混合器上于室溫孵育60分鐘。隨后通過(guò)PCR分析從試管上洗脫下的含有DNA的上清液。
圖9中總結(jié)了本實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線，證明了試管對(duì)于細(xì)菌DNA的凈化功效。凈化后，上清液中完全不含有可檢測(cè)到的分子，而從試管洗脫的結(jié)合分子的上清液含有38cp/μl。
表實(shí)施例10的結(jié)果
實(shí)施例11在本實(shí)驗(yàn)中，使用幾種細(xì)菌結(jié)合劑/SA-磁珠復(fù)合物來(lái)去除來(lái)自細(xì)菌(表皮葡萄球菌)的污染。
對(duì)于每個(gè)試驗(yàn)，將50μl(0.5mg)細(xì)菌結(jié)合劑/SA-磁珠復(fù)合物(參見(jiàn)實(shí)施例2，關(guān)于生物素化的結(jié)合劑在鏈霉親和素包被的Dynabeads上的固定化)。
轉(zhuǎn)移到一個(gè)無(wú)菌的硅化的試管中，用250μl緩沖液(10mM Tris-HCl，pH8.0)洗滌大約4次，完全除去上清液。之后，向每個(gè)試管中加入40μl表皮葡萄球菌細(xì)菌稀釋液。在室溫下溫育期間，將試管混合60分鐘。通過(guò)PCR在Light Cycler 1.2(Roche DiagnosticsGmbH，Germany；Software Version LC 3.5)上分析上清液。通過(guò)細(xì)菌儲(chǔ)備液(表皮葡萄球菌儲(chǔ)備溶液；C＝9×103DNA當(dāng)量份數(shù)/10μl)在10mM Tris-HCl緩沖液pH8.0中的1∶10稀釋系列得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。
使用Light Cycler葡萄球菌試劑盒M級(jí)(Roche目錄號(hào)3 376 419，Roche Diagnostics GmbH，Germany)，以下列條件在Light CyclerVersion 1.2上進(jìn)行定量反應(yīng)在95℃變性10分鐘，然后進(jìn)行45個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，每個(gè)循環(huán)具有下列概略特征50℃15秒，進(jìn)行熒光測(cè)定、72℃10秒和95℃10秒。在擴(kuò)增反應(yīng)后，立即通過(guò)快速冷卻到40℃，然后以0.1℃/分鐘的斜率速度升溫到95℃，利用連續(xù)的熒光測(cè)定來(lái)進(jìn)行熔融分析。
將該試驗(yàn)的結(jié)果概括在圖10中。在試驗(yàn)中，除去了大約3.4×103和4.5×104個(gè)拷貝數(shù)的細(xì)菌。結(jié)論是，可以除盡完整的細(xì)菌，凈化效率最高達(dá)到103的量級(jí)，其中小溝結(jié)合劑和帶正電荷的肽的工作效率最好，而帶負(fù)電荷的肽則根本不起作用。
參考文獻(xiàn)列表Abramson，R.D.and Myers，T.W.Current Opinion inBiotechnology 4(1993)41-47Abravaya，K.等人Nucleic Acid Ampl.Technol.Chapter 9(1997)125-133Aslam & DentBioconjugation(2000，Macmillian Reference，London，GBAusubel等人Current Protocols in Molecular Biology(1987)J.Wiley and Sons，NYBarany，F(xiàn).，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)189-193Barany，P.，PCR Methods and Applic.1(1991)5-16Boger，D.L.等人，J.Am.Chem.Soc.123(2001)5878-5891Brana，M.F.等人，Curr.Pharm.Design 7(2001)1745-1780Corless，C.E.等人，J.Clin.Microbiol. 38(2000)1747-1752Demeunynck等人(Eds.)DNA and RNA binders(Vol.1 & 2，2003，Wiley-VCH，WeinheimDi Pietro，S.M.等人.Biochemistry 42(2003)6218-6227Dore，K.等人，JACS 126(2004)4240-4244EP 0 281 390EP 0 439 182EP 0 476 014EP 0 585 660EP 0 792 376Fish，E.L.等人Biochemistry 27(1988)6026-6032Fox，J.C.等人，J.Virol. Meth.33(1991)375-3823Guatelli，J.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)1874-1878Hilali，F(xiàn).等人，Mol.Biotechnol.7(1997)207-216Hoheisel，J.D.，TIBTECH 15(1997)465-469IUPAC-IBU Commission on Biochemical Nomenclature，Europ.J.Biochem.138(1984)9-37 Kessler(Ed.)Nonradioactive labeling anddetection of biomolecules，1992，Springer Verlag，HeidelbergKlaschik，S.等人，Mol.Biotechnol.22(2002)231-242Koepsel，R.R.And Russell，A.J.，Biomacromolecules 4(2003)850-855Kwoh，D.Y.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)1173-1177Li，M.等人Bioorg.Med.Chem.Letters 12(2003)4351-4354Mantero，G.等人，Clin.Chem.37(1991)422-429Pauluhn，J.等人，Ber.Bunsenges.Phys.Chem.82(1978)1265-1278Prince，A.M.and Andrus，L，Biotechniques 12(1992)358-360Record，M.T.等人，J.Mol.Biol.107(1976)145-158Sambrook，J.等人Molecular CloningA Laboratory Manual(2nd ed.，Cold Spring Harbour Laboratory Press，Cold SpringHarbour，NYStewart，K.D.等人，J.Phys.Org.Chem.5(1992)461-466Stryer，Biochemistry，4th edition(1995)W H Freeman & Co，NV，USATijssen，P.Practice and theory of enzyme immunoassays(1985，Elsevier，Amsterdam，NetherlandsUS 4,683,195US 5,002,867US 5,130,238US 5,143,854US 5,202,231US 5,210,015US 5,487,972US 5,545,522US 5,716,785US 5,804,375US 5,891,636US 6,022,963US 6,103,476
US 6,156,501US 6,174,670US 6,291,170US 2002/0006617US 2001/0026921US 2002/0095073US 2003/0130499Vogelstein，B.，and Gillespie，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)615-619 Whelen，A.C.and Persing，D.H.，Annu.Rev.Microbiol.50(1996)349-373WO 00/69872WO 01/09370WO 01/94573WO 02/06117WO 02/48164WO 03/33698WO 0401418WO 89/10977WO 89/11548WO 90/01069WO 90/15070WO 91/19003WO 92/0880WO 92/10092WO 93/17126WO 2002/060539WO 2002/074993WO 2002/82078Wu，D.Y.and Wallace，R.B.，Genomics 4(1989)560-569Zimmer，G.等人.Prog.Biophys.Molec.Biol.47(1986)37-112
序列表<110>Hoffmann La Roche AG<120>一種減少假陽(yáng)性結(jié)果的方法<130>22697FF<150>EP 04019636<151>2004-08-19<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于實(shí)施例的人工序列<220>
<221>3’-磷酸<222>(25)..(25)<400>1cccatcccca aaaacacaaa ccaca 25
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)樣品中生物分子的方法，其避免檢測(cè)到潛在地存在于為檢測(cè)樣品中的生物分子所必需的試劑中的生物分子，包括步驟a)提供潛在地包括所述生物分子的樣品，b)提供偶聯(lián)于固相表面的結(jié)合部分，c)提供為檢測(cè)生物分子所必需的試劑，d)向所述樣品中加入所述試劑，e)檢測(cè)樣品中的生物分子，其中，在步驟c)或在步驟d)或在步驟c)和d)中，所述的試劑在環(huán)境下與所述的結(jié)合部分物理接觸，由此潛在地存在于所述試劑中的所述生物分子結(jié)合到偶聯(lián)于所述固相表面的所述結(jié)合部分上。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中所述的固相表面是容器或移液管吸頭的內(nèi)表面。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中所述固相表面是珠子的表面或多孔材料的表面。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1至3的方法，其中所述結(jié)合部分的結(jié)合親和力實(shí)現(xiàn)了試劑中生物分子含量的減少，其減少系數(shù)至少為102，優(yōu)選系數(shù)至少為103。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1至4的方法，其中所述的結(jié)合部分是能夠結(jié)合雙鏈核酸分子的部分。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1至4的方法，其中所述的結(jié)合部分是能夠結(jié)合生物區(qū)室的部分。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1至4的方法，其中所述的結(jié)合部分是能夠結(jié)合雙鏈核酸分子和生物區(qū)室的部分。
8.一種擴(kuò)增目標(biāo)核酸分子的方法，包括步驟a)提供潛在地包括目標(biāo)核酸分子的樣品，b)提供偶聯(lián)于固相表面的核酸結(jié)合部分，c)提供為擴(kuò)增所述目標(biāo)核酸分子所必需的試劑，d)向所述樣品中加入所述試劑，e)擴(kuò)增所述樣品中的所述目標(biāo)核酸分子，其中，在步驟c)或在步驟d)或在步驟c)和d)中，所述的試劑在環(huán)境下與所述的核酸結(jié)合部分物理接觸，由此潛在地存在于所述試劑中的所述生物分子結(jié)合到偶聯(lián)于所述固相表面的所述核酸結(jié)合部分上。
9.根據(jù)權(quán)利要求
8的方法，其中所述固相的所述表面是容器或移液管吸頭的內(nèi)表面。
10.根據(jù)權(quán)利要求
8的方法，其中所述固相的所述表面是珠子的表面或多孔材料的表面。
11.根據(jù)權(quán)利要求
8至10的方法，其中所述的核酸結(jié)合部分是結(jié)合雙鏈核酸的部分。
12.根據(jù)權(quán)利要求
11的方法，其中所述結(jié)合雙鏈核酸的部分是聚陽(yáng)離子實(shí)體、小溝結(jié)合劑、嵌入劑或抗雙鏈核酸的抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求
11至12的方法，其中生物素化的結(jié)合雙鏈核酸的部分結(jié)合到鏈霉親和素包被的固相表面上。
14.根據(jù)權(quán)利要求
8至13的方法，其中所述目標(biāo)核酸分子的擴(kuò)增是用于樣品中微生物感染檢測(cè)的核酸擴(kuò)增。
15.一種固相材料，其中結(jié)合雙鏈核酸的部分與所述固相的表面偶聯(lián)，而所述的固相材料是容器、珠子或移液管吸頭。
16.根據(jù)權(quán)利要求
15的固相材料，其中所述的結(jié)合雙鏈核酸的部分是聚陽(yáng)離子實(shí)體、小溝結(jié)合劑、嵌入劑或抗雙鏈核酸抗體。
17.一種固相材料，其中聚陽(yáng)離子實(shí)體或嵌入劑作為結(jié)合雙鏈核酸的部分偶聯(lián)到所述固相材料的表面。
18.一種固相材料，其中結(jié)合部分偶聯(lián)到能夠結(jié)合生物區(qū)室的所述固相材料的表面，并且所述的固相材料是容器或移液管的吸頭。
19.根據(jù)權(quán)利要求
18所述的固相材料，其中所述的結(jié)合部分是小溝結(jié)合物、抗體、染料、兩親性實(shí)體或聚陽(yáng)離子實(shí)體。
20.一種固相材料，其中染料、兩親性實(shí)體、聚陽(yáng)離子實(shí)體或小溝結(jié)合物被偶聯(lián)到所述固相材料的表面作為生物區(qū)室的結(jié)合部分。
21.一種固相材料，其中結(jié)合部分被偶聯(lián)到能夠結(jié)合雙鏈核酸分子和生物區(qū)室的所述固相材料的表面。
22.根據(jù)權(quán)利要求
21的固相材料，其中所述的固相材料是珠子、多孔材料、容器或移液管吸頭。
23.根據(jù)權(quán)利要求
21至22的固相材料，其中兩種或多種結(jié)合部分被偶聯(lián)到所述固相材料的表面。
24.根據(jù)權(quán)利要求
23的固相材料，其中所述的兩種或多種結(jié)合部分選自小溝結(jié)合物、嵌入體、抗體、染料、兩親性實(shí)體或聚陽(yáng)離子實(shí)體。
25.根據(jù)權(quán)利要求
15至24的固相材料用于擴(kuò)增樣品中的目標(biāo)核酸的用途，其中避免了擴(kuò)增在為擴(kuò)增所述樣品中的所述目標(biāo)核酸分子所必需的試劑中潛在地存在的核酸分子。
26.根據(jù)權(quán)利要求
25的用途，其中所述目標(biāo)核酸分子的擴(kuò)增是樣品微生物感染檢測(cè)中的一部分。
27.包括為進(jìn)行目標(biāo)核酸分子擴(kuò)增所必需的試劑和權(quán)利要求
15至24所述的固相材料的試劑盒。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明提供了用于消除來(lái)自某些分子的液體污染的方法和化合物。特別地，本發(fā)明指向保持試劑不含雙鏈核酸分子的方法和化合物。更特別地，本發(fā)明指向確保沒(méi)有擴(kuò)增污染的擴(kuò)增核酸的方法和化合物。
文檔編號(hào)C12Q1/68GKCN1737165SQ200510092690
公開(kāi)日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2005年8月18日
發(fā)明者F·博格曼, A·埃謝里希, D·海因德?tīng)? J·克雷布斯, H·范德埃爾茲 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan