專利名稱:新型熱帶假絲酵母cj－fid(kctc 10457bp)及用其制造木糖醇的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新型熱帶假絲酵母CJ-FID和一種用其制造生產木糖醇的方法。更具體來說，本發(fā)明涉及一種從蜂蜜中得到的熱帶假絲酵母CJ-FID，以及一種高產量和高產率地生產高純度木糖醇的方法，其中包括培養(yǎng)該熱帶假絲酵母本身或者培養(yǎng)在含有高濃度木糖和蔗糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中的海藻酸鹽固定化熱帶假絲酵母CJ-FID來獲得含木糖醇的培養(yǎng)物，之后用活性炭柱和陰離子柱純化，最終獲得粉末狀的木糖醇。
背景技術：
木糖醇是一種糖醇，通過氫化作用將作為五碳糖的木糖的還原性末端基團轉化為醇基而制成，其在天然植物，如水果、蔬菜和蘑菇中少量存在。已經(jīng)知道木糖醇是哺乳動物碳水化合物代謝中的中間產物。由于其化學結構的緣故木糖醇比其它的糖類更加穩(wěn)定，有高度的親水性，而且不會發(fā)生褐變反應。
木糖醇的甜度和蔗糖相當，但是卡路里含量低并且不會引起血糖升高或齲齒。在這方面，木糖醇作為糖的替代品而非常流行(McNutt K.，A.Sentki.1996.Sugar replacersa growing group of sweeteners in the UnitedStates.Nutr.Today.31(6)255-261)。木糖醇在人的腸道中通過主動擴散而被吸收。然而，由于吸收率很低，未被腸道完全吸收的木糖醇被排出體外。被吸收的木糖醇通過腸道微生物的作用而部分降解掉了，在人體中利用的只有一小部分。在這點上，木糖醇成為了低卡路里的甜味劑。
特別是，由于其被細胞組織吸收時不需要胰島素，因此木糖醇被用作糖尿病患者的糖替代物。此外，因為其甜度與蔗糖相當并且其能抵消熱量耗散，因此木糖醇可在口腔內引起清涼和清新的感覺。因而，木糖醇被用于各種食品工業(yè)中，包括糖果食品和口香糖。此外，它通過抑制引起齲齒的變異鏈球菌(Streptococcus mutans)的生長，可防止產生齲齒，并因而被用作牙膏的原料。
木糖醇存在于蔬菜或水果中，但是由于其含量很低，從這些來源中提取木糖醇不經(jīng)濟。因此，人們主要采用木糖醇的化學制品。依照該化學制備方法，在高溫高壓條件下通過將存在于木頭、稻草、小米等等中的半纖維素的水解產物木糖進行化學還原可制備木糖醇。然而，從來自于半纖維素片段的其它聚合物糖類的水解產物中分離和純化木糖或木糖醇很困難，并且木糖和木糖醇的收率僅有50-60％。而且，還存在高溫高壓反應的風險和由于使用酸或堿造成的廢料處理問題。
利用微生物作為生物催化劑將木糖培養(yǎng)基中的木糖轉化成木糖醇也是公知的。也就是說，在微生物中，在木糖培養(yǎng)基中的木糖被跨細胞膜運輸，然后通過NADPH輔酶依賴型木糖還原酶(XR)轉化成木糖醇。從微生物細胞中釋放出大量積聚的木糖醇。利用微生物得到的木糖醇產物的優(yōu)點在于，不需要從木糖中分離木糖醇，因為在發(fā)酵之后木糖被完全消耗掉了，并且采用的條件溫和，例如室溫和大氣壓。然而，由于難以高效并有選擇性地去除副產物，如有機酸和甘油、介質成分、以及通常包含在發(fā)酵介質中的來自于微生物的物質，因而難以純化出高純度的木糖醇，導致了產率較低。
已公開的公開號為No.10-2001-49918的韓國專利公開了一種利用氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)ATCC 621從阿拉伯糖醇制備木糖醇的方法。根據(jù)該專利文件中的公開內容，從200ml 45g/L最終得到的木糖醇溶液中純化出木糖醇。然而，該文件并沒有公開一個準確的純化收率結果。而且，由于木糖醇從低濃度(50g/L)的溶液中制得，所以不能確保高濃度和高效的木糖醇生產。近來，為了解決這些問題，人們針對新型酵母菌株的分離和利用該新型酵母菌株來制備木糖醇的方法進行了許多研究。

發(fā)明內容
鑒于這些問題，本發(fā)明提供了一種新型熱帶假絲酵母CJ-FID。本發(fā)明還提供了一種高收率和高產率地生產高純度木糖醇的方法。
下文中將通過本發(fā)明的實施例來實現(xiàn)本發(fā)明的上述以及其它的目的。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種產木糖醇的熱帶假絲酵母CJ-FID(KCTC 10457BP)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種海藻酸鹽凝膠珠，其制備是通過將熱帶假絲酵母加入到褐藻酸水溶液，攪拌得到均勻溶液，并將該均勻溶液滴加到鈣鹽中而得到。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種制備木糖醇的方法，包括制備含木糖和蔗糖的產木糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基，將含有熱帶假絲酵母CJ-FID的海藻酸鹽凝膠珠接種到發(fā)酵培養(yǎng)基上，并在發(fā)酵罐中使該發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵。
該方法可進一步包括用活性炭柱純化經(jīng)過發(fā)酵過程產生的含木糖醇的發(fā)酵培養(yǎng)物，用陰離子柱純化所述純化過程產生的木糖醇溶液，并由所述陰離子柱純化制得的木糖醇溶液來制備木糖醇粉末。
在下文中，將對本發(fā)明進行更詳細的說明。
產木糖醇的酵母菌株的分離從國內產蜂蜜的地區(qū)采得天然蜂蜜樣品并在消毒試管中適當?shù)叵♂?。?0℃下在含有200-400g/L木糖、5g/L酵母提取物、5g/L蛋白胨、以及15-20g/L瓊脂的平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)稀釋的蜂蜜樣品，從而獲得在上述生長條件下快速生長的酵母株系形成的單個的菌落。
產木糖醇酵母株系的鑒定從這些菌落中，選擇出在上述生長條件下具有優(yōu)良的耐糖性和木糖醇產率的酵母株系，并分析其形態(tài)和生理學特性。通過26S rRNA測序的結果發(fā)現(xiàn)，該酵母株系具有如SEQ ID NO1種所列出的核苷酸序列。該酵母株系被命名為熱帶假絲酵母CJ-FID，并存放在韓國生命科學和生物技術研究所的Gene Bank中(登錄號KCTC 10457BP)。
木糖醇產率的計算對所選擇的酵母株系的木糖醇產率進行計算，將所選的酵母株系接種到裝在250mL燒瓶中的50mL種培養(yǎng)基中，其中含有20g/L木糖、5g/L酵母提取物、5g/L蛋白胨、以及2g/L蔗糖，然后以200rpm的轉速在30℃下振蕩培養(yǎng)12小時。然后，將5％的種培養(yǎng)基接種到裝在500mL燒瓶中的100mL主培養(yǎng)基中，其中含有100g/L的木糖、5g/L的酵母提取物，5g/L蛋白胨、以及10g/L的蔗糖，然后以150rpm的速度在30℃下振蕩培養(yǎng)42小時。以一定的時間間隔從產物培養(yǎng)物中取得培養(yǎng)物樣品，然后測定每個培養(yǎng)物樣品中的木糖醇產物。
木糖和木糖醇分析為了分析木糖和木糖醇，將前一節(jié)中取得的培養(yǎng)物樣品以12000rpm的轉速離心去除細胞。利用具有Kromasil 100-10NH2柱(Denmark)的高效液相色譜(HPLC Shimadzu，Japan)的折射率檢測器(ShimadzuC-R6A，Japan)分析上清液。此時，溶劑為90％的乙腈，流速為2.0mL/min。利用濁度劑測定600nm處的光密度來計算酵母的細胞密度，并將該值與先前制成的光密度與細胞干重之間關系的標準曲線相比較。
熱帶假絲酵母CJ-FID的固定為了制備固定化的細胞，先制備在食品中使用的海藻酸溶液(3％，w/v)。然后將相同濃度的細胞濃縮物加入到其中并且攪拌。在膠珠產生器中將所得到的溶液滴加到100mM的氯化鈣溶液中形成海藻酸鹽凝膠珠。將由此形成的海藻酸鹽凝膠柱在4℃下儲存12小時以便提高海藻酸鹽凝膠珠的強度用于后續(xù)試驗。
通過熱帶假絲酵母CJ-FID得到的發(fā)酵木糖醇將含有木糖、0.1-10g/L的酵母提取物、0.1-10g/L的蛋白胨、以及0.1-50g/L蔗糖的發(fā)酵培養(yǎng)基引入發(fā)酵罐中。然后，將熱帶假絲酵母CJ-FID(KCTC 10457BP)本身或者海藻酸鹽固定化熱帶假絲酵母CJ-FID接種到發(fā)酵培養(yǎng)基上，速度為0.5-2vvm的通風條件下以200-300rpm的轉速以及25-35℃的溫度下培養(yǎng)60至100小時。培養(yǎng)之后，將發(fā)酵培養(yǎng)物離心去除細胞，并從上清液中回收木糖醇。
優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)基中所含的木糖醇的量在50至200g/L，更優(yōu)選在80至150g/L。如果木糖醇的含量少于50g/L，則可能降低木糖醇的產量。另一方面，如果其超出了200g/L，則產量提高可能并不顯著。為了提高產量，可以在發(fā)酵培養(yǎng)基中補充0.1-5g/L的磷酸二氫鉀(KH2PO4)以及0.5-5g/L的硫酸鎂(MgSO4)。
木糖醇發(fā)酵培養(yǎng)物的純化為了將前一節(jié)中獲得的發(fā)酵培養(yǎng)物制備成高純度的木糖醇粉末，可將300g的活性炭填入柱(高度60cm×直徑10cm)中，然后使發(fā)酵培養(yǎng)物通過該柱從而獲得去除異味并脫色的含木糖醇餾分。使獲得的含木糖醇的餾分通過裝填了陰離子樹脂的陰離子柱(高度60cm×直徑10cm)以去除雜質。通過HPLC分析所得到的含木糖醇的餾分。結果，在含木糖醇的餾分中得到純的木糖醇。
在濃縮器中將含木糖醇的餾分濃縮至800g/L以上并在4℃下結晶，接著攪拌并加入乙醇得到優(yōu)質的木糖醇晶體。真空過濾木糖醇晶體以部分去除乙醇和水。最后，通過真空干燥器去除殘余的乙醇和水得到木糖醇粉末。



圖1是表示木糖醇產率與初始木糖濃度關系的曲線圖。
圖2是表示木糖醇產率與初始細胞濃度關系的曲線圖。
圖3是表示木糖醇產率和收率與海藻酸鹽固定化細胞的密度的關系曲線圖。
圖4是表示木糖醇產率和收率與海藻酸鹽凝膠珠質量的關系曲線圖。
圖5是表示木糖醇產率和收率與被海藻酸鹽固定化的酵母細胞的種培養(yǎng)時間的關系曲線圖。
圖6是表示木糖醇產率和收率與設置在優(yōu)化發(fā)酵條件下的海藻酸鹽固定化酵母細胞在2L發(fā)酵罐中的發(fā)酵時間的關系曲線圖。
圖7是表示木糖醇產率和收率與設置在優(yōu)化發(fā)酵條件下的海藻酸鹽固定化酵母細胞在17L發(fā)酵罐中的發(fā)酵時間的關系曲線圖。
圖8是表示通過應用含木糖醇培養(yǎng)物而獲得的含木糖醇餾分的木糖醇濃度變化與活性炭柱的曲線圖。
圖9是表示由圖8的應用獲得的含木糖醇餾分的木糖醇濃度變化與陰離子柱的曲線圖。
圖10是圖9餾分的高效液相色譜圖(HPLC)。
圖11是表示以不同濃度濃縮的圖9餾分的木糖醇結晶產率。
實施本發(fā)明的最佳方式在下文中，將通過實施例更加詳細地說明本發(fā)明。然而，以下的實施例僅作為說明性的目的提供，因此本發(fā)明并不僅限于此或者受其限制。
木糖醇產率與初始木糖濃度的關系如上所述進行了種培養(yǎng)之后，將種培養(yǎng)物接種到10L產木糖醇的主培養(yǎng)基上，其主培養(yǎng)基含有0.5g/L的酵母提取物，5g/L蛋白胨、10-30g/L的蔗糖，以及100-300g/L的木糖、并在15L的發(fā)酵罐(Korea FermentationCo.，Ltd)中培養(yǎng)。發(fā)酵條件如下攪拌速度250rpm，通風流動速度1.0vvm，培養(yǎng)溫度30℃。測定木糖醇產率與初始木糖濃度的關系，結果如圖1中所示。
如圖1所示，木糖醇的最大產量為187g/L。此時，木糖醇的收率為優(yōu)，達93.5％。可以看出，增加蔗糖會提高木糖醇的收率。
木糖醇產率與初始細胞密度的關系如上所述進行了種培養(yǎng)之后，將種培養(yǎng)物接種到10L產木糖醇的主培養(yǎng)基上，其主培養(yǎng)基中含有5g/L的酵母提取物，5g/L蛋白胨、10g/L的蔗糖，以及100g/L的木糖，并在15L的發(fā)酵罐(Korea FermentationCo.，Ltd)中培養(yǎng)。發(fā)酵條件如下攪拌速度250rpm，通風流動速度1.0vvm，培養(yǎng)溫度30℃。測定木糖醇產率與初始細胞密度的關系，結果如圖2中所示。
如圖2所示，木糖醇的最大產量為132g/L。此時，木糖醇的收率為優(yōu)，達98％。然而可以看出，使用高濃度的木糖會減緩木糖醇生產速率。
對常規(guī)產木糖醇株系與熱帶假絲酵母CJ-FID(KCTC10457BP)的糖耐受性測試計算根據(jù)本發(fā)明的熱帶假絲酵母CJ-FID和常規(guī)的產木糖醇株系的糖耐受性，計算值列于以下的表1中。
表1產木糖醇酵母株系的糖耐受性測試結果


(+++生長極好，++生長良好，+少許生長，-不生長)從表1可以看出，與當前已知的酵母株系相比，本發(fā)明的熱帶假絲酵母CJ-FID(KCTC 10457BP)表現(xiàn)出極好的木糖耐受性。這意味著本發(fā)明的熱帶假絲酵母CJ-FID(KCTC 10457BP)可在含高濃度木糖的培養(yǎng)基中大規(guī)模地生產木糖醇。
計算木糖醇產率與海藻酸鹽固定化細胞密度的關系為了計算木糖醇產率與海藻酸鹽凝膠珠固定化的熱帶假絲酵母細胞的關系，在進行如上所述的種培養(yǎng)之后，可通過將海藻酸鹽溶液與不同細胞密度(10到100(OD值))的種培養(yǎng)物混合來制備海藻酸鹽凝膠珠。然后，將該海藻酸鹽凝膠珠接種到10L產木糖醇的主培養(yǎng)基上，其中含有5g/L的酵母提取物，5g/L蛋白胨、10g/L的蔗糖，以及100g/L的木糖，并在15L的發(fā)酵罐(Korea Fermentation Co.，Ltd)中培養(yǎng)。發(fā)酵條件如下攪拌速度250rpm，通風流動速度1.0vvm，培養(yǎng)溫度30℃。測定木糖醇產率與初始細胞密度的關系，結果如圖3中所示。
如圖3所示，當細胞密度在10到20(OD值)時，木糖醇產率大約為0.5g/L.H。在細胞密度大于50(OD值)時，木糖醇的產率大于1.25g/L.H。在細胞密度為100(OD值)時，木糖醇產率達到最大值1.65g/L.H。
計算木糖醇產率與海藻酸鹽凝膠珠質量的關系通過與實施例4中相同的方式制備海藻酸鹽凝膠珠，將其以不同的質量(2.5到50g)接種到裝在2L發(fā)酵罐中的產木糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基上，并在與實施例4相同的發(fā)酵條件下培養(yǎng)。測定木糖醇產率與海藻酸鹽凝膠珠質量的關系，結果如圖4種所示。
如圖4所示，無論海藻酸鹽凝膠珠的質量如何改變，木糖醇的產率都保持恒定。
計算木糖醇產率與種培養(yǎng)時間的關系為了計算木糖醇產率與用于制備海藻酸鹽凝膠珠的種培養(yǎng)細胞的種培養(yǎng)時間的關系，可在種培養(yǎng)基中將酵母株系培養(yǎng)不同的時間(12到60小時)然后在與實施例4相同的發(fā)酵條件下進行發(fā)酵。測定木糖醇產率與種培養(yǎng)時間的關系，結果如圖5中所示。
如圖5所示，無論種培養(yǎng)時間如何，木糖醇的產率都保持恒定。然而，種培養(yǎng)24小時的酵母株系表現(xiàn)出最高的木糖醇產率。
計算木糖醇產率和收率與重復使用固定化細胞的關系制備海藻酸鹽凝膠珠固定化的熱帶假絲酵母CJ-FID，并以與實施例4相同的方式發(fā)酵，除了該海藻酸鹽凝膠珠重復使用之外(一次到五次)。通過與當前已知的高里海藻酸鹽凝膠珠固定化假絲酵母FTI 20037的產率相比較，計算木糖醇產率和收率與海藻酸鹽凝膠珠固定化的熱帶假絲酵母CJ-FID的關系，結果列于表2中。
表2木糖醇產率和收率與重復使用固定化細胞的關系


如表2所示，甚至當固定化細胞使用了五次時，也沒有觀察到木糖醇的產率和收率有所降低。特別是，與高里假絲酵母FTI 20037相比，熱帶假絲酵母CJ-FID細胞表現(xiàn)出高出五倍的木糖醇產率，收率高出45％以上。
木糖醇產率與發(fā)酵時間的關系制備海藻酸鹽凝膠珠固定化的熱帶假絲酵母CJ-FID，并在2L和17L的發(fā)酵罐中以相同于實施例4的方式進行發(fā)酵。通過不同的發(fā)酵時間測定木糖醇產率，結果如圖6和7所示。
如圖6和7所示，木糖醇濃度在發(fā)酵6小時后增加。對于2L發(fā)酵罐中的發(fā)酵(圖6)，木糖醇產率在發(fā)酵24小時時達到最大值。對于17L發(fā)酵罐中的發(fā)酵(圖6)，木糖醇產率在發(fā)酵36小時時達到最大值。
木糖醇發(fā)酵培養(yǎng)物的純化測定通過了活性炭柱和陰離子柱的木糖醇發(fā)酵培養(yǎng)物餾分中的木糖醇濃度。結果如圖8和9中所示。通過高效液相色譜法(HPLC)分析圖9中的餾分，結果如圖10中所示。將圖9的餾分濃縮成不同的濃度，然后測定木糖醇結晶收率與濃度的關系。結果如圖11中所示。
根據(jù)利用活性炭柱的純化結果，如圖8中所示，餾分4表現(xiàn)出最高的木糖醇濃度。根據(jù)利用活性炭柱和陰離子柱的純化結果，如圖9中所示，餾分3至5表現(xiàn)出最高的木糖醇濃度。從圖10的色譜圖可以看出，通過了活性炭柱和陰離子柱的餾分含有高度純化的木糖醇。將純化的木糖醇溶液結晶成不同的濃度。隨著木糖醇溶液濃度的增加，木糖醇結晶產量成比例地增加。
按照木糖醇發(fā)酵和純化得到的木糖醇濃度和收率在發(fā)酵和純化之后，測定的木糖醇濃度和收率，歸納在下表3中。
表3根據(jù)木糖醇發(fā)酵培養(yǎng)物的純化過程得到的純化收率


如表3中所示，發(fā)酵和純化之后，木糖醇的最終收率高達77.4％，并且在各純化過程中只觀察到極少的木糖醇損耗量。
工業(yè)實用性通過上述說明，顯然本發(fā)明的新型熱帶假絲酵母CJ-FID(KCTC10457BP)以及用其制造木糖醇的方法在優(yōu)化的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基的組成下，可以以高收率和產率生產高純度的木糖醇。
盡管本發(fā)明是根據(jù)示例性實施例及其實驗性實例來進行詳細的表示和說明的，但本領域普通技術人員應當明白，只要不偏離由以下權利要求
所限定的本發(fā)明的實質和范圍，其中可以做出各種形式和細節(jié)上的改變。
序列表FP06KR076SEQUENCE LISTING<110>CJ株式會社(CJ Corp.)<120>新型熱帶假絲酵母CJ-FID(KCTC 10457BP)及用其制造木糖醇的方法<130>FP06KR079<140>PCT/KR2004/001172<141>2004-05-18<150>KR10-2003-0051593<151>2003-07-25<150>KR10-2004-0033733<151>2004-05-13<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>576<212>DNA<213>熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)<400>1ataccaacag ggattgcctt agtagcggcg agtgaagcgg caaaagctca aatttgaaat 60ctggctcttt cagagtccga gttgtaattt gaagaaggta tctttgggtc tggctcttgt 120ctatgtttct tggaacagaa cgtcacagag ggtgagaatc ccgtgcgatg agatgatcca 180ggcctatgta aagttccttc gaagagtcga gttgtttggg aatgcagctc taagtgggtg 240gtaaattcca tctaaagcta aatattggcg agagaccgat agcgaacaag tacagtgatg 300gaaagatgaa aagaactttg aaaagagagt gaaaaagtac gtgaaattgt tgaaagggaa 360gggcttgaga tcagacttgg tattttgtat gttacttctt cgggggtggc ctctacagtt 420tatcgggcca gcatcagttt gggcggtagg agaattgcgt tggaatgtgg cacggcttcg 480gttgtgtgtt atagccttcg tcgatactgc cagcctagac tgaggactgc ggtttatacc 540taggatgttg gcataatgat cttaagtcgc ccgtct 576
權利要求
1.一種產木糖醇的熱帶假絲酵母CJ-FID(KCTC 10457BP)。
2.一種海藻酸鹽凝膠珠，其制備是通過將熱帶假絲酵母加入到海藻酸的水溶液中，攪拌得到均勻溶液，并將該均勻溶液滴加到鈣鹽中而得到。
3.一種制備木糖醇的方法，其特征在于包括制備含木糖和蔗糖的產木糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基；將權利要求
2的海藻酸鹽凝膠珠接種到所述發(fā)酵培養(yǎng)基上；以及在發(fā)酵罐中使所述發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵。
4.根據(jù)權利要求
3的一種制備木糖醇的方法，其特征在于進一步包括用活性炭柱純化通過發(fā)酵過程產生的含木糖醇的發(fā)酵培養(yǎng)物；用陰離子柱純化所述活性炭柱純化過程產生的木糖醇溶液；以及由所述陰離子柱純化制得的木糖醇溶液來制備木糖醇粉末。
專利摘要
提供了一種從蜂蜜中得到的新型熱帶假絲酵母CJ－FID(KCTC10457BP)以及用其制備木糖醇的方法。該方法包括培養(yǎng)該熱帶假絲酵母CJ－FID本身或者培養(yǎng)在含有高濃度木糖和蔗糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中的海藻酸鹽固定化熱帶假絲酵母CJ－FID來獲得含木糖醇的培養(yǎng)物，之后用活性炭柱和陰離子柱純化，最終獲得粉末狀的木糖醇。因此，可以以高收率和產率制備高純度的木糖醇。
文檔編號C12P7/02GKCN1829790SQ200480021548
公開日2006年9月6日 申請日期2004年5月18日
發(fā)明者金政勛, 孫永録, 李苑和, 樸承源, 樸康浚, 李起昌, 林栽玨 申請人:Cj株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan