本發(fā)明涉及一種非洲豬瘟病毒p72蛋白的單克隆抗體、免疫檢測試紙及制備方法和應(yīng)用，屬于免疫檢測。

背景技術(shù)：

1、非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒(african?swine?fevervirus,asfv)引起的一種高度傳染性豬病毒性疾病，以高熱、皮膚出血為特征，該毒性感染家豬的死亡率接近100％。世界動物衛(wèi)生組織(oie)將該病列為法定通報動物疫病，被我國列為重點防范的疫病之一。

2、p72蛋白是asfv病毒二十面體病毒衣殼的主要成分，該蛋白由b646l基因編碼。在病毒粒子形成早期，新合成的p72蛋白分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和可溶性細(xì)胞質(zhì)庫結(jié)合膜之間，asfv內(nèi)核以及外部衣殼會在er膜的不同區(qū)域組裝。在asfv病毒感染后期，b646l基因開始表達(dá)，病毒晚期啟動子調(diào)節(jié)并誘導(dǎo)晚期蛋白p72的合成。p72蛋白主要參與asfv衣殼的組裝，并在病毒吸附和入侵易感細(xì)胞時發(fā)揮重要作用，它能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。b602l蛋白有輔助產(chǎn)生抗胰蛋白酶的功能，在hek293f細(xì)胞中單獨表達(dá)p72蛋白時，出現(xiàn)可溶性聚集現(xiàn)象，無法形成正確的三維結(jié)構(gòu)，只有當(dāng)p72蛋白和b602l蛋白共同在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)時，p72蛋白才能夠正確折疊和組裝，從而行使正常生物學(xué)功能。

3、與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)等常規(guī)技術(shù)相比，量子點標(biāo)記免疫層析技術(shù)具有操作簡單、檢測靈敏度高、特異性好、受外界因素影響小等優(yōu)點，近年來得到快速發(fā)展?，F(xiàn)有技術(shù)中基于非洲豬瘟病毒蛋白建立的量子點標(biāo)記的抗體檢測試紙條未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決非洲豬瘟病毒檢測中存在的問題，本發(fā)明提供一種檢測非洲豬瘟病毒p72蛋白的單克隆抗體。

2、本發(fā)明還提供一種用于檢測非洲豬瘟病毒抗體的熒光免疫層析試紙，該試紙具有特異性強(qiáng)、敏感性好、檢測結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)勢，適用于臨床樣品的快速檢測。

3、為解決以上問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

4、1.一種非洲豬瘟病毒p72蛋白的單克隆抗體，包括重鏈可變區(qū)氨基酸序列和輕可變區(qū)氨基酸序列。

5、所述重鏈可變區(qū)氨基酸序列包括cdr-h1：llfld；所述輕可變區(qū)氨基酸序列包括cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，對應(yīng)的氨基酸序列分別為：ltqspaslavslgqr、ysymhwn和tdft。

6、所述單克隆抗體還包括重鏈可變框架區(qū)序列fr-h1、fr-h2、fr-h3和fr-h4；以及輕鏈可變框架區(qū)fr-l1、fr-l2、fr-l3，序列分別為：

7、fr-h1：msntdwkegqrktihiyatgnnsshhavlg；

8、fr-h2：imawvwtllflmaa；

9、fr-h3：aqsaqaqiqlvqsgpelkkpgetvkisckasg；

10、fr-h4：ytftnlgmnwvkqapgkglkwmgwintysgn；

11、fr-l1?wefqetdtlllwvlllwvpgstg；

12、fr-l2：atisyrasksvstsg；

13、fr-l3：qqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsg。

14、2.所述的單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：

15、(1)p72重組蛋白的制備

16、按照cho表達(dá)系統(tǒng)密碼子偏愛性，對非洲豬瘟病毒p72蛋白編碼基因b602l的序列優(yōu)化合成；以合成的基因為模板，經(jīng)pcr擴(kuò)增獲得目的片段，將目的片段克隆至表達(dá)載體pcgs3，得到重組質(zhì)粒pcgs3-p72；

17、將重組質(zhì)粒pcgs3-p72轉(zhuǎn)入至大腸桿菌dh5α細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒與b602l基因分別雙酶切后使用t4?dna連接，得到重組質(zhì)粒pcgs3-p72-b602l；

18、將重組質(zhì)粒pcgs3-p72-b602l轉(zhuǎn)入cho細(xì)胞，收集細(xì)胞并裂解，使用anti-flag親和層析柱除雜，洗脫純化，經(jīng)超濾離心濃縮，得到非洲豬瘟病毒p72重組蛋白，保存?zhèn)溆茫?/p>

19、(2)單克隆抗體的制備

20、以p72重組蛋白作為免疫原免疫小鼠，首次免疫以弗氏完全佐劑乳化抗原，以50μg/只的劑量皮下多點注射；加強(qiáng)免疫間隔2-3周，以弗氏不完全佐劑乳化抗原進(jìn)行注射；最后一次加強(qiáng)免疫1-2周后，以p72重組蛋白包被酶聯(lián)免疫吸附板，用間接elisa方法測定免疫血清效價，當(dāng)效價達(dá)到預(yù)期值以上時，采集小鼠脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)多輪亞克隆和間接elisa篩選，得到陽性雜交瘤細(xì)胞，通過體內(nèi)誘生腹水法得到小鼠腹水，用蛋白a親和層析柱進(jìn)行純化，得到抗非洲豬瘟病毒p72蛋白的單克隆抗體，保存?zhèn)溆谩?/p>

21、3.利用所述的非洲豬瘟病毒p72蛋白抗體制備的熒光免疫層析檢測試紙條，包括支撐底板，支撐底板上依次固定有樣品墊、結(jié)合墊、層析檢測膜、吸水墊；結(jié)合墊由玻璃纖維棉包被，結(jié)合墊表面固定有量子點標(biāo)記的非洲豬瘟病毒的p72重組蛋白；層析檢測膜采用硝酸纖維素膜，層析檢測膜上設(shè)有檢測線和質(zhì)控線，檢測線上涂布有葡萄球菌a蛋白，質(zhì)控線上固定有抗非洲豬瘟病毒p72蛋白的單克隆抗體。

22、所述的熒光免疫層析檢測試紙條，是用量子點作為信號標(biāo)記物將非洲豬瘟病毒抗原和抗體的免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)化為被識別的熒光信號；量子點與p72重組蛋白通過1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺連接。

23、所述的熒光免疫層析檢測試紙條的檢測結(jié)果判斷方法：若試紙條在紫外燈照射下出現(xiàn)兩條熒光條帶，檢測結(jié)果為陽性，說明待測樣本中含有非洲豬瘟病毒抗體；若只有質(zhì)控線c位置出現(xiàn)熒光條帶，檢測結(jié)果為陰性，說明待測樣本中不含非洲豬瘟病毒抗體；若檢測線t、質(zhì)控線c位置都不出現(xiàn)熒光條帶，說明檢測結(jié)果無效；并且熒光條帶顏色的深淺與待測樣本中的非洲豬瘟病毒抗體含量成正比。

24、4.所述的單克隆抗體在檢測非洲豬瘟病毒p72蛋白中的應(yīng)用；單克隆抗體制備的檢測非洲豬瘟病毒p72蛋白的試劑或試劑盒；所述熒光免疫層析檢測試紙條在檢測非洲豬瘟病毒中的應(yīng)用。

25、本發(fā)明的有益技術(shù)效果：

26、1、本發(fā)明采用asfvp72基因和b602l基因獲取正確折疊的p72重組蛋白，使用葡萄球菌a蛋白進(jìn)行量子點標(biāo)記，以量子點作為標(biāo)記示蹤物，制備量子點標(biāo)記的免疫層析試紙，利用抗原抗體反應(yīng)和側(cè)向?qū)游龇椒▽悠愤M(jìn)行檢測，標(biāo)記后的復(fù)合物和抗體結(jié)合穩(wěn)定，顏色鮮明，在紫外燈下肉眼可見，使用方便。

27、2、本發(fā)明選用asfv-p72重組蛋白為檢測靶標(biāo)，與原核表達(dá)系統(tǒng)獲取的蛋白不同，利用重組蛋白與侵染哺乳動物的病毒蛋白具有相似抗原，免疫原性好、生物活性高，在免疫和量子點標(biāo)記層面具有顯著優(yōu)勢。

28、3、本發(fā)明利用asfv-p72重組蛋白作為抗原制備的非洲豬瘟病毒抗體熒光免疫層析試紙，能夠準(zhǔn)確、快速地檢測待測血清中是否存在非洲豬瘟病毒抗體，檢測時間短、特異性強(qiáng)、靈敏度高，大大降低漏檢率，提高檢測的準(zhǔn)確性，可用于asfv感染診斷、檢疫檢驗及流行病學(xué)調(diào)查研究，具有很好推廣應(yīng)用價值。

29、4、本發(fā)明利用asfv?p72重組蛋白作為抗原制備的單克隆抗體純度高、特異性強(qiáng)，能夠特異性識別p72蛋白，從而提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。