本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與免疫檢測，特別是v-atp酶a亞基蛋白及其編碼基因在cry毒素檢測中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、蘇云金芽孢桿菌(bacillus?thuringiensis，bt)屬革蘭氏陽性細(xì)菌，其在生長代謝階段產(chǎn)生具有特異性殺蟲活性的cry、cyt和vip等毒素蛋白廣泛用于農(nóng)業(yè)害蟲防治。btcry毒素在昆蟲中腸上的受體蛋白可結(jié)合相對應(yīng)的毒素，從而通過復(fù)雜的作用過程導(dǎo)致昆蟲死亡，并且以此理論為基礎(chǔ)發(fā)展cry毒素檢測方法應(yīng)是一個(gè)行之有效的途徑。bt?cry毒素的作用機(jī)制尚未明確，存在2種作用模式，包括“穿孔模型”和“信號傳導(dǎo)模型”。這2種作用模式都認(rèn)同cry原毒素在昆蟲堿性中腸環(huán)境中被激活，接著活化的毒素與位于中腸細(xì)胞刷狀緣膜囊泡(brush?border?membrane?vesicles，bbmv)上不同的受體蛋白結(jié)合是關(guān)鍵步驟。但由于bt?cry家族眾多，且不同昆蟲中腸細(xì)胞上受體種類也不盡相同，cry毒素的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。cry毒素已被鑒定的受體蛋白主要包括鈣粘蛋白(cadherin，cad)、氨肽酶、堿性磷酸酯酶(alkaline?phosphatase，alp)、糖脂類、鈉溶質(zhì)同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、atp結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(atp?binding?cassette(abc)transporter?proteins)家族的abcc2、abcc3、abcb1、abca2和液泡型-atp酶(vacuolar?h+-atp?synthase，v-atpase)等。因此，關(guān)于昆蟲中腸bt?cry毒素受體蛋白的研究對深入理解bt毒素的作用機(jī)制和以此為基礎(chǔ)指導(dǎo)bt毒素檢測體系的建立具有重要意義。

2、昆蟲中腸受體蛋白之一的v-atp酶是bt?cry毒素的作用靶標(biāo)。v-atp酶由保守的外圍胞質(zhì)催化結(jié)構(gòu)域(v1)和可變的跨膜結(jié)構(gòu)域(v0)組成，其中v1又由a到h的8個(gè)亞基組成，v0則由a、c、c'、c″、d和e這6個(gè)亞基組成。v-atp酶通過利用水解atp時(shí)所釋放的能量，負(fù)責(zé)h+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，維持胞內(nèi)特定環(huán)境ph的平衡，是一種依賴atp的質(zhì)子泵。自煙芽夜蛾(heliothisvirescens)中腸bbmv上v-atp酶a亞基與cry1ac結(jié)合被報(bào)道后(krishnamoorthy,m.；jurat-fuentes,j.l.；mcnall,r.j.；andacht,t.；adang,m.j.identification?of?novel?cry1acbinding?proteins?in?midgut?membranes?from?heliothis?virescens?using?proteomicanalyses.insect?biochem.mol.biol.,2007,37:189-201.)采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定出甜菜夜蛾(spodoptera?exigua)、棉鈴蟲(helicoverpaarmigera)、埃及伊蚊(aedesaegypti)、亞洲玉米螟(ostrinia?furnacalis)、粉紋夜蛾(trichoplusiani)和小菜蛾(plutellaxylostella)中腸的v-atp酶是cry毒素的結(jié)合蛋白(xie,c.；xiong,l.；ye,m.；shen,l.；li,j.；zhang,z.；you,m.；you,s.genome-wide?analysis?of?v-atpase?genes?inplutella?xylostella(l.)and?the?potential?role?of?pxvha-g1?in?resistance?tobacillus?thuringiensis?cry1ac?toxin.int.j.biol.macromol.,2022,194:74-83.)。另有研究發(fā)現(xiàn)二化螟v-atp酶a亞基是cry1c和cry2aa功能性受體(qiu,l.；sun,y.；jiang,z.；yang,p.；liu,h.；zhou,h.；wang,x.；zhang,w.；lin,y.；ma,w.the?midgut?v-atpasesubunit?agene?is?associated?with?toxicity?to?crystal?2aa?and?crystal?1ca-expressing?transgenic?rice?in?chilo?suppressalis.insect?mol.biol.,2019,28:520-527.)，棉鈴蟲v-atp酶e亞基是cry2ab的受體(zhao,y.；li,p.；yao,x.；li,y.；tian,y.；xie,g.；deng,z.；xu,s.；wei,j.；li,x.；an,s.v-atpase?e?mediates?cry2ab?bindingand?toxicity?in?helicoverpa?armigera.pestic.biochem.physiol.,2024,198.)。昆蟲v-atp酶的亞基可與cry1和2類毒素產(chǎn)生結(jié)合作用，這為利用此昆蟲v-atp酶的亞基蛋白檢測cry毒素奠定了理論基礎(chǔ)。

3、昆蟲v-atp酶a亞基是理解cry毒素殺蟲作用和結(jié)合機(jī)制中一個(gè)重要的受體結(jié)合蛋白，對研究cry毒素與v-atp酶a亞基作用機(jī)制及設(shè)計(jì)檢測cry毒素的結(jié)合蛋白具有重要意義。目前關(guān)于稻縱卷葉螟的v-atp酶a亞基基因，特別是該基因編碼的v-atp酶a亞基蛋白用于檢測cry毒素尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對上述問題，本技術(shù)首次從稻縱卷葉螟幼蟲克隆得到一個(gè)v-atp酶a亞基基因cdna的全長序列，進(jìn)而確定了它的核苷酸序列和氨基酸序列，并在此基礎(chǔ)上對稻縱卷葉螟v-atp酶a亞基(cmv-atpase?sub?a)進(jìn)行了原核表達(dá),獲得cmv-atpase?sub?a蛋白。該蛋白可以作為通用捕獲蛋白，結(jié)合抗cry1ac或cry2aa多克隆抗體作為檢測抗體，建立了一種結(jié)合蛋白-抗體夾心elisa的檢測方法，能同時(shí)檢測cry1ab、cry1ac、cry2aa、cry2ab這4種cry毒素，并進(jìn)一步開發(fā)了其在農(nóng)業(yè)檢測領(lǐng)域的應(yīng)用。

2、具體來說，本技術(shù)是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

3、首先，本技術(shù)提供了一種稻縱卷葉螟v-atp酶a亞基蛋白，其氨基酸序列如seq?idno.11所示。

4、其次，本技術(shù)提供了上述稻縱卷葉螟v-atp酶a亞基蛋白的編碼基因，其核苷酸序列如seq?id?no.10所示

5、本技術(shù)提供了上述稻縱卷葉螟v-atp酶a亞基蛋白(cmv-atpase?sub?a蛋白)作為通用捕獲蛋白，以抗cry1ac多克隆抗體或cry2aa多克隆抗體作為檢測抗體，在結(jié)合蛋白-抗體夾心elisa法檢測cry毒素含量中的應(yīng)用；上述cry毒素包括cry1ab、cry1ac、cry2aa、cry2ab中的至少一種，在檢測cry1ab或cry1ac毒素時(shí)，使用抗cry1ac多克隆抗體作為檢測抗體；在檢測cry2aa或cry2ab毒素時(shí)，使用抗cry2aa多克隆抗體作為檢測抗體。

6、進(jìn)一步而言，上述elisa法檢測指將氨基酸序列如seq?id?no.11所示的cmv-atpase?sub?a蛋白為捕獲蛋白，以抗cry1ac多克隆抗體或抗cry2aa多克隆抗體為檢測抗體，建立的結(jié)合蛋白-抗體夾心elisa檢測。該夾心elisa法測定的cry1ab的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性工作范圍為17.41—376.31ng/ml，檢測限lod為17.41ng/ml。cry1ac的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性工作范圍為43.16—804.95ng/ml，檢測限lod為43.16ng/ml。cry2aa的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性工作范圍為39.70—733.03ng/ml，檢測限lod為39.70ng/ml。cry2ab的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性工作范圍為31.85-1022.20ng/ml，檢測限lod為31.85ng/ml。

7、第三，本技術(shù)提供了一種針對cry毒素的夾心elisa檢測法，其具體步驟如下：

8、1)將已知cry毒素種類的待測樣品(農(nóng)作物新鮮葉片)剪成碎片，浸于液氮中，用研磨杵研磨成粉，獲得樣品粉末；取1支2ml離心管，加入0.1g樣品粉末和1ml植物樣品提取液(含有終濃度分別為0.1％bsa和0.05％吐溫-20的pbs溶液，ph?7.4)溶解；將離心管置于旋轉(zhuǎn)儀上，4℃旋轉(zhuǎn)2h后，再于4℃，10000g離心30min，所獲得的上清液即為植物樣品待測液，同時(shí)設(shè)立不加入樣品的對照組，獲得對照組待測液，備用；

9、上述農(nóng)作物優(yōu)選水稻或玉米；

10、上述cry毒素種類為cry1ab、cry1ac、cry2aa或cry2ab毒素中的任一種；

11、2)使用cbs溶液將氨基酸序列如seq?id?no.11所示的cmv-atpase?sub?a蛋白稀釋至濃度為10ppm，100μl/孔包被96孔酶標(biāo)板，4℃靜置過夜；

12、3)次日，300μl/孔pbst清洗酶標(biāo)板4次，再300μl/孔加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5％的mpbs，37℃靜置封閉2h；然后pbst洗酶標(biāo)板4次，加入植物樣品待測液，對照組待測液加入pbs，100μl/孔，每組3次重復(fù)，100μl/孔加入酶標(biāo)板，37℃孵育1h，pbst洗4次；

13、4)100μl/孔加入抗cry1ac多克隆抗體或抗cry2aa多克隆抗體(體積比1：2000，pbs稀釋)，37℃孵育1h；pbst洗4次，100μl/孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔igg(1：7500體積比，pbs稀釋)，37℃孵育1h；pbst洗板4次，100μl/孔加入顯色液，37℃避光顯色15min，50μl/孔加入終止液，酶標(biāo)儀測od450值并帶入已建立的四參數(shù)擬合方程：

14、在檢測cry1ab或cry1ac毒素時(shí)，使用抗cry1ac多克隆抗體作為檢測抗體；在檢測cry2aa或cry2ab毒素時(shí)，使用抗cry2aa多克隆抗體作為檢測抗體；

15、所述四參數(shù)擬合方程為：

16、cry1ab：y＝3.99/[1+x/0.10(-1.45)]+0.12；

17、cry1ac：y＝4.15/[1+x/0.28(-1.44)]+0.13；

18、cry2aa：y＝3.95/[1+x/0.24(-1.55)]+0.16；

19、cry2ab：y＝3.27/[1+x/0.36(-1.43)]+0.16；

20、5)將待測樣品的od450值(對應(yīng)y)帶入對應(yīng)方程計(jì)算，即可分別獲得四種毒素的殘留量(對應(yīng)x值)。

21、在已知樣品可能含有的毒素種類前提下，本技術(shù)提供的cmv-atpase?sub?a蛋白可以作為elisa檢測的通用捕獲蛋白，檢測cry1ab、cry1ac、cry2aa、cry2ab四種毒素的含量，準(zhǔn)確率高。在本技術(shù)的一個(gè)實(shí)施例中，利用該檢測方法將不同濃度的cry1ab、cry1ac、cry2aa和cry2ab毒素分別添加到水稻葉片和玉米葉片樣品中，結(jié)果表明平均回收率在83.08％至118.58％之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd)為1.41％至6.37％之間，說明在水稻和玉米葉片中4種cry毒素的精準(zhǔn)定量檢測。

22、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本技術(shù)首次利用稻縱卷葉螟v-atp酶a亞基蛋白，構(gòu)建了cmv-atpase?sub?a重組蛋白并克隆至pet26b(+)載體中，在大腸桿菌bl21(de3)中表達(dá)并純化，另制備并純化了抗cry1ac或cry2aa多克隆抗體。在此基礎(chǔ)上，首次使用稻縱卷葉螟v-atp酶a亞基作為elisa檢測的通用捕獲蛋白，以抗cry1ac多克隆抗體(pabs)或抗cry2aa多克隆抗體作為檢測抗體，建立結(jié)合蛋白-抗體夾心elisa的檢測方法。該通用捕獲蛋白可同時(shí)檢測樣品中是否含有這四種cry毒素(目前商品化的試劑盒至少需要測試2次才能獲得檢測cry毒素種類)；此外，在已知樣品可能含有的cry毒素種類的情況下，該通用捕獲蛋白/檢測方法可以對cry1ab、cry1ac、cry2aa、cry2ab這4種cry毒素進(jìn)行精確的定量檢測，以克服單克隆抗體產(chǎn)量低、不穩(wěn)定、成本高、不具廣譜性等問題,并進(jìn)一步開發(fā)了該蛋白在農(nóng)產(chǎn)品檢測領(lǐng)域的應(yīng)用。