本發(fā)明屬于基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種cspnrc1基因及其編碼蛋白在調(diào)控黃瓜抗枯萎病中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、由于設(shè)施栽培黃瓜面積的不斷擴大及由此產(chǎn)生的土壤連作障礙現(xiàn)象日益顯現(xiàn)，枯萎病已成為連作障礙最突出的表現(xiàn)，嚴(yán)重制約了黃瓜優(yōu)質(zhì)、安全、高效栽培，嚴(yán)重時導(dǎo)致黃瓜絕產(chǎn)絕收(delgado-baquerizo?et?al.,2020；naguib?et?al.,2021；lian?et?al.,2023)。

2、黃瓜枯萎病是一種毀滅性土傳真菌病害，由尖孢鐮刀菌黃瓜?；?fusariumoxysporum?f.sp.cucumerinum，foc)引起，此病傳播速度快，可適應(yīng)各種環(huán)境，在23～29℃下生長速度最快，在酸性土壤或受線蟲危害地區(qū)生長的速度更快(cohen?et?al.,2015；wang?et?al.,2023)。病原菌能產(chǎn)生厚垣孢子，可在土壤中存活多年(sun?et?al.,2015；uddin?et?al.,2023)，黃瓜的重茬連作致使土壤中的病原菌基數(shù)不斷增加，病害的發(fā)生逐年加重。該病可發(fā)生于黃瓜生長發(fā)育的各個階段，生長中后期由于生長勢下降，發(fā)病率最高，亦被稱為黃瓜的“癌癥”(shen?et?al.,2017；zhang?et?al.,2023)。因此，黃瓜枯萎病的防治已成為亟待解決的難題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明旨在提供一種調(diào)控黃瓜抗枯萎病基因cspnrc1，利用該基因可以有效調(diào)控黃瓜對于枯萎病的抗性，顯著降低枯萎病發(fā)病率。

2、技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的提供一種調(diào)控黃瓜抗枯萎病基因cspnrc1，所述基因cspnrc1的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

3、進(jìn)一步地，用于擴增所述基因cspnrc1的引物對為：

4、cspnrc1-f：5’-cttacgccaccaaggatt-3’，

5、cspnrc1-r：5’-acggcaagggcaccgaact-3’。

6、本發(fā)明所述調(diào)控黃瓜抗枯萎病基因cspnrc1編碼蛋白的氨基酸序列如seq?idno.2所示。

7、本發(fā)明所述調(diào)控黃瓜抗枯萎病基因cspnrc1的基因敲除載體pcambia1301-cspnrc1。

8、進(jìn)一步地，所述敲除載體pcambia1301-cspnrc1構(gòu)建方法為：以cspnrc1基因的核苷酸序列為模板，設(shè)計cspnrc1的靶點引物擴增，將得到產(chǎn)物與經(jīng)過酶切的pcambi?a3101改造載體進(jìn)行重組反應(yīng)，所述pcambia3101改造載體序列如seq?id?no.3所示，通過轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，最終得到基因敲除載體pcambia1301-cspnrc1。

9、本發(fā)明所述調(diào)控黃瓜抗枯萎病基因cspnrc1的過表達(dá)載體pcambia1391-cspnrc1。

10、進(jìn)一步地，所述過表達(dá)載體pcambia1391-cspnrc1的構(gòu)建方法是將基因cspnrc1進(jìn)行擴增，酶切連接到pcambia1391載體后，通過大腸桿菌轉(zhuǎn)化和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，最終得到過表達(dá)載體pcambia1391-cspnrc1。

11、本發(fā)明所述的基因cspnrc1或者所述的蛋白或者所述的基因敲除載體或者所述的過表達(dá)載體在調(diào)控黃瓜抗枯萎病中的應(yīng)用。

12、進(jìn)一步地，在黃瓜中通過編輯黃瓜cspnrc1基因，使得其抗枯萎病能力上升，感病性降低；通過過表達(dá)黃瓜cspnrc1基因，使得其抗枯萎病能力下降，感病性上升。

13、本發(fā)明所述的調(diào)控黃瓜抗枯萎病基因cspnrc1或者所述的蛋白或者所述的基因敲除載體或者所述的過表達(dá)載體在培育抗枯萎病黃瓜種質(zhì)中的應(yīng)用。

14、黃瓜cspnrc1基因用于構(gòu)建cspnrc1黃瓜基因編輯轉(zhuǎn)基因材料的應(yīng)用，該材料能使富含脯氨酸的核受體共激活因子喪失功能，從而提高對枯萎病的抗性。

15、通過本發(fā)明提供黃瓜cspnrc1基因序列及其編碼的蛋白序列，首次構(gòu)建黃瓜cspnrc1基因編輯轉(zhuǎn)基因材料，并進(jìn)行功能研究，發(fā)現(xiàn)該基因在抗枯萎病的過程中起調(diào)控作用。

16、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點：

17、本發(fā)明中首次提出了cspnrc1基因及其編碼蛋白在調(diào)控黃瓜抗枯萎病中的應(yīng)用，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建cspnrc1基因編輯和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因材料，對cspnrc1基因功能進(jìn)行探究，通過試驗證明，cspnrc1在黃瓜基因編輯轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)顯著低于wt，抗性卻顯著優(yōu)于wt；而過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系中呈現(xiàn)相反的結(jié)果，說明該基因在黃瓜抗枯萎病過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控的作用。該基因在黃瓜中新功能的發(fā)現(xiàn)為創(chuàng)新黃瓜枯萎病抗性種質(zhì)材料提供了新的思路和理論依據(jù)，具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種調(diào)控黃瓜抗枯萎病基因cspnrc1，其特征在于，所述基因cspnrc1的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述調(diào)控黃瓜抗枯萎病基因cspnrc1，其特征在于，用于擴增所述基因cspnrc1的引物對為：

3.一種權(quán)利要求1所述調(diào)控黃瓜抗枯萎病基因cspnrc1編碼的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

4.一種基于權(quán)利要求1所述調(diào)控黃瓜抗枯萎病基因cspnrc1的基因敲除載體pcambia1301-cspnrc1。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因敲除載體pcambia1301-cspnrc1，其特征在于，所述敲除載體pcambia1301-cspnrc1構(gòu)建方法為：以cspnrc1基因的核苷酸序列為模板，設(shè)計cspnrc1的靶點引物擴增，將得到產(chǎn)物與經(jīng)過酶切的pcambia3101改造載體進(jìn)行重組反應(yīng)，所述pcambia3101改造載體序列如seq?id?no.3所示，通過轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，最終得到基因敲除載體pcambia1301-cspnrc1。

6.一種含有權(quán)利要求1所述調(diào)控黃瓜抗枯萎病基因cspnrc1的過表達(dá)載體pcambia1391-cspnrc1。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的過表達(dá)載體pcambia1391-cspnrc1，其特征在于，所述過表達(dá)載體pcambia1391-cspnrc1的構(gòu)建方法是將基因cspnrc1進(jìn)行擴增，酶切連接到pcambia1391載體后，通過轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，最終得到過表達(dá)載體pcambia1391-cspnrc1。

8.一種權(quán)利要求1所述的基因cspnrc1或者權(quán)利要求3所述的蛋白或者權(quán)利要求4所述的基因敲除載體或者權(quán)利要求6所述的過表達(dá)載體在調(diào)控黃瓜枯萎病抗性中的應(yīng)用。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，在黃瓜中通過編輯黃瓜cspnrc1基因，使得其抗枯萎病能力上升，感病性降低；通過過表達(dá)黃瓜cspnrc1基因，使得其抗枯萎病能力下降，感病性上升。

10.一種權(quán)利要求1所述的調(diào)控黃瓜抗枯萎病基因cspnrc1或者權(quán)利要求3所述的蛋白或者權(quán)利要求4所述的基因敲除載體或者權(quán)利要求6所述的過表達(dá)載體在培育抗枯萎病黃瓜種質(zhì)中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種CsPNRC1基因及其編碼蛋白在調(diào)控黃瓜抗枯萎病中的應(yīng)用，所述基因CsPNRC1的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其編碼的蛋白序列如SEQ?ID?NO.2所示；本發(fā)明首次構(gòu)建了黃瓜CsPNRC1基因編輯和過表達(dá)的種質(zhì)材料，并進(jìn)行功能研究發(fā)現(xiàn)黃瓜基因CsPNRC1的低表達(dá)能提高黃瓜枯萎病的抗性，過表達(dá)后顯著提高黃瓜枯萎病的發(fā)病率，因此，本發(fā)明的基因在枯萎病抗性過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用。

技術(shù)研發(fā)人員：董京萍,徐君,陳學(xué)好,李巖松
受保護(hù)的技術(shù)使用者：揚州大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19