本發(fā)明涉及生物，尤其涉及特異性反轉(zhuǎn)系統(tǒng)、其構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、位點(diǎn)特異性反轉(zhuǎn)系統(tǒng)是一種能夠介導(dǎo)兩個(gè)特定反轉(zhuǎn)位點(diǎn)之間的dna序列發(fā)生方向性反轉(zhuǎn)的重組系統(tǒng)，這一反轉(zhuǎn)過程由特異性反轉(zhuǎn)酶介導(dǎo)。通常情況下位點(diǎn)特異性反轉(zhuǎn)系統(tǒng)可以形成不同程度的復(fù)雜性。最簡單的系統(tǒng)包含一對(duì)反轉(zhuǎn)位點(diǎn)和反轉(zhuǎn)酶，可以產(chǎn)生兩種遺傳表型，如hin（h?inversion）系統(tǒng)、gin（g?inversion）系統(tǒng)和cin（c?inversion）系統(tǒng)。而更復(fù)雜的系統(tǒng)涉及多對(duì)反轉(zhuǎn)位點(diǎn)，可以產(chǎn)生許多不同的基因型，如min系統(tǒng)和shufflons系統(tǒng)。然而到目前為止，幾乎所有已知的位點(diǎn)特異性dna反轉(zhuǎn)系統(tǒng)都存在于細(xì)菌中，還沒有在真核生物中鑒定出這樣的反轉(zhuǎn)系統(tǒng)。

2、相似的研究工作是釀酒酵母中單對(duì)位點(diǎn)特異性反轉(zhuǎn)系統(tǒng)的構(gòu)建。han等人對(duì)來源于細(xì)菌的rci重組酶在釀酒酵母中進(jìn)行定向進(jìn)化，篩選出了反轉(zhuǎn)效率和刪除效率的比值極高的酶rci8，在酵母中構(gòu)建了單對(duì)位點(diǎn)反轉(zhuǎn)系統(tǒng)?rci8/sfxa101。該系統(tǒng)包含一對(duì)sfxa101位點(diǎn)和重組酶rci8，在實(shí)際應(yīng)用通過設(shè)置方向相反的sfxa101位點(diǎn)序列則可以只介導(dǎo)反轉(zhuǎn)的發(fā)生。然而，基因組編輯往往涉及復(fù)雜的重排，單對(duì)反轉(zhuǎn)位點(diǎn)無法在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生大量的重排事件，對(duì)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變異的多樣性具有局限性，且，在酵母基因組合成計(jì)劃（sc2.0項(xiàng)目）中，scramble系統(tǒng)在介導(dǎo)基因組尺度的重排時(shí)會(huì)不可避免的產(chǎn)生位點(diǎn)間dna的大量刪除，甚至導(dǎo)致菌株致死。因此，開發(fā)穩(wěn)定、多位點(diǎn)反轉(zhuǎn)的高效轉(zhuǎn)換系統(tǒng)至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供特異性反轉(zhuǎn)系統(tǒng)、其構(gòu)建方法及應(yīng)用。

2、本發(fā)明提供了重組酶變體，其包括氨基酸序列如seq?id?no:1所示的重組酶的第246位的丙胺酸f突變?yōu)槔i氨酸v、295位的丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸s和第330位的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸t(yī)。

3、進(jìn)一步的，所述的重組酶變體，其包括氨基酸如seq?id?no:1所示的重組酶的第30位的谷氨酰胺q突變?yōu)橘嚢彼醟、第109位的亮氨酸l突變?yōu)楦彼醦、第246位的丙胺酸f突變?yōu)槔i氨酸v、295位的丙氨酸a突變?yōu)榻z氨酸s和第330位的丙氨酸a突變?yōu)樘K氨酸t(yī)。

4、本發(fā)明通過兩輪定向進(jìn)化，依次篩選獲得重組酶變體rci51和rci51-5，其中，rci51-5突變體的多位點(diǎn)反轉(zhuǎn)能力大幅提升，并且避免了多位點(diǎn)反轉(zhuǎn)致死的問題。

5、進(jìn)一步的，

6、所述rci51為氨基酸序列如seq?id?no:1所示的重組酶的第246位的丙胺酸f突變?yōu)槔i氨酸v、295位的丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸s和第330位的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸t(yī)；

7、所述rci51-5為氨基酸序列如seq?id?no:1所示的重組酶的第30位的谷氨酰胺q突變?yōu)橘嚢彼醟、第109位的亮氨酸l突變?yōu)楦彼醦、第246位的丙胺酸f突變?yōu)槔i氨酸v、295位的丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸s、第330位的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸t(yī)。

8、本發(fā)明提供了反轉(zhuǎn)系統(tǒng)，其包括本發(fā)明所述的重組酶變體和反轉(zhuǎn)位點(diǎn)；

9、所述反轉(zhuǎn)位點(diǎn)包括sfxa101、sfxa102、sfxa107、sfxa108、sfxa109和/或sfxa112中的至少一種；

10、進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的反轉(zhuǎn)系統(tǒng)，還包括至少一個(gè)目標(biāo)基因。

11、所述目標(biāo)基因包括但不限于啟動(dòng)子、終止子、結(jié)構(gòu)基因、增強(qiáng)子沉默子和/或反轉(zhuǎn)位點(diǎn)。

12、進(jìn)一步的，本發(fā)明的試驗(yàn)結(jié)果表明sfxa101位點(diǎn)的反轉(zhuǎn)效率最高。

13、所述反轉(zhuǎn)包括單位點(diǎn)反轉(zhuǎn)和/或多位點(diǎn)反轉(zhuǎn)。

14、本發(fā)明提供的反轉(zhuǎn)系統(tǒng)的原理為：將目標(biāo)基因插入方向相反的反轉(zhuǎn)位點(diǎn)之間，在重組酶的作用下，完成兩個(gè)方向相反的反轉(zhuǎn)位點(diǎn)之間的目標(biāo)基因位置和轉(zhuǎn)錄方向的轉(zhuǎn)換；

15、具體的，所述目標(biāo)基因可以為單個(gè)或多個(gè)；所述反轉(zhuǎn)位點(diǎn)可以為單個(gè)或多個(gè)，本發(fā)明對(duì)此不作限定。

16、本發(fā)明所述的反轉(zhuǎn)系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)單位點(diǎn)和多位點(diǎn)的反轉(zhuǎn)，在利用本發(fā)明所述的重組酶變體和/或反轉(zhuǎn)位點(diǎn)為sfxa101的情況下可根據(jù)試驗(yàn)需求進(jìn)行設(shè)計(jì)。

17、位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)即本發(fā)明的反轉(zhuǎn)系統(tǒng)，是一種多功能基因組編輯工具，通過設(shè)置重組位點(diǎn)的方向可以控制位點(diǎn)間dna發(fā)生反轉(zhuǎn)或刪除，對(duì)于遺傳多樣性的產(chǎn)生有重要意義。然而重組系統(tǒng)中的刪除可能會(huì)發(fā)揮負(fù)面作用。例如，在酵母基因組合成計(jì)劃（sc2.0項(xiàng)目）中，scramble系統(tǒng)在介導(dǎo)基因組尺度的重排時(shí)會(huì)不可避免的產(chǎn)生位點(diǎn)間dna的大量刪除，甚至導(dǎo)致菌株致死。構(gòu)建具有dna反轉(zhuǎn)偏向性的dna重組系統(tǒng)（傾向于發(fā)生反向位點(diǎn)間的反轉(zhuǎn)而不是同向位點(diǎn)間的刪除）可能有效解決這一問題。

18、本發(fā)明通過設(shè)計(jì)新型篩選系統(tǒng)、兩輪逐步嚴(yán)苛的定向進(jìn)化獲得高效反轉(zhuǎn)酶，并通過反轉(zhuǎn)位點(diǎn)的篩選，首次在真核生物中創(chuàng)建了傾向于發(fā)生反轉(zhuǎn)而不是刪除的多重反轉(zhuǎn)系統(tǒng)rci51-5/multi-sfxa101。與此同時(shí)，與常用的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)?cre/multi-loxp相比，該系統(tǒng)展現(xiàn)出顯著降低的刪除率，這一獨(dú)特優(yōu)勢也使得該多重反轉(zhuǎn)系統(tǒng)被巧妙應(yīng)用于代謝路徑啟動(dòng)子替換。

19、本發(fā)明所述的反轉(zhuǎn)系統(tǒng)僅需要簡單的初始一步組裝過程來產(chǎn)生多樣性文庫，為真核生物中基因組工程、細(xì)胞條形碼等領(lǐng)域也提供了一種獨(dú)特工具。

20、并且，本發(fā)明的反轉(zhuǎn)系統(tǒng)通過增加啟動(dòng)子和外源基因的數(shù)量來擴(kuò)展多基因啟動(dòng)子調(diào)控系統(tǒng)的尺度，以產(chǎn)生更多樣化的基因表達(dá)組合，也可以更換外源基因模塊實(shí)現(xiàn)多種產(chǎn)物優(yōu)化。

21、本發(fā)明的反轉(zhuǎn)系統(tǒng)豐富了真核生物位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的類型，多重反轉(zhuǎn)系統(tǒng)通過多個(gè)位點(diǎn)之間dna的隨機(jī)反轉(zhuǎn)產(chǎn)生復(fù)雜的結(jié)構(gòu)重排，在產(chǎn)生遺傳多樣性和表型適應(yīng)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，也為細(xì)胞條形碼、遺傳電路和代謝工程提供了新的工具。同時(shí)，發(fā)明也為進(jìn)一步優(yōu)化和開發(fā)新型重組酶系統(tǒng)、深入探索反轉(zhuǎn)機(jī)理等奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

22、本發(fā)明提供了生物材料，其包括如下a）~c）所示中的至少一種：

23、a）、編碼本發(fā)明所述的重組酶變體和/或本發(fā)明所述的反轉(zhuǎn)系統(tǒng)的核酸；

24、b）、含有如a）所示核酸的重組載體；

25、c）、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染如c）所示重組載體的宿主細(xì)胞；

26、d）、培養(yǎng)如c）所示宿主細(xì)胞獲得的混合物。

27、本發(fā)明所述的編碼重組抗原的核酸可以是dna、rna、cdna或pna。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述核酸為dna或rna形式。所述dna形式包括cdna、基因組dna或人工合成的dna。所述dna可以是單鏈的或是雙鏈的。核酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，如編碼區(qū)和非編碼區(qū)如調(diào)控序列（例如啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止子）。核酸在拓?fù)鋵W(xué)上可以是線性或環(huán)狀的。核酸可以是載體（如表達(dá)或克隆載體）的一部分，或一個(gè)片段。所述核酸可直接從天然來源獲得，或者可由重組、酶法或化學(xué)技術(shù)輔助制備。所述rna形式為由基因轉(zhuǎn)錄獲得的mrna等。

28、在本發(fā)明中，所述核酸可以為經(jīng)密碼子優(yōu)化的，也可以為未經(jīng)密碼子優(yōu)化的，這些優(yōu)化包括但不限于：密碼子使用偏好性，消除不利于表達(dá)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(如發(fā)夾結(jié)構(gòu))，改變gc含量，cpg二核苷酸含量，mrna的二級(jí)結(jié)構(gòu)，隱蔽剪接位點(diǎn)，早期多聚腺苷化位點(diǎn)，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)，負(fù)cpg島，rna不穩(wěn)定區(qū)，重復(fù)序列(直接重復(fù)、反向重復(fù)等)和可能影響克隆的限制性位點(diǎn)。

29、本發(fā)明提供了重組載體，其包括載體骨架和本發(fā)明所述的核酸。

30、本發(fā)明所述重組載體，是指重組的核酸載體，是一種重組dna分子，其包含期望的編碼序列和對(duì)可操作連接的編碼基因在具體宿主生物內(nèi)的表達(dá)所必不可少的合適的核酸序列或元件。一經(jīng)轉(zhuǎn)化進(jìn)入合適的宿主，載體可以獨(dú)立于宿主基因組進(jìn)行復(fù)制和發(fā)揮作用，或者，在一些情況下，自己整合進(jìn)入基因組。在本說明書中，“質(zhì)粒”和“載體”有時(shí)可以交換通用，因?yàn)橘|(zhì)粒是當(dāng)前最普遍使用的載體形式。然而，本發(fā)明意圖包括表達(dá)載體的這樣的其它形式，其發(fā)揮等價(jià)作用，其在本領(lǐng)域是已知的或?qū)⒆優(yōu)橐阎?，包括但不限于：質(zhì)粒，噬菌體顆粒，病毒載體和/或僅為潛在的基因組插入物。

31、進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的載體骨架的來源包括植物、動(dòng)物、細(xì)菌、真菌、噬菌體、或病毒，本發(fā)明對(duì)此不做限定。

32、本發(fā)明提供的宿主細(xì)胞，其來源包括植物、動(dòng)物、細(xì)菌、真菌、噬菌體或病毒，本發(fā)明對(duì)此不做限定。本發(fā)明使用重組dna技術(shù)構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，這樣轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞有能力復(fù)制編碼蛋白質(zhì)的載體、或表達(dá)期望蛋白質(zhì)、或行使基因反轉(zhuǎn)能力。

33、更進(jìn)一步的，所述轉(zhuǎn)化的方法包括：化學(xué)轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)化；所述轉(zhuǎn)染的方法包括磷酸鈣共沉淀、人工脂質(zhì)體法、病毒轉(zhuǎn)染。所述的病毒轉(zhuǎn)染包括腺病毒轉(zhuǎn)染、腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染、慢病毒轉(zhuǎn)染等。

34、本發(fā)明提供了如下所示a）~c）所示中的至少一種在目標(biāo)基因轉(zhuǎn)換中的應(yīng)用：

35、a）本發(fā)明所述的重組酶變體；

36、b）、本發(fā)明所述的反轉(zhuǎn)系統(tǒng)；

37、c）、本發(fā)明所述的生物材料。

38、本發(fā)明提供了目標(biāo)基因轉(zhuǎn)換的產(chǎn)品，其包括輔料和如下i）~iii）所示中的至少一種：

39、i）、權(quán)利要求1或2所述的重組酶變體；

40、ii）、權(quán)利要求3~6任一項(xiàng)所述的反轉(zhuǎn)系統(tǒng)；

41、iii）、權(quán)利要求8所述的生物材料。

42、本發(fā)明的產(chǎn)品中，所述輔料包括用于維持所述重組酶變體、反轉(zhuǎn)系統(tǒng)或生物材料的活性，或協(xié)助其發(fā)揮作用的緩沖液、培養(yǎng)基、抗生素、穩(wěn)定劑、防腐劑等。

43、本發(fā)明提供了基因反轉(zhuǎn)的方法，其包括利用如下i）~iii）所示中的至少所示中的至少一種進(jìn)行基因反轉(zhuǎn)：

44、i）、本發(fā)明所述的重組酶變體；

45、ii）、本發(fā)明所述的堿基反轉(zhuǎn)系統(tǒng)；

46、iii）、本發(fā)明所述的生物材料；

47、iv）、本發(fā)明所述的產(chǎn)品。

48、本發(fā)明的反轉(zhuǎn)系統(tǒng)為細(xì)胞條形碼、遺傳電路和代謝工程提供了新的工具。

49、本發(fā)明提供的基因反轉(zhuǎn)的方法中，目標(biāo)基因插入方向相反的反轉(zhuǎn)位點(diǎn)之間，在重組酶變體的作用下，完成兩個(gè)方向相反的反轉(zhuǎn)位點(diǎn)之間的目標(biāo)基因位置和轉(zhuǎn)錄方向的轉(zhuǎn)換；具體的，所述目標(biāo)基因插入方向相反的反轉(zhuǎn)位點(diǎn)之間獲得的重組片段與重組酶變體可以在同一個(gè)載體上，也可以在不同的載體上，本發(fā)明對(duì)此不作限定；本發(fā)明的具體實(shí)施例中，將分別含有所述重組片段和重組酶變體的載體共轉(zhuǎn)化宿主，誘導(dǎo)重組酶變體表達(dá)發(fā)揮功能，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)換。

50、具體的，所述目標(biāo)基因可以為單個(gè)或多個(gè)；所述反轉(zhuǎn)位點(diǎn)可以為單個(gè)或多個(gè)，本發(fā)明對(duì)此不作限定。

51、本發(fā)明通過對(duì)重組酶定向進(jìn)化以及反轉(zhuǎn)位點(diǎn)篩選，獲得了能夠在真核生物體內(nèi)進(jìn)行高效多位點(diǎn)特異性反轉(zhuǎn)的新工具。試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的反轉(zhuǎn)系統(tǒng)可用于真核生物中，實(shí)現(xiàn)高效率的多位點(diǎn)的反轉(zhuǎn)，解決了刪除致死的缺點(diǎn)，彌補(bǔ)了真核生物多位點(diǎn)反轉(zhuǎn)系統(tǒng)的空缺，具有廣泛的應(yīng)用前景，為細(xì)胞條形碼、遺傳電路和代謝工程提供了新的工具。