相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本技術(shù)要求基于2022年3月18日提交的韓國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第10-2022-0034234號(hào)的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益，并且相應(yīng)韓國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)文件中公開(kāi)的全部?jī)?nèi)容作為本說(shuō)明書(shū)的一部分并入。本發(fā)明提供了一種源自赤擬谷盜(tribolium?castaneum)的具有增強(qiáng)的天冬氨酸1-脫羧酶活性的微生物，一種生產(chǎn)包含所述微生物的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的組合物，以及一種生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的方法，包括培養(yǎng)所述微生物。

背景技術(shù)：

1、β-丙氨酸(β-alanine)是天然存在的β-氨基酸，其中，氨基與β碳結(jié)合。β-丙氨酸天然存在于諸如家禽、肉類(lèi)和魚(yú)類(lèi)等食品中，并用于在肌肉中合成肌肽。

2、β-丙氨酸衍生化合物，例如β-丙氨酸和泛酸，是商業(yè)上重要的物質(zhì)之一，應(yīng)用于各種工業(yè)領(lǐng)域，例如保健食品、食品、藥品、動(dòng)物飼料等。

3、因此，需要開(kāi)發(fā)一種在生物技術(shù)制備β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物中具有有利作用的微生物，以及使用所述微生物制備β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的技術(shù)。

4、現(xiàn)有技術(shù)

5、專(zhuān)利文獻(xiàn)

6、(專(zhuān)利文獻(xiàn)1)美國(guó)專(zhuān)利第7718205號(hào)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、技術(shù)問(wèn)題

2、本技術(shù)提供了一種具有增強(qiáng)的天冬氨酸1-脫羧酶活性和增強(qiáng)的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力的微生物。

3、本技術(shù)提供了一種生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的組合物，包含該微生物。

4、本技術(shù)提供了一種生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物。

5、本技術(shù)提供了一種微生物用于生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的用途。

6、本技術(shù)提供了一種微生物用于制備生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的組合物的用途。

7、技術(shù)方案

8、本技術(shù)涉及一種生產(chǎn)和/或增強(qiáng)天冬氨酸和/或天冬氨酸-1-脫羧酶的β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力的用途，所述天冬氨酸-1-脫羧酶例如衍生自赤擬谷盜的天冬氨酸1-脫羧酶。

9、一個(gè)方面提供了一種具有增強(qiáng)的天冬氨酸1-脫羧酶活性的微生物(或菌株、重組細(xì)胞)。

10、在本技術(shù)中，天冬氨酸1-脫羧酶(或pand蛋白)可以指具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的蛋白質(zhì)。天冬氨酸1-脫羧酶可以源自赤擬谷盜(triboliumcastaneum、red?flourbeetle)、大腸桿菌(escherichia?coli)、枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)、深紅沙雷氏菌(serratia?rubidaea)、谷氨酸棒狀桿菌(corynebacterium?glutamicum)或假單胞菌屬(pseudomonas?sp.)細(xì)菌，但不限于此。在一種實(shí)施方式中，天冬氨酸1-脫羧酶可以源自赤擬谷盜，并且源自赤擬谷盜的天冬氨酸1-脫羧酶的序列可以從已知的數(shù)據(jù)庫(kù)ncbi獲得，并且例如，其可以由ncbi參考序列np_001096055.1來(lái)表示。在一種實(shí)施方式中，源自赤擬谷盜的天冬氨酸1-脫羧酶可具有或包含seq?id?no：27的氨基酸序列，或由該氨基酸序列組成，或基本上由該氨基酸序列組成。具體地，天冬氨酸1-脫羧酶可以由描述為seq?id?no：27的氨基酸序列的多肽組成。

11、在一種實(shí)施方式中，天冬氨酸1-脫羧酶蛋白質(zhì)可以與seq?id?no：27所述的氨基酸序列具有至少70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、98.2％或更高、98.4％或更高、98.6％或更高、98.8％或更高、98.9％或更高、99％或更高、99.1％或更高、99.3％或更高、99.5％或更高、99.7％或更高、或99.9％或更高的同源性或同一性，或包含所述序列，或由所述序列組成，但不限于此。此外，只要是具有這樣的同源性或同一性并且表現(xiàn)出與天冬氨酸1-脫羧酶對(duì)應(yīng)的功效的氨基酸序列，天冬氨酸1-脫羧酶中也可以包括具有其中一些序列被缺失、修飾、取代、保守取代或添加的氨基酸序列的變體。例如，在n-末端、c-末端和/或氨基酸序列內(nèi)部的不改變天冬氨酸1-脫羧酶活性的序列的添加或缺失的情況，可以天然存在的突變、靜默突變或保守取代。

12、“保守取代”是指一種氨基酸被具有相似結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)特性的另一氨基酸取代。這種氨基酸取代通?？梢曰跉埢臉O性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性性質(zhì)的相似性而發(fā)生。通常，保守取代可以幾乎不影響或不影響蛋白質(zhì)或多肽的活性。

13、在本技術(shù)中，天冬氨酸1-脫羧酶可以是具有由天冬氨酸1-脫羧酶基因編碼的天冬氨酸1-脫羧酶活性的多肽。天冬氨酸1-脫羧酶基因可以源自赤擬谷盜、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、深紅沙雷氏菌、谷氨酸棒狀桿菌或假單胞菌屬細(xì)菌，但不限于此。在一種實(shí)施方式中，天冬氨酸1-脫羧酶基因可以源自赤擬谷盜。源自赤擬谷盜的天冬氨酸1-脫羧酶基因的序列可以從已知的數(shù)據(jù)庫(kù)ncbi獲得，并且例如，其可以由ncbi參考序列：nm_001102585.1來(lái)表示。在一種實(shí)施方式中，源自赤擬谷盜的天冬氨酸1-脫羧酶基因可具有或包含seq?id?no:38的核酸序列，或由該核酸序列組成，或基本上由該核酸序列組成。具體地，天冬氨酸1-脫羧酶基因可以由seq?id?no：38的核酸序列組成。在一種實(shí)施方式中，天冬氨酸1-脫羧酶基因可包含與seq?id?no:38的核酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％或更高的同源性或同一性的核酸序列，或由所述序列組成。

14、在本技術(shù)中，多核苷酸或多肽“具有或包含特定的核酸序列(堿基序列)或氨基酸序列、或由所述序列組成、或基本上由所述序列組成”可以指多核苷酸或多肽可以指基本上包含特定的核酸序列(堿基序列)或氨基酸序列，并且其可被解釋為包含在維持該多核苷酸或多肽的原始功能和/或所需功能的范圍內(nèi)對(duì)特定的核酸序列(堿基序列)或氨基酸序列應(yīng)用突變(缺失、取代、修飾和/或添加)的“基本上等同的序列”(或不排除該突變)。在一種實(shí)施方式中，多核苷酸或多肽“具有或包含特定的核酸(堿基序列)或氨基酸序列、由所述序列組成、或基本上由所述序列組成”可以指多核苷酸或多肽(i)基本上包含該特定的核酸序列(堿基序列)或氨基酸序列，或(ii)由與該特定核酸序列(堿基序列)或氨基酸序列具有70％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高的同源性或同一性的核酸序列或氨基酸序列組成，或基本上包含該該特定核酸序列(堿基序列)或氨基酸序列，并且維持原始功能和/或所需功能。在一種實(shí)施方式中，所需功能可以指增加(增強(qiáng))或賦予微生物的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力的功能。

15、在本技術(shù)中，術(shù)語(yǔ)“同源性”或“同一性”是指兩個(gè)給定氨基酸序列或堿基序列之間的相似程度，并且可以表示為百分比。術(shù)語(yǔ)、同源性和同一性通?？梢曰Q使用。

16、保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)陣列算法來(lái)確定，并且可以一起使用由所使用的程序建立的默認(rèn)空位罰分?；旧希葱曰蛲恍缘男蛄型ǔ？梢栽谥械然蚋邍?yán)格條件下與序列的整體或部分雜交。顯然，雜交還包括與多核苷酸中含有共同密碼子或考慮到密碼子簡(jiǎn)并性的密碼子的多核苷酸雜交。

17、任何兩個(gè)多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性可以諸如使用pearson等人(1988)[proc.natl.acad.sci.usa?85]:2444中的默認(rèn)參數(shù)，使用已知的計(jì)算機(jī)算法諸如“fasta”程序來(lái)確定。另外，可以使用如在emboss包(emboss：the?europeanmolecular?biology?open?software?suite,rice等人,2000,trends?genet.16:276-277)(版本5.0.0或以后版本)(包括gcg程序包(devereux,j.等人,nucleic?acids?research12:387(1984))的needleman程序中所執(zhí)行的needlean-wunsch算法(needleman和wunsch，1970，j.mol.biol.48：443-453)、blastp、blastn、fasta(atschul,[s.][f.,]等人,j?molecbiol?215]:403(1990)；guide?to?huge?computers,martin?j.bishop,[編]academicpress,san?diego,1994,以及[carillo等人.](1988)siam?japplied?math?48:1073)來(lái)確定。例如，可以使用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息數(shù)據(jù)庫(kù)中心的blast或clustalw來(lái)確定同源性、相似性或同一性。

18、多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性可以通過(guò)使用例如smith和waterman,adv.appl.math(1981)2:482中已知的，例如gap計(jì)算機(jī)程序如needleman等人(1970),j?molbiol.48:443比較序列信息來(lái)確定。總之，gap程序可以定義為通過(guò)將兩個(gè)序列中較短的序列中的符號(hào)總數(shù)除以類(lèi)似比對(duì)符號(hào)(即，核苷酸或氨基酸)得到的值。gap程序的默認(rèn)參數(shù)可以包括(1)二元比較矩陣(包括相同值為1和不同值為0)和gribskov等人(1986)nucl.acidsres.14:6745的加權(quán)比較矩陣，在schwartz和dayhoff編，atlas?of?protein?sequence?andstructure,national?biomedical?research?foundation,第353-358頁(yè)(1979)中公開(kāi)(或ednafull(ncbi?nuc4.4的emboss版)取代矩陣)；(2)每個(gè)空位的罰分為3.0并且每個(gè)空位的每個(gè)符號(hào)額外罰分0.10(或空位開(kāi)放罰分為10，空位延伸罰分為0.5)；以及(3)末端空位沒(méi)有罰分。

19、在本技術(shù)中，術(shù)語(yǔ)“微生物(或菌株)”包括所有野生型微生物或天然或人工發(fā)生遺傳修飾的微生物，并且可以是包含用于生產(chǎn)靶向的多肽、蛋白質(zhì)或產(chǎn)物(例如天冬氨酸1-脫羧酶)的遺傳修飾的微生物，所述微生物是由于例如插入外源基因或增強(qiáng)或弱化內(nèi)源基因的活性而導(dǎo)致特異性機(jī)制被增強(qiáng)或弱化的微生物。

20、在本技術(shù)中，術(shù)語(yǔ)多肽活性的“增強(qiáng)”是指多肽的活性與內(nèi)源活性相比增加。增強(qiáng)可以與諸如活化、上調(diào)、過(guò)表達(dá)、增加等術(shù)語(yǔ)互換使用。本文中，活化、上調(diào)、過(guò)表達(dá)和增加可包括表現(xiàn)出原始不存在的活性，或表現(xiàn)出與內(nèi)源活性或修飾前的活性相比改善的活性?！皟?nèi)源活性”是指當(dāng)由于天然或人工因素引起的遺傳突變而性狀改變時(shí)，由性狀改變前的親本菌株或未修飾微生物最初具有的特定多肽的活性。這可以與“修飾前活性”互換使用。與內(nèi)源活性相比，多肽活性“增強(qiáng)”、“上調(diào)”、“過(guò)表達(dá)”或“增加”是指與在性狀改變之前的親本菌株或未修飾微生物最初具有的特定多肽的活性和/或濃度(表達(dá)水平)相比，多肽活性改善。

21、增強(qiáng)可通過(guò)引入外源多肽來(lái)實(shí)現(xiàn)或可以是增強(qiáng)內(nèi)源多肽的活性和/或濃度(表達(dá)水平)?？梢酝ㄟ^(guò)活性程度、相應(yīng)多肽的表達(dá)水平或從相應(yīng)多肽釋放的產(chǎn)物量的增加來(lái)確認(rèn)多肽活性是否增強(qiáng)。

22、對(duì)于多肽活性的增強(qiáng)，可以應(yīng)用本領(lǐng)域公知的各種方法，并且沒(méi)有限制，只要靶多肽的活性能夠與修飾之前微生物的活性相比增強(qiáng)即可。具體地，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的基因工程和/或蛋白質(zhì)工程，它們是分子生物學(xué)的常規(guī)方法，但不限于此(例如，sitnicka等人，functional?analysis?of?genes.advances?in?cell?biology.2010,vol.2.1-16,sambrook等人，molecular?cloning2012等)。

23、具體地，本技術(shù)多肽的增強(qiáng)可以為：

24、1)編碼多肽的多核苷酸的細(xì)胞拷貝數(shù)增加；

25、2)用具有強(qiáng)活性的序列替換染色體上編碼多肽的基因表達(dá)調(diào)控區(qū)；

26、3)修飾編碼多肽的基因轉(zhuǎn)錄組的起始密碼子或5’-utr區(qū)的堿基序列；

27、4)修飾多肽的氨基酸序列，以增強(qiáng)多肽的活性；

28、5)修飾編碼多肽的多核苷酸序列，以增強(qiáng)多肽的活性(例如，修飾多肽基因的多核苷酸以編碼經(jīng)修飾以增強(qiáng)多肽活性的多肽)；

29、6)引入表現(xiàn)出多肽活性的外源多肽或編碼多肽的外源多核苷酸；

30、7)密碼子優(yōu)化編碼多肽的多核苷酸；

31、8)通過(guò)分析多肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)并選擇暴露位點(diǎn)的修飾或化學(xué)修飾；或

32、9)選自上述1)至8)中的至少2種的組合，但不限于此。

33、更具體地，上述1)中編碼多肽的多核苷酸的細(xì)胞中拷貝數(shù)的增加可以通過(guò)引入載體來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述載體可以獨(dú)立于宿主復(fù)制并起作用，其中編碼相應(yīng)多肽的多核苷酸可操作地連接。除此之外，可以通過(guò)將編碼相應(yīng)多肽的多核苷酸的1個(gè)拷貝或2個(gè)拷貝以上引入宿主細(xì)胞的染色體中來(lái)實(shí)現(xiàn)。引入染色體中可以通過(guò)將能夠?qū)⒍嗪塑账岵迦胨拗骷?xì)胞染色體中的載體中而引入宿主細(xì)胞中來(lái)進(jìn)行，但不限于此。載體如上文所述。

34、上述2)中用具有強(qiáng)活性的序列替換染色體上編碼多肽的基因表達(dá)調(diào)控區(qū)(或表達(dá)調(diào)控序列)可以是例如通過(guò)缺失、插入、非保守或保守取代或其組合而發(fā)生序列的突變，以進(jìn)一步增強(qiáng)表達(dá)調(diào)控區(qū)的活性，或用具有更強(qiáng)活性的序列替換。表達(dá)調(diào)控區(qū)不特別地限于此，但可以包含啟動(dòng)子、操作子序列、編碼核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列等。作為一個(gè)實(shí)例，可以用強(qiáng)啟動(dòng)子替換原始啟動(dòng)子，但不限于此。

35、已知的強(qiáng)啟動(dòng)子的實(shí)例包括cj1至cj7啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利us?7662943?b2)、lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、λ噬菌體pr啟動(dòng)子、pl啟動(dòng)子、tet啟動(dòng)子、gapa啟動(dòng)子、spl7啟動(dòng)子、spl13(sm3)啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利us10584338?b2)、o2啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利us10273491?b2)、tkt啟動(dòng)子、ycca啟動(dòng)子等，但不限于此。

36、上述3)中修飾編碼多肽的基因轉(zhuǎn)錄組的起始密碼子或5’-utr區(qū)的堿基序列可以是例如用編碼與內(nèi)源性起始密碼子相比具有更高多肽表達(dá)率的另一種起始密碼子的堿基序列取代，但不限于此。

37、上述4)和5)的氨基酸序列或多核苷酸序列的修飾可以是通過(guò)缺失、插入、非保守性或保守取代或其組合在序列中發(fā)生突變，或者用改善以具有更強(qiáng)的活性的氨基酸序列或多核苷酸序列替換多肽的氨基酸序列或編碼多肽的多核苷酸序列，從而增強(qiáng)多肽的活性，但不限于此。可以具體通過(guò)同源重組將多核苷酸插入染色體進(jìn)行替換，但不限于此。然后使用的載體還可以包括用于確認(rèn)染色體插入的選擇標(biāo)記物。選擇標(biāo)記物如上文所述。

38、上述6)中引入表現(xiàn)出多肽活性的外源多肽可以是將編碼表現(xiàn)出與多肽相同/相似活性的多肽的外源多核苷酸引入宿主細(xì)胞中。外源多核苷酸的來(lái)源或序列不受限制，只要其表現(xiàn)出與多肽相同/相似的活性即可。引入所使用的方法可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)適當(dāng)?shù)剡x擇已知的轉(zhuǎn)化方法，并且通過(guò)在宿主細(xì)胞中表達(dá)引入的多核苷酸來(lái)進(jìn)行，可以生產(chǎn)多肽并且可以增加其活性。

39、上述7)中密碼子優(yōu)化編碼多肽的多核苷酸可以是密碼子優(yōu)化使得在宿主細(xì)胞中增加內(nèi)源多核苷酸的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或密碼子優(yōu)化使得外源多核苷酸在宿主細(xì)胞中優(yōu)化以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄和翻譯。

40、上述8)中通過(guò)分析多肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)并選擇暴露位點(diǎn)的修飾或化學(xué)修飾可通過(guò)比較待分析的多肽的序列信息來(lái)根據(jù)序列的相似程度確定模板蛋白候選物，基于此確定結(jié)構(gòu)并選擇待修飾或化學(xué)修飾的暴露位點(diǎn)，并對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)化或修飾。

41、此類(lèi)多肽活性的增強(qiáng)可以是基于野生型或修飾前的微生物菌株中表達(dá)的多肽的活性或濃度，相應(yīng)多肽的活性或濃度表達(dá)水平增加，或由相應(yīng)多肽生產(chǎn)的產(chǎn)物的量增加，但不限于此。

42、在本技術(shù)中，術(shù)語(yǔ)多肽的“弱化”是包括與內(nèi)源活性相比活性降低或不具有活性的概念。弱化可與諸如失活、缺失、下調(diào)、降低、減少、衰減等術(shù)語(yǔ)互換使用。弱化還可以包括與原始微生物具有的多肽的活性相比，由于編碼多肽(或蛋白質(zhì)，例如天冬氨酸1-脫羧酶)的多核苷酸的突變等而使多肽本身所具有的活性降低或消除的情況；由于編碼多肽的多核苷酸的基因的表達(dá)的抑制或翻譯成多肽的抑制而細(xì)胞中總體多肽活性水平和/或濃度(表達(dá)水平)比天然菌株更低的情況；多核苷酸完全不表達(dá)的情況；和/或即使多核苷酸表達(dá)，多肽也不具有活性的情況?！皟?nèi)源活性”是指當(dāng)由于天然或人工因素引起的遺傳突變而性狀改變時(shí)，在性狀改變之前的親本菌株或未修飾的微生物最初具有的特定多肽的活性。內(nèi)源活性可以與“修飾前活性”互換使用。與內(nèi)源活性相比，多肽的該活性是“失活的、缺失的、降低的、下調(diào)的、減少的或減弱的”，是指與在性狀改變之前的親本菌株或未修飾的微生物最初具有的特定多肽的活性相比多肽的活性降低。

43、此多肽(或蛋白質(zhì)，例如天冬氨酸1-脫羧酶)的活性的弱化可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)進(jìn)行，但不限于此，并且可以通過(guò)應(yīng)用本領(lǐng)域公知的各種方法(例如，nakashiman等人，bacterial?cellular?engineering?by?genome?editing?and?gene?silencing.intj?mol?sci.2014；15(2):2773-2793,sambrook等人，molecular?cloning?2012,等)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

44、具體地，多肽(或蛋白質(zhì)，例如天冬氨酸1-脫羧酶；下文稱(chēng)為多肽)的弱化可以是

45、1)缺失編碼多肽的基因的全部或部分；

46、2)修飾表達(dá)調(diào)控區(qū)(或表達(dá)調(diào)控序列)，以降低編碼多肽的基因的表達(dá)；

47、3)修飾(例如，氨基酸序列中至少一個(gè)氨基酸的缺失/取代/添加)構(gòu)成多肽的氨基酸序列，以消除或弱化多肽活性；

48、4)修飾(例如，編碼經(jīng)修飾以消除或弱化多肽活性的多肽的多肽基因的核酸堿基序列中至少一個(gè)核酸堿基的添加/取代/添加)編碼多肽的基因序列，以消除或弱化多肽的活性；

49、5)修飾編碼多肽的基因轉(zhuǎn)錄組的起始密碼子或5’-utr區(qū)的堿基序列；

50、6)引入與編碼多肽的基因的轉(zhuǎn)錄組互補(bǔ)結(jié)合的反義寡核苷酸(例如，反義rna)；

51、7)在編碼多肽的基因的shine-dalgarno序列之前添加與shine-dalgarno序列互補(bǔ)的序列，以形成不能附著核糖體的二級(jí)結(jié)構(gòu)；

52、8)添加在編碼多肽的基因序列的orf(開(kāi)放閱讀框)的3’末端的相反方向上轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子(逆轉(zhuǎn)錄工程，rte)；或

53、9)選自1)至8)中的至少2種的組合，但不限于此。

54、例如，

55、上述1)中缺失編碼多肽的基因的全部或部分可以除去染色體中編碼內(nèi)源性靶多肽的整個(gè)多核苷酸、用缺失一些核苷酸的多肽替換、或用標(biāo)記基因替換。

56、此外，上述2)中修飾表達(dá)控制區(qū)(或表達(dá)控制序列)可為通過(guò)缺失、插入、非保守或保守取代或其組合而在表達(dá)控制區(qū)(或表達(dá)控制序列)發(fā)生突變，或用具有較弱活性的序列替換。表達(dá)控制區(qū)包括啟動(dòng)子、操縱子序列、編碼核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列以及調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列，但不限于此。

57、此外，上述3)中修飾編碼多肽的基因轉(zhuǎn)錄組的起始密碼子或5’-utr區(qū)的堿基序列可以是例如用編碼與內(nèi)源起始密碼子相比具有更低多肽表達(dá)率的另一種起始密碼子的堿基序列取代，但不限于此。

58、此外，上述4)和5)的氨基酸序列或多核苷酸序列的修飾可以是通過(guò)缺失、插入、非保守或保守取代或其組合在序列中發(fā)生突變，或者用改善為具有較弱活性的氨基酸序列或多核苷酸序列、或改善為不具有活性的氨基酸序列或多核苷酸序列替換，但不限于此。例如，通過(guò)在多核苷酸序列中引入突變來(lái)形成終止密碼子，可以抑制或弱化基因的表達(dá)，但不限于此?！敖K止密碼子”是在mrna上的密碼子中不指定氨基酸，通知蛋白質(zhì)合成過(guò)程結(jié)束，起到信號(hào)作用的密碼子，并且一般使用uaa、uag、uga三種作為終止密碼子。

59、上述6)中引入與編碼多肽的基因的轉(zhuǎn)錄組互補(bǔ)結(jié)合的反義寡核苷酸(例如，反義rna)，可以參考例如文獻(xiàn)[weintraub,h.等人,antisense-rna?as?amolecular?tool?forgenetic?analysis,reviews-trends?in?genetics,vol.1(1)1986]。

60、上述7)中在編碼多肽的基因的shine-dalgarno序列之前添加與shine-dalgarno序列互補(bǔ)的序列，以形成不能附著核糖體的二級(jí)結(jié)構(gòu)可以使mrna不能翻譯或抑制mrna翻譯速度。

61、上述8)中在編碼多肽的基因序列的orf(開(kāi)放閱讀框)的3’末端添加在相反方向上轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子(逆轉(zhuǎn)錄工程，rte)可以產(chǎn)生與編碼多肽的基因的轉(zhuǎn)錄組互補(bǔ)的反義核苷酸以弱化活性。

62、本技術(shù)的微生物可以是通過(guò)載體基因修飾的微生物(例如重組微生物)，從而增強(qiáng)天冬氨酸1-脫羧酶或編碼其的多核苷酸的活性，但不限于此。所述載體如上文所述。

63、本技術(shù)的微生物(或菌株、重組細(xì)胞)可以是具有β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力或具有增強(qiáng)的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)的微生物。

64、本技術(shù)的微生物可以是向天然不具有β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物生產(chǎn)能力的微生物中引入或增強(qiáng)天冬氨酸1-脫羧酶的活性，而賦予或增強(qiáng)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力的微生物，或具有β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物生產(chǎn)能力的微生物，但不限于此。賦予或增強(qiáng)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物生產(chǎn)能力的微生物可以是其中引入了源自赤擬谷盜的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物。

65、所述微生物(或菌株、重組細(xì)胞)具有增強(qiáng)的β-丙氨酸或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)、或具有β-丙氨酸或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力可以指，與未修飾微生物、重組前的細(xì)胞、親本菌株、野生型菌株和/或其中引入源自其他微生物的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物相比，微生物(或菌株、重組細(xì)胞)具有增強(qiáng)的β-丙氨酸或β-丙氨酸衍生化合物生產(chǎn)能力，或微生物(或菌株、重組細(xì)胞)賦予不同于未修飾微生物、重組前的細(xì)胞、親本菌株和/或不具有β-丙氨酸或β-丙氨酸衍生化合物生產(chǎn)能力的野生型菌株，的β-丙氨酸或β-丙氨酸衍生化合物生產(chǎn)能力。

66、與增強(qiáng)前的微生物(即，相同種類(lèi)的未修飾微生物)相比，根據(jù)一種實(shí)施方式的具有增強(qiáng)的天冬氨酸1-脫羧酶活性的微生物可以具有改善的(增加的)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物生產(chǎn)能力。本技術(shù)中，“未修飾的微生物”不排除包含微生物中可以天然存在的突變的菌株，可以指野生型菌株或天然菌株本身，或通過(guò)天然或人工因素導(dǎo)致的基因突變而改變性狀前的菌株。例如，未修飾的微生物可以指根據(jù)一種實(shí)施方式天冬氨酸1-脫羧酶的活性未增強(qiáng)或被增強(qiáng)之前的菌株(誘導(dǎo)天冬氨酸1-脫羧酶的活性增強(qiáng)的突變未引入或在其引入之前的菌株)?！拔葱揎椀奈⑸铩笨梢耘c“修飾前的菌株”、“修飾前的微生物”、“非突變菌株”、“未修飾的菌株”、“未突變的微生物”或“參考微生物”互換使用。增強(qiáng)天冬氨酸1-脫羧酶的活性如上文所述。在一種實(shí)施方式中，未修飾的微生物(其是用于比較β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力是否增加的受試菌株)可以是野生型谷氨酸棒狀桿菌atcc13032菌株。

67、根據(jù)一種實(shí)施方式，具有增強(qiáng)的天冬氨酸1-脫羧酶活性的微生物可以是引入了源自赤擬谷盜的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物，并且與引入了源自另一種微生物的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物相比，該微生物可以具有增強(qiáng)的(增加的)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物生產(chǎn)能力。源自另一種微生物的天冬氨酸1-脫羧酶可以是源自大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、深紅沙雷氏菌、谷氨酸棒狀桿菌或假單胞菌屬細(xì)菌。

68、微生物(或菌株、重組細(xì)胞)可以包括突變以另外增加β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)，并且可以包括突變的任何位置和經(jīng)受突變的任何種類(lèi)基因和/或蛋白質(zhì)而不受限制，只要它增加β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)即可。重組細(xì)胞可以不受限制地使用，只要它為能夠轉(zhuǎn)化的細(xì)胞即可。

69、β-丙氨酸衍生化合物可以是選自由β-硝基丙酸、β-氨基-丙腈、n-乙酰基-β-丙氨酸、l-天冬氨酸、鵝肌肽、精胺、肌肽、β-丙氨酰精氨酸、羥基喹啉銅(quinolinate)、泛酸鹽(或泛酸)、丙二酸半醛、丙二酸鹽、乙炔-單羧酸鹽等所組成的組中的至少一種，但不限于此。

70、作為一種實(shí)例，與突變前的親本菌株、未修飾的微生物或引入源自另一種微生物的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物相比，具有改善的(增加的)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)的微生物(或菌株、重組細(xì)胞)可以具有增加約10％或更大、約20％或更大、約30％或更大、約50％或更大、約100％或更大、約200％或更大、約300％或更大、約400％或更大、約500％或更大、約600％或更大、約700％或更大、約80％或更大、約900％或更大、約1000％或更大、約1500％或更大、約2,000％或更大、約2,500％或更大或約3,000％或更大的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力，并且在一種實(shí)施方式中，該微生物(或菌株、重組細(xì)胞)可增加約33.3％或更大、約100％或更大、約175％或更大、約243.75％或更大、約266.6％或更大、約300％或更大、約450％或更大、約500％或更大、約587.5％或更大、約700％或更大或約2,650％或更大，但不限于此。

71、在另一種實(shí)施方式中，與突變前的親本菌株、未修飾的微生物或引入源自另一種微生物的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物相比，具有增強(qiáng)的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)的微生物(或菌株、重組細(xì)胞)可以具有約1.1倍或更多、約1.3倍或更多、約1.5倍或更多、約2倍或更多、約3倍或更多、約4倍或更多、約5倍或更多、約6倍或更多、約7倍或更多、約8倍或更多、約9倍或更多、約10倍或更多、約15倍或更多、約20倍或更多、約25倍或更多或約30倍或更多(上限不受特別限制，并且例如上限可以是約1,000倍或更少)的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)，并且在一種實(shí)施方式中，該微生物(或菌株、重組細(xì)胞)可以增加約1.3倍或更多、約2倍或更多、約2.75倍或更多、約3.43倍或更多、約3.6倍或更多、約4倍或更多、約5.5倍或更多、約6倍或更多、約6.8倍或更多、約8倍或更多或約27.5倍或更多，但不限于此。

72、在另一種實(shí)施方式中，與突變前的親本菌株、未修飾的微生物或引入源自另一種微生物的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物相比，具有增強(qiáng)的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)的微生物(或菌株、重組細(xì)胞)可以具有約0.5g/l或更大、約1g/l或更大、約1.5g/l或更大、約2.0g/l或更大、約2.5g/l或更大、約3g/l或更大、約3.5g/l或更大、約4g/l或更大、約4.5g/l或更大、約5g/l或更大、約5.5g/l或更大、約6g/l或更大、約7g/l或更大、約8g/l或更大、約9g/l或更大、約10g/l或更大、約15g/l或更大、約20g/l或更大、約25g/l或更大、約30g/l或更大(上限不受特別限制，并且例如上限可以是約100g/l或更小)的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)，并且在一種實(shí)施方式中，該微生物(或菌株、重組細(xì)胞)可以增加約0.6g/l或更大、約1.2g/l或更大、約1.8g/l或更大、約2g/l或更大、約2.4g/l或更大、約3.5g/l或更大、約3.9g/l或更大、約4g/l或更大、約4.5g/l或更大、約4.7g/l或更大、約5.3g/l或更大，但不限于此。

73、更具體地，與突變前的親本菌株、未修飾的微生物或引入源自另一種微生物的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物相比，具有增強(qiáng)的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)的微生物(或菌株、重組細(xì)胞)可以增加約33.3％、約100％、約175％、約243.75％、約266.6％、約300％、約450％、約500％、約587.5％、約700％或約2,650％(或約1.3倍、約2倍、約2.75倍、約3.43倍、約3.6倍、約4倍、約5.5倍、約6倍、約6.8倍、約8倍或約27.5倍；或約0.6g/l、約1.2g/l、約1.8g/l、約2g/l、約2.4g/l、約3.5g/l、約3.9g/l、約4g/l、約4.5g/l、約4.7g/l、約5.3g/l)的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)，但不限于此。

74、術(shù)語(yǔ)“約”是包括所有±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等的范圍，并且包括在與術(shù)語(yǔ)約后的數(shù)值等同或相似范圍內(nèi)的所有數(shù)值，但不限于此。

75、在一種實(shí)施方式中，具有增強(qiáng)的天冬氨酸1-脫羧酶活性的微生物可以是棒狀桿菌屬微生物。該棒狀桿菌屬微生物可以是谷氨酸棒狀桿菌、生乳棒狀桿菌(corynebacteriumcrudilactis)、沙漠棒狀桿菌(corynebacterium?deserti)、有效棒狀桿菌(corynebacterium?efficiens)、帚石南棒狀桿菌(corynebacteriumcallunae)、停滯棒狀桿菌(corynebacterium?stationis)、單一棒狀桿菌屬(corynebacterium?singulare)、耐鹽棒狀桿菌(corynebacterium?halotolerans)、紋帶棒狀桿菌(corynebacteriumstriatum)、產(chǎn)氨棒狀桿菌(corynebacterium?ammoniagenes)、污染棒狀桿菌(corynebacterium?pollutisoli)、亞胺棒狀桿菌(corynebacterium?imitans)、龜口腔棒狀桿菌(corynebacterium?testudinoris)和/或微黃棒狀桿菌(corynebacteriumflavescens)。

76、本技術(shù)的另一個(gè)方面提供了一種生產(chǎn)(或制備)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本技術(shù)的微生物。

77、本技術(shù)的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)方法可以包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本技術(shù)的微生物。本技術(shù)的微生物、β-丙氨酸衍生化合物等如上文所述。

78、在本技術(shù)中，“培養(yǎng)”是指在適當(dāng)調(diào)節(jié)的環(huán)境條件下生長(zhǎng)包含本技術(shù)的天冬氨酸1-脫羧酶活性的微生物。本技術(shù)的培養(yǎng)過(guò)程可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的適當(dāng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行。根據(jù)選擇的菌株，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地調(diào)節(jié)和使用該培養(yǎng)過(guò)程。具體地，培養(yǎng)可以是分批、連續(xù)和/或分批補(bǔ)料，但不限于此。

79、在本技術(shù)中，“培養(yǎng)基”是指將培養(yǎng)本技術(shù)的具有增強(qiáng)的天冬氨酸1-脫羧酶活性的微生物所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)作為主要組分混合的材料，并提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子等，包括對(duì)于生存和生長(zhǎng)至關(guān)重要的水。具體地，可以使用用于培養(yǎng)本技術(shù)的微生物的培養(yǎng)基和其他培養(yǎng)條件，只要它是用于培養(yǎng)普通微生物的培養(yǎng)基而沒(méi)有特別限制，但是本技術(shù)的微生物可以在需氧條件下通過(guò)調(diào)節(jié)溫度、ph等在含有合適碳源、氮源、磷源、無(wú)機(jī)化合物、氨基酸和/或維生素等的普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

80、具體地，用于本技術(shù)的微生物的培養(yǎng)基，例如棒狀桿菌屬菌株的培養(yǎng)基可見(jiàn)于文獻(xiàn)["manual?of?methods?for?general?bacteriology"by?the?american?society?forbacteriology(washington?d.c.,usa,1981)]。

81、在本技術(shù)中，作為碳源可以包括：碳水化合物，諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等；糖醇，諸如甘露醇、山梨醇等；有機(jī)酸，諸如丙酮酸、乳酸、檸檬酸等；氨基酸，諸如谷氨酸、蛋氨酸、賴(lài)氨酸等。此外，可以使用天然有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，例如淀粉水合物、糖蜜、赤糖糊、米糠、木薯、甘蔗殘余物和玉米漿，并且具體地，可以使用碳水化合物諸如葡萄糖和滅菌的預(yù)處理糖蜜(即，用還原糖轉(zhuǎn)化的糖蜜)等，并且可以不同地使用適當(dāng)量的其他碳源，而沒(méi)有限制。這些碳源可以單獨(dú)使用或可以至少兩種組合使用，但不限于此。

82、作為氮源，可以使用：無(wú)機(jī)氮源，諸如氨、硫酸銨、氯化銨、檸檬酸銨、磷酸銨、碳酸銨、硝酸銨等；有機(jī)氮源，諸如氨基酸，包括谷氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺等，蛋白胨、nz-胺、肉提取物、酵母提取物、麥芽提取物、玉米漿、酪蛋白水合物、魚(yú)或其降解產(chǎn)物、脫脂大豆餅或其降解產(chǎn)物等。這些氮源可以單獨(dú)使用或可以至少兩種組合使用，但不限于此。

83、作為磷源，可以包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀或與其對(duì)應(yīng)的含鈉的鹽等。作為無(wú)機(jī)化合物，可以使用氯化鈉、氯化鈣、氯化鐵、硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸錳、碳酸鈣等。除這些之外，可以包括氨基酸、維生素和/或適當(dāng)?shù)那绑w等。這些組分或前體可以分批或連續(xù)方法添加。然而，不限于此。

84、此外，通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ㄔ诒炯夹g(shù)的微生物的培養(yǎng)期間，向培養(yǎng)基中加入諸如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨、磷酸、硫酸等的化合物，來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的ph。此外，在培養(yǎng)期間，可以使用消泡劑如脂肪酸聚乙二醇酯抑制起泡。此外，為了維持培養(yǎng)基的需氧狀態(tài)，可以將氧氣或含氧氣體注入培養(yǎng)基中，或者為了保持無(wú)氧和微氧狀態(tài)，可以不注入氣體或者可以注入氮?dú)狻錃饣蚨趸細(xì)怏w，但不限于此。

85、在本技術(shù)的培養(yǎng)中的培養(yǎng)溫度可以保持在20℃-45℃，具體為25℃-40℃，并且培養(yǎng)可以進(jìn)行約10-160小時(shí)，但不限于此。

86、通過(guò)本技術(shù)的培養(yǎng)生產(chǎn)的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物可以釋放到培養(yǎng)基中或保留在細(xì)胞中。

87、本技術(shù)的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)方法，例如在培養(yǎng)之前可進(jìn)一步包括制備本技術(shù)的微生物(菌株)，制備用于培養(yǎng)該微生物的培養(yǎng)基，或其組合(以任何順序)。

88、本技術(shù)的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)方法可進(jìn)一步包括根據(jù)培養(yǎng)，從培養(yǎng)基(其中進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)基)或微生物(例如，棒狀桿菌屬菌株)中回收β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物?；厥湛梢赃M(jìn)一步包括在培養(yǎng)之后。

89、回收可以根據(jù)本技術(shù)的微生物的培養(yǎng)方法例如分批、連續(xù)或分批補(bǔ)料培養(yǎng)方法等，通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的適當(dāng)方法收集目標(biāo)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物。例如，可以使用離心、過(guò)濾、通過(guò)結(jié)晶蛋白質(zhì)沉淀劑(鹽析法)處理、萃取、超聲破碎、超濾、透析、各種色譜法(諸如分子篩色譜法(凝膠過(guò)濾)、吸附色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法等)、hplc或這些方法的組合，并且使用本領(lǐng)域已知的適當(dāng)方法，可以從培養(yǎng)基或微生物中回收目標(biāo)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物。

90、此外，本技術(shù)的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)方法還可以包括純化步驟?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的適當(dāng)方法進(jìn)行純化。在一種實(shí)施方式中，當(dāng)本技術(shù)的生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的方法包括回收步驟和純化步驟二者時(shí)，可以連續(xù)或非連續(xù)地進(jìn)行回收步驟和純化步驟而不管順序如何，或者可以通過(guò)整合為一個(gè)步驟來(lái)進(jìn)行，而不限于此。

91、本技術(shù)的另一個(gè)方面提供了一種生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的組合物，其包含本技術(shù)的微生物、其中培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基或其組合。

92、本技術(shù)的組合物還可以包括通常用于生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的組合物中的任何合適的賦形劑，并且這樣的賦形劑可以是例如防腐劑、潤(rùn)濕劑、分散劑、懸浮劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑或張力劑等，但不限于此。

93、在本技術(shù)的組合物中，微生物(菌株)、培養(yǎng)基、β-丙氨酸衍生化合物等如上文其它方面所述。

94、本技術(shù)的另一方面提供了一種本技術(shù)的微生物用于生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物或制備用于生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的組合物的用途。本技術(shù)的微生物、β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物或生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的組合物如上文所述。

95、有益效果

96、本技術(shù)提供了一種源自赤擬谷盜的具有增強(qiáng)的天冬氨酸1-脫羧酶活性的微生物，所述微生物具有優(yōu)異的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力。