本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與辣椒不育恢復(fù)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記、方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

辣椒利用cms育性基因(cytoplasmicmalesterility)三系配套制種可以省去人工去雄，提高種子純度，同時有利于知識產(chǎn)權(quán)的保護(hù)。但是，如果父本的育性恢復(fù)力不強(qiáng)，則會嚴(yán)重影響f1的果形和產(chǎn)量。因此，選育恢復(fù)性強(qiáng)、配合力高、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的恢復(fù)系(父本)成為辣椒cms在雜種優(yōu)勢利用中急需解決的主要問題之一。傳統(tǒng)的辣椒cms育性基因選擇是根據(jù)測交組合的育性表現(xiàn)進(jìn)行篩選。分子標(biāo)記輔助選擇可直接反映不同材料dna的多態(tài)性差異，并且選擇不受時間和環(huán)境的影響。通過育性緊密連鎖的分子標(biāo)記直接進(jìn)行育性基因的選擇，可以有效加快恢復(fù)系的篩選進(jìn)程。目前，分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)已在多種作物的cms恢復(fù)系選育中得到應(yīng)用，在雜交后代(或花藥再生植株)苗期鑒定有rf基因的個體，短時間內(nèi)即可在室內(nèi)檢測大量樣品，顯著提高育種的選擇效率。眾多研究認(rèn)為辣椒育性恢復(fù)是由主效恢復(fù)基因rf控制，另外還受修飾基因和環(huán)境因素的影響。

現(xiàn)有技術(shù)中，與辣椒性狀相關(guān)的分子標(biāo)記研究主要包括：(1)采用rapd技術(shù)發(fā)現(xiàn)位于rf基因兩側(cè)的標(biāo)記op131400(0.37cm)和ow19800(8.12cm)；已經(jīng)有研究學(xué)者將分子標(biāo)記opp131400轉(zhuǎn)化為更容易操作的opp13-caps(hinfi)標(biāo)記，此opp13-caps標(biāo)記為顯性標(biāo)記且通用性較強(qiáng)。(2)利用與rf基因連鎖的rapd標(biāo)記opt-02/570(5cm)開發(fā)出的一個sts標(biāo)記crf-scar。(3)將aflp標(biāo)記afrf8轉(zhuǎn)化成一個與rf基因緊密連鎖的共顯性caps標(biāo)記afrf8caps(1.8cm)。(4)在辣椒中存在部分可育(pr)現(xiàn)象，利用aflp-bsa方法開發(fā)出1個與pr基因連鎖的分子標(biāo)記pr-caps(1.8cm)，可用于部分育性材料的去除。(5)利用bsa分析法篩選得到pcr標(biāo)記s4181515，并證明其能用于候選育性材料的初篩。(6)利用aflp技術(shù)開發(fā)了3個與rf基因連鎖的標(biāo)記afrf1、afrf3和afrf4，并轉(zhuǎn)化為可用于pcr的標(biāo)記類型。(7)發(fā)現(xiàn)af208834標(biāo)記與rf基因連鎖，遺傳距離為20.8cm。(8)利用矮牽牛rf基因篩選辣椒bac文庫開發(fā)出連鎖標(biāo)記bac13t7scar(1.4cm)。(9)以甜椒為試材，利用srap分子標(biāo)記技術(shù)篩選得到一個與甜椒恢復(fù)基因相關(guān)的分子標(biāo)記，并成功地將此srap標(biāo)記轉(zhuǎn)化為簡單、穩(wěn)定的scar標(biāo)記。(10)利用36份已知基因型(rfrf或rfrf)的辣椒自交系對11對已報道的辣椒恢復(fù)基因連鎖標(biāo)記進(jìn)行適用性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)顯性標(biāo)記crf3s1s和crf-scar的適用性最廣，其準(zhǔn)確率分別為91.67％、88.89％；在6對共顯性標(biāo)記中carf-fl-m2的適用性最廣，其準(zhǔn)確率為80.56％。育種實(shí)際應(yīng)用中可以首先利用顯性標(biāo)記crf3s1s或者crf-scar對辣椒材料進(jìn)行初次鑒定，對其中含有rf基因的辣椒材料利用共顯性標(biāo)記carf-fl-m2再次進(jìn)行鑒定。(11)利用已報道的9個與辣椒恢復(fù)基因連鎖的標(biāo)記對加工型辣椒cms不育系83-3a、恢復(fù)系812、f1(83-3a×812)、f1'(f1×83-3b)與保持系83-3b回交群體進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)crf-scar、pr-caps和opp13-caps標(biāo)記與cms育性恢復(fù)基因rf緊密連鎖，但標(biāo)記crf-scar不需要酶切，通過pcr產(chǎn)物電泳就能鑒定加工型辣椒材料中是否含有恢復(fù)基因，且對回交群體辣椒育性鑒定準(zhǔn)確度可以達(dá)到100％。

隨著辣椒基因組參考序列數(shù)據(jù)庫的公布，為開發(fā)辣椒恢復(fù)基因分子標(biāo)記和圖位克隆辣椒恢復(fù)基因提供了便利。盡管已經(jīng)有如此多的分子標(biāo)記被公開，但是目前尚未發(fā)現(xiàn)與辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供的一種與辣椒不育恢復(fù)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記、方法及應(yīng)用，可以有效鑒定辣椒材料中的細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種與辣椒不育恢復(fù)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記為scd06-17，包括seqidno.1所示的核苷酸序列和seqidno.2所示的核苷酸序列。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種利用上述分子標(biāo)記與辣椒不育恢復(fù)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的方法，包括以下步驟：

s1，提取待檢測辣椒材料的基因組dna；

s2，pcr擴(kuò)增：

a.反應(yīng)體系：10μl體系，各組分物質(zhì)的含量分別為:1μl基因組dna、0.5μl上游引物、0.5μl下游引物、5μl2×taqmastermix、ddh2o補(bǔ)齊10μl，混勻；

其中，上游引物的序列如seqidno.3所示，下游引物的序列如seqidno.4所示；

b.擴(kuò)增程序：

94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s；55℃退火45s；72℃延伸30s；35個循環(huán)；72℃延伸10min；最后4℃保存；

s3，電泳

聚丙烯酰胺電泳；

s4，銀染和顯影

電泳結(jié)束后，將凝膠片進(jìn)行銀染和顯影，并進(jìn)行觀察；

s5，結(jié)果判定

若電泳圖中可觀察到342bp的條帶，則說明該待測辣椒材料含有細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因；若電泳圖中不可觀察到342bp的條帶，只能觀察到321bp的條帶，則說明該待測辣椒材料不含有細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因。

優(yōu)選的，上述鑒定辣椒雄性不育恢復(fù)基因的方法，所述基因組dna的濃度為30ng/μl，上游引物和下游引物的濃度均為10μmol/l。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種上述與辣椒不育恢復(fù)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記在辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)材料的分子標(biāo)記輔助選育中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種上述鑒定辣椒雄性不育恢復(fù)基因的方法在辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)材料的分子標(biāo)記輔助選育中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供一種與辣椒不育恢復(fù)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記、鑒定方法及應(yīng)用，具有以下有益效果：

本發(fā)明在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開發(fā)了與辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記scd06-17，并在不同遺傳背景的分離群體中驗(yàn)證了該分子標(biāo)記scd06-17的有效性，鑒定成功率在90％以上，結(jié)果穩(wěn)定可靠，且為共顯性分子標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了在辣椒苗期對辣椒材料是否含有細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因進(jìn)行鑒定，提高育種效率，加速育種進(jìn)程。相比較國內(nèi)外已公布的其它辣椒恢復(fù)基因分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記作為ssr共顯性分子標(biāo)記，可以同時檢測雜交后代的三種基因型，揭示顯隱性關(guān)系，不需要進(jìn)行酶切環(huán)節(jié)，直接利用pcr進(jìn)行大規(guī)模批量檢測，在辣椒三系雜交制種和恢復(fù)材料分子標(biāo)記輔助選擇育種上更加快速和便利，因此具有重要意義。這為利用分子標(biāo)記輔助選擇轉(zhuǎn)育辣椒恢復(fù)基因，為辣椒三系雜交制種奠定基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為32個辣椒材料的電泳結(jié)果；

圖2為32個辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的遺傳分離群體的電泳結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明的限制。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

本發(fā)明提供的一種與辣椒不育恢復(fù)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記為scd06-17，包括seqidno.1所示的核苷酸序列和seqidno.2所示的核苷酸序列。

所述分子標(biāo)記scd06-17是由seqidno.3所示的上游引物(scd06-17f)序列和seqidno.4所示的下游引物(scd06-17r)序列擴(kuò)增的到的，其中在含有細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的辣椒材料中可擴(kuò)增的到一條342bp的特異性片段，而在不含細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的辣椒材料無法擴(kuò)增到。

上述分子標(biāo)記scd06-17的獲得方法：

首先，對目前應(yīng)用比較廣泛、準(zhǔn)確度較高的辣椒恢復(fù)基因分子標(biāo)記在獲得其序列后，對辣椒參考基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast檢索發(fā)現(xiàn)，這些標(biāo)記都位于辣椒的第六號染色體上，隨后合成了已公布的辣椒chr06染色體遺傳圖譜上的引物(https://vegmarks.nivot.affrc.go.jp/)，鑒定與辣椒cms恢復(fù)基因連鎖的分子標(biāo)記；并構(gòu)建了由384株組成的三系雜交種新科8號f2群體。田間表型鑒定發(fā)現(xiàn)，384株f2后代中，雄性不育株93株，可育株291株，卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可育對不育的比例符合3:1的孟德爾遺傳規(guī)律，說明辣椒雄性不育恢復(fù)基因?yàn)橐粚︼@性基因控制。在辣椒恢復(fù)基因初步定位的基礎(chǔ)上，利用辣椒品種遵辣2號的參考基因組序列開發(fā)更多的ssr分子標(biāo)記用于辣椒恢復(fù)基因的定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ssr引物scd06-17f/scd06-17r與辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因緊密連鎖，可以用于辣椒恢復(fù)材料的分子標(biāo)記鑒定和選擇。

由于該分子標(biāo)記scd06-17為共顯性分子標(biāo)記，可以提取植株少量dna后直接進(jìn)行pcr擴(kuò)增，再對pcr產(chǎn)物進(jìn)行page膠檢測，不但操作方便、實(shí)驗(yàn)成本低，而且還能得到辣椒單株準(zhǔn)確的基因型，進(jìn)而有效地加快辣椒恢復(fù)系的篩選進(jìn)程。

下面提供一種利用上述分子標(biāo)記scd06-17鑒定待測辣椒材料是否含有細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的方法，包括以下步驟：

s1，采用ctab法提取待檢測辣椒材料的基因組dna。

s2，pcr擴(kuò)增：

a.反應(yīng)體系：10μl體系，各組分物質(zhì)的含量分別為:1μl基因組dna、0.5μl上游引物(scd06-17f)、0.5μl下游引物(scd06-17r)、5μl2×taqmastermix、ddh2o補(bǔ)齊10μl，混勻；

其中，上游引物(scd06-17f)的序列如seqidno.3所示，下游引物(scd06-17r)的序列如seqidno.4所示；

其中基因組dna是待檢測辣椒材料的基因組dna，濃度為30ng/μl，上游引物和下游引物的濃度均為10μmol/l。

b.擴(kuò)增程序：

94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s；55℃退火45s；72℃延伸30s；35個循環(huán)；72℃延伸10min；最后4℃保存；

s3.電泳

用小垂直板進(jìn)行聚丙烯酰胺(page膠)電泳，膠濃度9％，2-10v/cm電壓，電泳1h；

s4.銀染和顯影

電泳結(jié)束后，將凝膠片進(jìn)行銀染和顯影，并進(jìn)行觀察，具體為：

電泳結(jié)束后，將兩塊玻璃板剝開，將凝膠片置于到1000ml固定液中(純酒精100ml+900ml蒸餾水+5ml冰乙酸)并在搖床上輕輕晃動10min。固定結(jié)束之后，迅速將凝膠放入1000ml銀染液(1000ml蒸餾水+2g硝酸銀)中于搖床上染色10min。染色結(jié)束之后，將凝膠置于1000ml顯影液中(3ml的甲醛+9g的naoh+1000ml蒸餾水)，放于搖床上輕輕搖晃，直至條帶清晰。倒掉顯影液，用蒸餾水小心將凝膠水洗2-3次即可；

在觀片燈下讀帶，將讀帶結(jié)果輸入電腦保存，并對膠片拍照保存；

s5，結(jié)果判定

若電泳圖中可觀察到342bp的條帶，則說明該待測辣椒材料含有細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因；若電泳圖中不可觀察到342bp的條帶，只能觀察到321bp的條帶，則說明該待測辣椒材料不含有細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因。

我們利用本發(fā)明所述的分子標(biāo)記scd06-17和相應(yīng)的上、下游引物scd06-17f/r鑒定32個辣椒材料是否含有細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因，pcr產(chǎn)物的電泳圖如圖1所示，圖1中m泳道為marker，其他泳道均為辣椒材料，其中，1、3、5、15、16、17、18、20、21、22、25、26、27、31號樣品均可檢測到342bp的條帶，其含有細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因；而其余樣品檢測不到342bp的條帶，只能檢測到321bp的條帶，其不含有細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因。

另外，我們利用本發(fā)明所述的分子標(biāo)記scd06-17和相應(yīng)的上、下游引物scd06-17f/r對32個辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的遺傳分離群體進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2所示，圖2中m泳道為marker，其他泳道均為辣椒材料，17、19、23、24樣品檢測到321bp的條帶，18、25、29、30檢測到342bp的條帶，其余樣品同時檢測到321bp和342bp兩個條帶，表明scd06-17作為一個共顯性分子標(biāo)記，與細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因緊密連鎖。

需要說明的是，為了防止贅述，本發(fā)明的描述了優(yōu)選的實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。

序列表

<120>與辣椒不育恢復(fù)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記、方法及應(yīng)用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>321

<212>dna

<213>辣椒

<400>1

tcaacacaagcagaatcacaacaaacacaagtataaagttggcgcccatacactaactgg60

tgcataaaataaaggaacccatcacggcgtccaataccaccaatgattacacctaaggaa120

ataataataataataataataataataataataataataataataataataataatacaa180

ctattacaccatcaatgtgtccaaatctcatcattatttgaccatattccacttttatca240

tcgatcgggaattttaaccaaatttcattaggtaccaatatcaaccatataaacaagtcc300

atactattaccatcattagcc321

<210>2

<211>342

<212>dna

<213>辣椒

<400>2

tcaacacaagcagaatcacaacaaacacaagtataaagttggcgcccatacactaactgg60

tgcataaaataaaggaacccatcacggcgtccaataccaccaatgattacacctaaggaa120

ataataataataataataataataataataataataataataataataataataataata180

ataataataataataatacaactatttcaccatcaatgtgtccaaatctcatcattattt240

gaccatattccacttttatcatcgatcgggaattttaaccaaatttcattaggtaccaat300

atcaaccatataaacaagtccatactattaccatcattagcc342

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tcaacacaagcagaatcacaac22

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ggctaatgatggtaatagtatggac25