本發(fā)明涉及一種基因工程菌及其表達(dá)方法和用途，具體地說(shuō)是一種表達(dá)耐熱型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌及其構(gòu)建方法和用途。

背景技術(shù)：

右旋糖苷(dextran)，又名葡聚糖，是蔗糖經(jīng)腸膜狀明串珠菌發(fā)酵后生成的高分子葡萄糖聚合物，主要由葡萄糖基α(1-6)苷鍵連接而成。因其具有安全、無(wú)毒、生物相容性好等多種優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、色譜分析等多個(gè)領(lǐng)域。右旋糖酐及其衍生物被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工等眾多行業(yè)，市場(chǎng)需求巨大(全球每年的需求近幾百億美金)。由明串珠菌發(fā)酵的右旋糖酐70是目前公認(rèn)的優(yōu)良血漿替代品，由面包酵母發(fā)酵的右旋糖酐可作為食品添加劑改善食品的口感。1941年，hehree.j.首次報(bào)道出以蔗糖為底物無(wú)細(xì)胞合成右旋糖酐，在那之后不久，合成這一反應(yīng)的酶被命名為右旋糖酐蔗糖酶。

右旋糖酐蔗糖酶(dextransucase,ec2.4.5.1)是一種分泌型葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，屬于糖苷水解酶70家族(gh70)，是葡聚糖蔗糖酶領(lǐng)域中研究較早較熱門的一類酶?？梢詫⒄崽欠肿又械膁-葡萄糖基轉(zhuǎn)移到受體分子上，催化程度的差異性可以合成右旋糖酐和低聚糖，同時(shí)伴有果糖的生成。通過(guò)右旋糖苷蔗糖酶的催化來(lái)生產(chǎn)右旋糖酐。右旋糖酐蔗糖酶的產(chǎn)生菌多為腸膜狀明串珠菌和鏈球菌，根據(jù)碳水活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)carbohydrate-activeenzymesdatabase(cazy；http://www.cazy.org)分類統(tǒng)計(jì)，到2017年為止gh70家族已發(fā)現(xiàn)了343種菌，其中94株右旋糖酐蔗糖酶表達(dá)菌株為腸膜狀明串珠菌，193株為鏈球菌屬，33株為乳桿菌，22株為魏斯氏菌，一株為酒球菌。目前右旋糖酐蔗糖酶合成的葡聚糖及其衍生物在食品、健康醫(yī)療、材料等領(lǐng)域都有了廣泛的應(yīng)用。

現(xiàn)有的右旋糖酐蔗糖酶熱穩(wěn)定性較差。其較低的溫度適應(yīng)性及在逆境下活性降低的性質(zhì)低限制了它在食品、醫(yī)藥行業(yè)、工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。通常高穩(wěn)定性被認(rèn)為是一個(gè)經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)可以降低酶的消耗和補(bǔ)償速率。此外，更穩(wěn)定的酶可能對(duì)反應(yīng)速率、工藝溫度有積極的影響。獲取活性高、熱穩(wěn)定性高的右旋糖酐蔗糖酶，對(duì)于提高產(chǎn)品品質(zhì)、獲得很好的工業(yè)應(yīng)用潛力、實(shí)現(xiàn)該酶的諸多應(yīng)用具有重要的意義。因此，利用分子生物學(xué)技術(shù)獲得新型的耐熱、高穩(wěn)定性且酶活高的的右旋糖酐蔗糖酶酶源是目前研究熱點(diǎn)之一。目前，對(duì)于不同來(lái)源菌的葡聚糖蔗糖酶在國(guó)內(nèi)外均有研究，在定點(diǎn)突變改造及引入二硫鍵提高其某些性質(zhì)獲得新型的葡聚糖蔗糖酶均有部分文獻(xiàn)報(bào)道，關(guān)于該酶的分子改造及耐熱機(jī)制的研究也越來(lái)越受到關(guān)注。

蛋白質(zhì)工程已經(jīng)成為一個(gè)重要的工具來(lái)改善右旋糖酐蔗糖酶的熱穩(wěn)定性使其更適用于工業(yè)生產(chǎn)。本發(fā)明的目標(biāo)就是通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的原始右旋糖酐蔗糖酶進(jìn)行定點(diǎn)突變的蛋白質(zhì)分子改造，篩選得到一種產(chǎn)酶活力較高、耐熱性及穩(wěn)定性較好的重組右旋糖酐蔗糖酶菌株，為其在食品工業(yè)及醫(yī)藥工業(yè)的潛在應(yīng)用做準(zhǔn)備。

通過(guò)使用基因工程改造手段提高右旋糖酐蔗糖酶的熱穩(wěn)定性將成為以后國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)和解決問(wèn)題的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種表達(dá)耐熱型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌及其構(gòu)建方法和用途，為右旋糖酐的工業(yè)生產(chǎn)提供更節(jié)約的生產(chǎn)條件。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)基因工程的手段構(gòu)建能耐熱、酶活高的表達(dá)右旋糖苷蔗糖酶(dextransμcrase)的基因工程菌株，并通過(guò)誘導(dǎo)制備該酶用于較高溫右旋糖酐的生產(chǎn)。

本發(fā)明表達(dá)耐熱型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌，具有耐高溫表達(dá)右旋糖苷蔗糖酶且酶活較高的特性。

本發(fā)明基因工程菌由含pet28a(+)/dex-yg基因的重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)定點(diǎn)突變得到雙突變體p473s/p856s后在宿主菌中轉(zhuǎn)化而得，并經(jīng)過(guò)卡那霉素抗性篩選和測(cè)序驗(yàn)證。所述宿主菌為e.colibl21(de3)，購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司。所述重組表達(dá)質(zhì)粒是用dex-yg基因插入到載體pet28a(+)中構(gòu)建而成，載體pet28a(+)購(gòu)自novagen公司。所述dex-yg基因是以腸膜狀明串珠菌基因組為模板，運(yùn)用pcr擴(kuò)增技術(shù)克隆得到的。發(fā)明人已成功完成了dex-yg基因的克隆、重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、雙位點(diǎn)的定點(diǎn)突變和測(cè)序工作。

本發(fā)明表達(dá)耐熱型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌，是將由克隆得到的dex-yg基因插入到表達(dá)載體pet28a(+)中得到的重組表達(dá)質(zhì)粒pet28a(+)/dex-yg作為模板，并經(jīng)過(guò)473位和856位雙位點(diǎn)的定點(diǎn)突變，篩選后得到耐熱、酶活高的雙突變體p473s/p856s，于宿主菌e.colibl21(de3)中轉(zhuǎn)化得到的重組工程菌dex-yg-thmu01。

本發(fā)明涉及保藏菌株為表達(dá)耐熱型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌dex-yg-thmu01，保藏信息如下：

分類命名：耐熱型重組右旋糖苷蔗糖酶大腸桿菌bl21(de3)

保藏日期：2016年5月12日

保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心

保藏編號(hào)：cgmccno.12438。

保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。

本發(fā)明表達(dá)耐熱型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌的構(gòu)建方法，包括引物設(shè)計(jì)、構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒、基因工程定點(diǎn)突變和宿主菌轉(zhuǎn)化。

所述引物設(shè)計(jì)是根據(jù)克隆得到的dex-yg基因序列及載體pet28a(+)的序列特征，借助primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物如下:

正向引物：5’cgcggatccatgccatttacagaaaaagt3’，(包含一個(gè)bamhⅰ位點(diǎn))；

反向引物：5’cccaagcttttatgctgacacagcattt3’，(包含一個(gè)hindⅲ位點(diǎn))。

所述構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒是以克隆得到的dex-yg基因?yàn)槟０?，利用pcr擴(kuò)增技術(shù)，得到含bamhⅰ和hindⅲ酶切位點(diǎn)的克隆產(chǎn)品，將所述克隆產(chǎn)品用bamhⅰ和hindⅲ雙酶切，酶切產(chǎn)品連接到載體pet28a(+)的雙酶切位點(diǎn)上，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pet28a(+)/dex-yg。

所述基因工程定點(diǎn)突變是以重組表達(dá)質(zhì)粒pet28a(+)/dex-yg為模板，先將473位的脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸，得到單突變體p473s，并提取其質(zhì)粒作為模板，再將856位的脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸，得到雙突變體p473s/p856s質(zhì)粒，雙突變體的引物設(shè)計(jì)如下：

p473s正向引物：5’aacagtccactgacatctgatgcta3’

p473s反向引物：5’atgtcagtggactgttgacataagt3’；

p856s正向引物：5’actgatgaaaatgcatctgtggcgtac3’

p856s反向引物：5’atgcattttcatcagtatcataata3’。

所述宿主菌轉(zhuǎn)化是將雙突變體p473s/p856s質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到e.colibl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)卡那霉素抗性篩選和酶切驗(yàn)證后，獲得表達(dá)耐熱型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌dex-yg-thmu01。

本發(fā)明表達(dá)耐熱型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌的用途，是由所述基因工程菌發(fā)酵制備得到的耐熱型右旋糖苷蔗糖酶在以蔗糖為底物制備右旋糖酐中的應(yīng)用。

由本發(fā)明表達(dá)耐熱型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌制備耐熱型右旋糖苷蔗糖酶的方法，包括接種、培養(yǎng)、誘導(dǎo)、破碎和分離各單元過(guò)程，包括如下步驟：

將基因工程菌dex-yg-thmu01接種到含卡那霉素50μg/ml的50mllb培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速250r/min、37℃下培養(yǎng)16-19h，吸取2ml培養(yǎng)菌液加入至200mla培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速250r/min、37℃下培養(yǎng)至菌濃度od600達(dá)到0.20-0.25時(shí)加入濃度為1mmol/ml的iptg誘導(dǎo)劑，25-30℃下發(fā)酵誘導(dǎo)4-5h，離心分離得到菌體，向菌體中加入ph值為5.2-5.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液，超聲破碎，離心分離，上清液即為粗酶液，酶活達(dá)300-420u/ml。所述a培養(yǎng)基中含有5g/l甘油、5g/l葡萄糖、0.1mmol/lmgso4·h2o、10g/l蛋白胨、10g/l硝酸鉀、17.105g/lna2hpo4·12h2o、3g/lkh2po4以及1g/lnh4cl。

酶活測(cè)定方法采用dns還原糖法。具體方法為：取200μl適當(dāng)稀釋的酶液，加入0.02mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液(ph5.4)2.8ml，再加入蔗糖0.3g，振蕩，于25℃水浴1h，吸取500μl反應(yīng)液加入對(duì)應(yīng)試管中，于沸水中煮沸5min，立即冷卻后加入5ml水，同時(shí)以失活的酶液為對(duì)照，在520nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(od)，在25℃下，1ml底物反應(yīng)液中每小時(shí)催化底物蔗糖產(chǎn)生0.1mg果糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(u)。

應(yīng)用上述制備的右旋糖苷蔗糖酶粗酶液水解合成右旋糖酐，包括如下步驟：

酶反應(yīng)體系配制：蔗糖20g，緩沖液160ml(ph5.4，5mmol/l的乙酸-乙酸鈣)。

按1.5u/ml的比例加入右旋糖酐蔗糖酶粗酶液，將上述混合液在30℃下攪拌反應(yīng)24-28小時(shí)，將催化后的反應(yīng)液進(jìn)行過(guò)濾、微濾、醇沉洗滌、真空干燥即可得到右旋糖酐。

本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)耐熱型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌dex-yg-thmu01，具有耐熱且酶活高的特性，為其更好的應(yīng)用于右旋糖酐的工業(yè)生產(chǎn)提供了一定的基礎(chǔ)，耐熱且酶活高的特性使其可以更好的節(jié)約生產(chǎn)資本。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明制備的右旋糖苷蔗糖酶合成右旋糖酐催化原理示意圖。

圖2為本發(fā)明制備的右旋糖苷蔗糖酶與的最適反應(yīng)溫度。從圖2中可以看出，當(dāng)反應(yīng)溫度為50℃時(shí)，野生酶已經(jīng)失活，而本發(fā)明制備的右旋糖苷蔗糖酶依然有30％的酶活力，說(shuō)明該酶較野生酶在較高溫度下的熱穩(wěn)定性增強(qiáng)。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明：

實(shí)施例1：重組表達(dá)質(zhì)粒pet28a(+)/dex-yg的構(gòu)建

根據(jù)克隆得到的右旋糖苷蔗糖酶基因(dexyg)序列，按照表達(dá)載體pet28a(+)的序列特征,借助primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物如下：

正向引物：5’cgcggatccatgccatttacagaaaaagt3’，(包含一個(gè)bamhⅰ位點(diǎn))；

反向引物：5’cccaagcttttatgctgacacagcattt3’，(包含一個(gè)hindⅲ位點(diǎn))。

以已經(jīng)克隆得到的右旋糖苷蔗糖酶基因(dexyg)為模板，利用pcr擴(kuò)增技術(shù)，得到含bamhⅰ和hindⅲ酶切位點(diǎn)的基因克隆產(chǎn)品，pcr產(chǎn)品回收程序如下：

1、切取瓊脂糖凝膠中的目的dna條帶，放入干凈的離心管中稱重，如凝膠重100mg，可視為100μl(100mg≈100μl)。

2、加入三倍體積溶液gsb，于55℃水浴融膠10min，間隔(2-3min)混合，確保膠塊完全融化，當(dāng)膠完全融化后，觀察溶液的顏色，此時(shí)溶液應(yīng)呈現(xiàn)為黃色。

3、待融化的融膠溶液降至室溫(高溫時(shí)離心柱結(jié)合dna的能力弱)，加入離心柱中靜置1min，10000g離心1min，棄流出液。

4、加入650μl溶液wb，10000g離心1min，棄流出液。

5、10000g離心1-2min，去除殘留的wb。

6、將離心柱置于于一干凈的離心管中，開蓋靜置1min，使殘留的乙醇揮發(fā)干凈，12000×g離心lmin，在柱的中央加入30～50μl事先預(yù)熱至60～70℃的eb，室溫靜置1min。

7、10000g離心1min，洗脫dna。此時(shí)，洗脫液含有bamhⅰ和hindⅲ酶切位點(diǎn)的基因克隆產(chǎn)品，可直接用于酶切反應(yīng)。

構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pet28a(+)/dex-yg：將上述洗脫液(克隆產(chǎn)品)用bamhⅰ和hindⅲ酶切，酶切產(chǎn)品連接到pet28a(+)的雙酶切位點(diǎn)上，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pet28a(+)/dex-yg。表達(dá)載體與酶切產(chǎn)物連接體系：表達(dá)載體pet28a(+)3μl、目的基因2μl、10×t4dna連接酶1μl、bμffer2.5μl，補(bǔ)ddh2o至25μl，16℃連接過(guò)夜。

實(shí)施例2：表達(dá)耐熱型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌dex-yg-thmu01的構(gòu)建

將重組表達(dá)質(zhì)粒pet28a(+)/dex-yg轉(zhuǎn)化到e.colibl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)卡那霉素抗性篩選和酶切驗(yàn)證后，獲得右旋糖苷蔗糖酶工程菌e.colibl21(de3)/pet28a(+)/dex-yg。提取其質(zhì)粒作為模板，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行定點(diǎn)突變，先將473位的脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸，得到單突變體p473s，并提取其質(zhì)粒作為模板，再將856位的脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸，得到雙突變體p473s/p856s，將其轉(zhuǎn)化到e.colibl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)卡那霉素抗性篩選后，得到表達(dá)耐熱型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌dex-yg-thmu01，雙突變體的引物設(shè)計(jì)如下：

p473s正向引物：5’aacagtccactgacatctgatgcta3’；

p473s反向引物：5’atgtcagtggactgttgacataagt3’；

p856s正向引物：5’actgatgaaaatgcatctgtggcgtac3’；

p856s反向引物：5’atgcattttcatcagtatcataata3’；

大腸桿菌e.colibl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自于北京全式金生物有限公司。

大腸桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化流程如下:

1、把感受態(tài)置于冰中融化。

2、把100μl感受態(tài)細(xì)胞移至滅菌處理的1.5ml離心管中。

3、加入20μl膠回收的pcr產(chǎn)物(即實(shí)施例1步驟7得到的膠回收產(chǎn)物，膠回收產(chǎn)物含有酶切位點(diǎn))，用槍頭輕輕混勻。

4、冰浴30min。

5、42℃水浴熱處理90sec。(準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，此時(shí)不能搖動(dòng)轉(zhuǎn)化管)

6、立即置于冰上2～3min。

7、加入37℃預(yù)溫的lb液體培養(yǎng)基500μl混勻。

8、37℃、200r/min震蕩培養(yǎng)lh。

9、將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布于含有50μg/ml卡那霉素的瓊脂平板表面，37℃恒溫箱培養(yǎng)過(guò)夜(16-19小時(shí))。挑陽(yáng)性菌落，酶切驗(yàn)證后獲得基因工程菌e.colibl21(de3)/pet28a(+)/dex-yg或dex-yg-thmu01。

實(shí)施例3：耐熱型重組工程菌dex-yg-thmu01右旋糖苷蔗糖酶的表達(dá)

將重組工程菌株dex-yg-thmu01接種到接種到含50μg/ml卡那霉素的液體lb培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16-18小時(shí)，轉(zhuǎn)接至液體a培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，當(dāng)稀釋10倍后的od600達(dá)到0.25時(shí)加入1mmol/mliptg進(jìn)行誘導(dǎo)，每1h取樣1次，共取樣5次，對(duì)所取樣品做sds-page電泳分析。其中第4-5h酶量較多，所表達(dá)出的右旋糖配蔗糖酶蛋白分子量與預(yù)測(cè)值一致(約170kda)。

實(shí)施例4：耐熱型重組工程菌dex-yg-thmu01產(chǎn)酶發(fā)酵

將基因工程菌dex-yg-thmu01接種到含有40～60μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速250r/min，35-40℃培養(yǎng)，培養(yǎng)16-19小時(shí)，從上述種子培養(yǎng)液中吸取2ml菌液加入至a培養(yǎng)基(優(yōu)化后培養(yǎng)基，包括甘油、葡萄糖、蛋白胨、硝酸鉀等)中，放置于37℃下，240-260r/min(回轉(zhuǎn)式)搖床培養(yǎng)。當(dāng)富集培養(yǎng)的菌液用蒸餾水稀釋10倍后的od600在0.25時(shí)(約3.5h之后)即可加入500μliptg開始誘導(dǎo)產(chǎn)酶，在25℃，250-260r/min(回轉(zhuǎn)式)搖床誘導(dǎo)。將誘導(dǎo)發(fā)酵后的菌懸液在0℃下，6000r/min離心12-15min，一支離心管對(duì)應(yīng)一瓶菌懸液，然后加入適量的蒸餾水振蕩清洗，再次離心。向每支離心管中加入20ml的乙酸-乙酸鈣緩沖液震蕩搖勻，外加冰水浴，超聲破碎15min，離心分離，上清液即為粗酶液，酶活300-420u/ml。

實(shí)施例5：右旋糖酐產(chǎn)品轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

利用上述右旋糖酐蔗糖酶粗酶液水解合成右旋糖酐，具體步驟為：

1、酶反應(yīng)體系配制：蔗糖20g，緩沖液160ml(ph5.4，5mmol/l的乙酸-乙酸鈣緩沖液)。

2、按1.5u/ml的比例加入右旋糖酐蔗糖酶粗酶液。

3、將上述混合液在30℃下攪拌反應(yīng)24-28小時(shí)，催化后的反應(yīng)液進(jìn)行過(guò)濾、微濾、醇沉洗滌、真空干燥即可得到右旋糖酐。