本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種糞腸球菌及其制備方法。

背景技術(shù)：

糞腸球菌(enterococcusfaecalis)菌形圓或橢圓，可順鏈的方向延長(zhǎng)，直徑0.5-1.0微米，大多數(shù)成雙或短鏈狀排列，通常不運(yùn)動(dòng)。糞腸球菌(e.faecalis)是革蘭氏陽性，過氧化氫陰性球菌，是人和動(dòng)物腸道內(nèi)主要菌群之一，其能產(chǎn)生天然抗生素，有利于機(jī)體健康；同時(shí)還能產(chǎn)生細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，抑制大腸桿菌和沙門氏菌等病原菌的生長(zhǎng)，改善腸道微環(huán)境；還能抑制腸道內(nèi)產(chǎn)尿素酶細(xì)菌和腐敗菌的繁殖，減少腸道尿素酶和內(nèi)毒素的含量，使血液中氨和內(nèi)毒素的含量下降。另外，糞腸球菌為消化道內(nèi)正常存在的一類微生物，在腸黏膜具有較強(qiáng)的耐受和定植能力，并且是一種兼性厭氧的乳酸菌，適合于生產(chǎn)和應(yīng)用，是一種很好的飼用微生物，在水產(chǎn)，畜禽上的應(yīng)用廣泛。

但是，現(xiàn)有的糞腸球菌制品的發(fā)酵方法所制備的糞腸球菌制品隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，其活菌數(shù)也降低明顯，不耐保存。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種糞腸球菌制品的制備方法，該制備方法所制備的糞腸球菌制品活菌數(shù)含量高、存放時(shí)間久。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種糞腸球菌制品，其由上述的制備方法制備得到，其具有活菌數(shù)含量高、存放時(shí)間久等特點(diǎn)。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種糞腸球菌制品的制備方法，其包括：

將活化的糞腸球菌種子液接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，置于35-37℃條件下，培養(yǎng)36-48h；

其中，固體發(fā)酵培養(yǎng)基按重量份計(jì)包括：麩皮6.5-7.5份、豆粕2-4份、沸石粉1.5-2.5份、水14-16份、碳酸鈣0.1-0.2份以及磷酸氫二鉀0.05-0.1份。

一種糞腸球菌制品，其通過上述的糞腸球菌制品的制備方法所制備而成。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供的糞腸球菌制品的制備方法，采用包括有麩皮6.5-7.5份、豆粕2-4份、沸石粉1.5-2.5份、水14-16份、碳酸鈣0.1-0.2份以及磷酸氫二鉀0.05-0.1份的固體發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)糞腸球菌種子液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)后的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)干燥、粉碎后即可糞腸球菌制品，該制備方法采用固體發(fā)酵工藝，固體發(fā)酵培養(yǎng)基的組分配比進(jìn)行合理科學(xué)地搭配，確保所制備得到糞腸球菌制品單位活菌含量高、可經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間存放，保存半年后活菌數(shù)仍可達(dá)80億cfu/g。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的一種糞腸球菌及其制備方法進(jìn)行具體說明。

一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種糞腸球菌制品的制備方法，其包括：

將活化的糞腸球菌種子液接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，置于35-37℃條件下，培養(yǎng)36-48h；

其中，固體發(fā)酵培養(yǎng)基按重量份計(jì)包括：麩皮6.5-7.5份、豆粕2-4份、沸石粉1.5-2.5份、水14-16份、碳酸鈣0.1-0.2份以及磷酸氫二鉀0.05-0.1份。

采用上述配比的固體發(fā)酵培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)均衡，菌體生長(zhǎng)所需的碳源，氮源都很充足，沸石粉的多孔性結(jié)構(gòu)能夠作為載體提高菌體存活率，同時(shí)，沸石粉成本較低，可以降低生產(chǎn)成本。此水分比例為菌體生長(zhǎng)提供了足夠的自由水，水的活性aw較高，利于菌體生長(zhǎng)繁殖。碳酸鈣和磷酸氫二鉀均能夠調(diào)節(jié)ph，利于菌體繁殖。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，上述制備方法還包括：干燥發(fā)酵產(chǎn)物至含水量為8％-10％。在該水分含量范圍內(nèi)最利于菌種保存。此時(shí)菌體不至于烘干過度脫水而亡，也不至于產(chǎn)品水分過高影響品質(zhì)。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在35℃～40℃條件下，采用循環(huán)風(fēng)干燥上述發(fā)酵產(chǎn)物。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在烘干后，上述制備方法還包括：粉碎烘干后的上述發(fā)酵產(chǎn)物。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述發(fā)酵產(chǎn)物粉碎至40-60目。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述糞腸球菌種子液按1.8-2.2％的接種量接種至上述固體發(fā)酵培養(yǎng)基。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在發(fā)酵培養(yǎng)前，上述制備方法還包括：活化步驟；

活化菌種是為了是菌種處于生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)時(shí)期，此時(shí)菌體代謝活性最強(qiáng)，生長(zhǎng)旺盛，代時(shí)最短，菌體數(shù)量呈對(duì)數(shù)增加。菌體個(gè)體形態(tài)、化學(xué)組成和生理特性等均較一致，代謝旺盛、生長(zhǎng)迅速、代時(shí)穩(wěn)定，轉(zhuǎn)接后能最快適應(yīng)新的環(huán)境，并增殖生長(zhǎng)。

該活化步驟包括：

將糞腸球菌菌種接種至固體mrs培養(yǎng)基中，置于35-37℃條件下培養(yǎng)24-36h，挑取單菌落轉(zhuǎn)入液體mrs培養(yǎng)基中，置于35-37℃條件下培養(yǎng)10-16h，得到一級(jí)種子液；

將上述一級(jí)種子液按1.8-2.2％的接種量接種至液體mrs培養(yǎng)基中，置于35-37℃條件下培養(yǎng)8-12h，得到上述活化的糞腸球菌種子液。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述液體mrs培養(yǎng)基的配方按1l計(jì)含有：蛋白胨9.8-10.2g、酵母粉3.8-4.2g、牛肉膏7.8-8.2g、葡萄糖18-22g、磷酸氫二鉀1.8-2.2g、七水硫酸鎂0.55-0.61g、無水硫酸錳0.018-0.022g、檸檬酸氫二胺1.8-2.2g以及無水乙酸鈉4.8-5.2g，ph6.2-6.6。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述固體mrs培養(yǎng)基的配方按1l計(jì)含有：蛋白胨9.8-10.2g、酵母粉3.8-4.2g、牛肉膏7.8-8.2g、葡萄糖18-22g、磷酸氫二鉀1.8-2.2g、七水硫酸鎂0.55-0.61g、無水硫酸錳0.018-0.022g、檸檬酸氫二胺1.8-2.2g、無水乙酸鈉4.8-5.2g以及瓊脂9-11g，ph6.2-6.6。

另一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種糞腸球菌制品，其由上述的制備方法所制備而成。

本發(fā)明提供的制備方法采用固體發(fā)酵工藝進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，固體發(fā)酵培養(yǎng)基的組分配比進(jìn)行合理科學(xué)地搭配，確保所制備得到糞腸球菌制品單位活菌含量高、可經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間存放。

例如，采用本發(fā)明實(shí)施例提供的糞腸球菌制品的制備方法在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，檢測(cè)到的活菌數(shù)有80-120億cfu/g，40℃烘干后，糞腸球菌的活菌數(shù)可達(dá)285-375億cfu/g，粉碎后的活菌數(shù)在130-165億cfu/g；

此外，本發(fā)明提供的糞腸球菌制品在陰涼干燥的地方保存半年后活菌數(shù)仍可達(dá)到80億cfu/g以上，而現(xiàn)有的液體發(fā)酵制得的糞腸球菌初始值120億cfu/g，保存半年后剩余的活菌數(shù)不到1億cfu/g。

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供的糞腸球菌制品的制備方法包括如下步驟：

1.活化菌種

(1)將糞腸球菌菌種(enterococcusfaecalis，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物農(nóng)藥與國家工程中心保存)在無菌條件下接種于固體mrs培養(yǎng)基中，置于37℃條件下培養(yǎng)36h，挑取單菌落轉(zhuǎn)入裝置2/3體積的液體mrs培養(yǎng)基的30ml玻璃瓶中，置于37℃條件下培養(yǎng)16h，得到一級(jí)種子液。

(2)將一級(jí)種子液按2％的接種量接種至液體mrs培養(yǎng)基中，置于37℃條件下培養(yǎng)12h，得到二級(jí)種子液，作為活化的糞腸球菌種子液，備用。

其中，1l的固體mrs培養(yǎng)基通過如下方法制備：

取蛋白胨10g、酵母粉4g、牛肉膏8g、葡萄糖20g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸鎂0.58g、無水硫酸錳0.02g、檸檬酸氫二胺2g、無水乙酸鈉5g以及瓊脂10g，用蒸餾水定容至1l，調(diào)ph至6.2-6.6；121℃滅菌20min，冷卻后即可。

1l的固體mrs培養(yǎng)基通過如下方法制備：取蛋白胨10g、酵母粉4g、牛肉膏8g、葡萄糖20g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸鎂0.58g、無水硫酸錳0.02g、檸檬酸氫二胺2g以及無水乙酸鈉5g，用蒸餾水定容至1l，調(diào)ph至6.5；121℃滅菌20min。

2.固體發(fā)酵培養(yǎng)

將活化的糞腸球菌種子液(即二級(jí)種子液)按2％的接種量接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，置于37℃條件下，培48h，得發(fā)酵產(chǎn)物，備用，并檢測(cè)其活菌數(shù)，結(jié)果為120億cfu/g。

其中，固體發(fā)酵培養(yǎng)基通過以下方法制備得到：取麩皮7kg、豆粕3kg、沸石粉2kg、水15kg、碳酸鈣0.1kg以及磷酸氫二鉀0.05kg，混合后，于121℃滅菌20min。

3.干燥

發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵產(chǎn)物35℃～40℃條件下，采用循環(huán)風(fēng)將發(fā)酵產(chǎn)物烘干至含水量為9％，得到干燥的發(fā)酵產(chǎn)物，備用，并檢測(cè)其活菌數(shù)，結(jié)果為75億cfu/g。

4.粉碎

將烘干后的發(fā)酵產(chǎn)物粉碎至40目，即得糞腸球菌制品，檢測(cè)其活菌數(shù)，結(jié)果為165億cfu/g。

本實(shí)施例還提供了采用上述方法制備得到的糞腸球菌制品。

本實(shí)施例提供的糞腸球菌制品的制備方法操作簡(jiǎn)單、原料少且容易獲取，成本低，該制備方法采用固體發(fā)酵工藝，通過將活化的糞腸球菌種子液經(jīng)過固體發(fā)酵、烘干、粉碎步驟后，即可制得成品的糞腸球菌制品，所制備的糞腸球菌制品活菌含量高，存放時(shí)間久。

實(shí)施例2

不同存放時(shí)間后，實(shí)施例1提供的糞腸球菌制品活菌數(shù)含量檢測(cè)。

檢測(cè)方法：待測(cè)樣品依次10倍梯度稀釋，直至合適的稀釋倍數(shù)，向添加好菌液的滅菌平板中注入約15ml固體mrs培養(yǎng)基(溫度控制在45℃左右)，震蕩平板，使培養(yǎng)基與菌液充分混勻，培養(yǎng)基凝固后倒置培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)。

取步驟4得到的糞腸球菌制品以及買的市面上液體發(fā)酵制得的某糞腸球菌制品，置于在陰涼干燥的地方保存半年后檢測(cè)其活菌數(shù)含量。結(jié)果見表1。

表1實(shí)施例1提供的糞腸球菌制品保存半年后的活菌數(shù)含量

由表1數(shù)據(jù)可看出，經(jīng)過半年的存放時(shí)間后，本發(fā)明實(shí)施例1提供的糞腸球菌制品的活菌數(shù)含量明顯高于普通的糞腸球菌制品，且本實(shí)施例提供的糞腸球菌制品的活菌數(shù)的降低比例(46.67％)明顯低于普通的糞腸球菌制品(99.17％)，由此表明，本發(fā)明實(shí)施例提供的糞腸球菌制品更耐存放，可長(zhǎng)時(shí)間存放。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供的糞腸球菌制品的制備方法與實(shí)施例1基本相同，不同的是：本實(shí)施例中在發(fā)酵培養(yǎng)的步驟所用的固體發(fā)酵培養(yǎng)基的組分用量與實(shí)施例1不同。

在本實(shí)施例中，所用的固體發(fā)酵培養(yǎng)基通過以下方法制備得到：取麩皮6.5kg、豆粕2kg、沸石粉1.5kg、水14kg、碳酸鈣0.1kg以及磷酸氫二鉀0.05kg，混合后，于121℃滅菌20min。

本實(shí)施例提供的糞腸球菌制品的制備方法的效果與實(shí)施例1相同。

實(shí)施例4

本實(shí)施例提供的糞腸球菌制品的制備方法與實(shí)施例1基本相同，不同的是：本實(shí)施例中在發(fā)酵培養(yǎng)的步驟中所用的固體發(fā)酵培養(yǎng)基的組分用量與實(shí)施例1不同。

在本實(shí)施例中，所用的固體發(fā)酵培養(yǎng)基通過以下方法制備得到：取麩皮7.5kg、豆粕4kg、沸石粉2.5kg、水16kg、碳酸鈣0.2kg以及磷酸氫二鉀0.1kg，混合后，于121℃滅菌20min。

本實(shí)施例提供的糞腸球菌制品的制備方法的效果與實(shí)施例1相同。

實(shí)施例5

本實(shí)施例提供的糞腸球菌制品的制備方法與實(shí)施例1基本相同，不同的是：本實(shí)施例中在干燥的步驟中，發(fā)酵產(chǎn)物在35℃條件下采用循環(huán)風(fēng)進(jìn)行烘干至發(fā)酵產(chǎn)物含水量為10％。

本實(shí)施例提供的糞腸球菌制品的制備方法的效果與實(shí)施例1相同。

實(shí)施例6

本實(shí)施例提供的糞腸球菌制品的制備方法與實(shí)施例1基本相同，不同的是：本實(shí)施例中在干燥的步驟中，發(fā)酵產(chǎn)物在35℃條件下采用循環(huán)風(fēng)進(jìn)行烘干至發(fā)酵產(chǎn)物含水量為8％。

本實(shí)施例提供的糞腸球菌制品的制備方法的效果與實(shí)施例1相同。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。