本發(fā)明屬于高分子納米載體領(lǐng)域，特別涉及一種主客體自組裝作用構(gòu)建表面氨基的核-殼超結(jié)構(gòu)樹狀大分子的方法。

背景技術(shù)：

基因治療是指通過一定的方式把外源治療基因?qū)氲桨屑?xì)胞，以糾正或者補(bǔ)償因基因缺陷與異常所引起的疾病，進(jìn)而達(dá)到治療疾病的目的?；蛑委熥鳛橐环N革命性的治療手段，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于遺傳病、腫瘤和病毒性疾病的治療當(dāng)中，并且取得了一定的成效，已成為生命科學(xué)和臨床科學(xué)領(lǐng)域中最熱門的研究課題之一。

構(gòu)建安全高效的基因傳遞載體是基因治療所面臨的最大挑戰(zhàn)。聚酰胺-胺(pamam)樹狀大分子由于其表面豐富的氨基，良好的單分散性和穩(wěn)定性，作為基因傳遞的優(yōu)良載體受到了廣泛的研究。研究表明，聚酰胺-胺(pamam)樹狀大分子的轉(zhuǎn)染效率主要取決于樹狀大分子的代數(shù)，代數(shù)越高，轉(zhuǎn)染效率越高(baker,etal.proc.natl.acad.sci.u.s.a.,1996,93,4897-4902.)。然而，用傳統(tǒng)的方法合成更高代的、結(jié)構(gòu)更精確的樹狀大分子時(shí)，要重復(fù)的合成步驟太多，反應(yīng)控制困難(pamamg9樹狀大分子，尺寸10nm，需要18步反應(yīng))。因此需找到一種簡易、快速、可控的合成方法獲得具有更高基因轉(zhuǎn)染效率的高代聚酰胺-胺樹狀大分子。有人使用表面氨基的較高代樹狀大分子做核，表面羧基的較低代樹狀大分子做殼，通過edc催化羧基與氨基的反應(yīng)，構(gòu)建核殼結(jié)構(gòu)的樹狀大分子(uppuluri,etal.adv.mater.,2000,12(11):796-800.)。但這種方法構(gòu)建的表面羧基的樹狀大分子無法作為基因載體負(fù)載基因。

基于超分子化學(xué)中的主-客體分子識(shí)別作用是構(gòu)建超分子結(jié)構(gòu)的常用方法。由于超分子化學(xué)中作為主體分子的β-環(huán)糊精與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且高度疏水的客體分子金剛烷有較高的結(jié)合常數(shù)，因此利用金剛烷與環(huán)糊精的主客體作用構(gòu)建超分子結(jié)構(gòu)得到了廣泛應(yīng)用。檢索國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)和專利結(jié)果表明：利用超分子化學(xué)中的主客體自組裝作用構(gòu)建核殼超結(jié)構(gòu)樹狀大分子用于基因轉(zhuǎn)染的方法，尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種主客體自組裝作用構(gòu)建表面氨基的核-殼超結(jié)構(gòu)樹狀大分子的方法，該方法以聚酰胺-胺(pamam)樹狀大分子為反應(yīng)單元，利用主客體自組裝作用構(gòu)建表面氨基的核-殼超結(jié)構(gòu)樹狀大分子，該方法具有易操作，轉(zhuǎn)染條件簡單，轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn)，在基因治療方面有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的一種主客體自組裝作用構(gòu)建表面氨基的核-殼超結(jié)構(gòu)樹狀大分子的方法，包括：

(1)在溶有1-金剛烷乙酸ada-cooh的dmso溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二亞胺鹽酸鹽edc、n-羥基琥珀酸亞胺nhs，攪拌反應(yīng)3～5h，得到活化的ada-cooh；然后將活化的ada-cooh加入到溶有第三代聚酰胺-胺樹狀大分子(g3)的dmso溶液中，攪拌反應(yīng)3～4天，得到客體分子金剛烷修飾的g3-ad溶液；

(2)在dmso溶液中分別加入β-環(huán)糊精β-cd和n,n’-羰基二咪唑cdi，然后將二者混合，攪拌反應(yīng)6-7h，得到反應(yīng)液；將第五代聚酰胺-胺樹狀大分子(g5)溶解在dmso中，然后滴加到反應(yīng)液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)60-70h，得到主體分子β-環(huán)糊精修飾的g5-β-cd溶液；

(3)將步驟(1)、(2)所得的溶液透析，然后進(jìn)行冷凍干燥處理，得到干燥的g3-ad、g5-β-cd，記為m1、m2；

(4)將步驟(3)得到的干燥的g3-ad、g5-β-cd按摩爾比1:10分別溶入超純水中，混合攪拌反應(yīng)24～28h，通過自組裝作用得到表面氨基的核-殼超結(jié)構(gòu)樹狀大分子g5-β-cd/ad-g3溶液；最后進(jìn)行透析、冷凍干燥，得到g5-β-cd/ad-g3，記為m3。

所述步驟(1)中的edc/nhs與ada-cooh的摩爾比為10:1；ada-cooh與g3的摩爾比為1.5:1。

所述步驟(2)中的β-cd與cdi的摩爾比為1:10；β-cd與g5的摩爾比為24:1。

所述步驟(2)中的g5的dmso溶液濃度為0.5mg/ml。

所述步驟(3)中的透析具體為：g3-ad溶液以截留分子量為1000da的透析袋透析；g5-β-cd溶液以截留分子量為8000-14000da的透析袋透析。

所述步驟(4)中的g3-ad的超純水溶液的濃度為4mg/ml；g5-β-cd的超純水溶液的濃度為2mg/ml。

所述步驟(4)中的透析具體為：以截留分子量為10000da的透析袋透析。

基因轉(zhuǎn)染效率的評(píng)價(jià)方法包括如下步驟：

(1)取m1、m2、m3，分別用超純、無菌水配制成2mg/ml溶液，按照合適的n/p比，與相同量的質(zhì)粒dna(pdna)混合，輕微振蕩混合均勻，并置于37℃下孵育20-30min，得到不同n/p比的載體/pdna納米復(fù)合物；其中n/p比為材料的伯氨基與pdna骨架上磷酸基團(tuán)摩爾比，數(shù)值范圍為0.125-60:1；

(2)將hela細(xì)胞種于24孔板中，37℃、5％co2下過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿到整個(gè)孔板的70％-80％時(shí)，更換成無血清培養(yǎng)基，分別加入步驟(1)所得的三種載體/pdna納米復(fù)合物，混合均勻，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6h，然后將培養(yǎng)基換成有血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，評(píng)價(jià)每一種載體/pdna納米復(fù)合物的基因轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞時(shí)選取的n/p分別為20:1，40:1，60:1。

本發(fā)明旨在通過β-環(huán)糊精修飾的第五代樹狀大分子作核，金剛烷修飾的第三代樹狀大分子做殼，利用主客體分子的自組裝作用構(gòu)建表面氨基的核殼超結(jié)構(gòu)樹狀大分子，進(jìn)而作為基因載體，實(shí)現(xiàn)高效率的基因轉(zhuǎn)染。進(jìn)行主客體分子自組裝時(shí)，根據(jù)主客體分子的個(gè)數(shù)，控制g5-β-cd與g3-ad的投料摩爾比為1:10，使得g5-β-cd上的環(huán)糊精都能與g3-ad上的金剛烷結(jié)合，構(gòu)成超分子結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明基于β-環(huán)糊精與金剛烷的主客體相互作用，構(gòu)建由不同代數(shù)聚酰胺-胺樹狀大分子構(gòu)成的核殼超結(jié)構(gòu)樹狀大分子，得到類似于高代樹狀大分子的聚集體，并用于基因轉(zhuǎn)染應(yīng)用的研究。由于β-環(huán)糊精與金剛烷間較高的結(jié)合常數(shù)，使得構(gòu)建的超分子結(jié)構(gòu)具有良好的穩(wěn)定性，有利于與基因形成復(fù)合物，提高基因轉(zhuǎn)染效率。另外，β-環(huán)糊精是一類生物相容性較好的分子，修飾在樹狀大分子上以后可以提高載體的生物相容性，降低細(xì)胞毒性，從而提高基因轉(zhuǎn)染效率。本發(fā)明不僅為快速合成高代聚酰胺-胺樹狀大分子提供了一個(gè)新方法，同時(shí)也為提高基因轉(zhuǎn)染效率提供了新思路。

本發(fā)明通過核磁共振(¹h-nmr)對(duì)修飾在樹狀大分子上的β-cd(主體分子)和ada(客體分子)的數(shù)量進(jìn)行了表征；二維核磁(2d-noesy)對(duì)通過主客體相互作用構(gòu)建的核殼超分子樹狀大分子進(jìn)行表征；透射電子顯微鏡(tem)、原子力顯微鏡(afm)對(duì)主客體單元以及構(gòu)建的超分子結(jié)構(gòu)復(fù)合物的表面形貌和尺寸大小進(jìn)行了表征；凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)對(duì)載體負(fù)載pdna的能力進(jìn)行了表征；通過水動(dòng)力學(xué)直徑對(duì)核殼超分子樹狀大分子/pdna納米復(fù)合物的粒徑進(jìn)行了表征分析；通過cck-8分析測(cè)試載體對(duì)細(xì)胞的毒性；通過熒光素酶基因(luc)、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(egfp)的轉(zhuǎn)染對(duì)載體的基因轉(zhuǎn)染能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)；通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)載體負(fù)載pdna的基因轉(zhuǎn)染能力進(jìn)行研究；通過共聚焦顯微鏡對(duì)載體負(fù)載pdna后在細(xì)胞內(nèi)的定位進(jìn)行觀察。

有益效果

(1)本發(fā)明制備的核殼超結(jié)構(gòu)樹狀大分子表面具有豐富氨基，具有良好的基因轉(zhuǎn)染效果，為構(gòu)建安全高效的基因載體，用于基因治療提供了應(yīng)用前景；

(2)本發(fā)明反應(yīng)條件簡單，合成制備易操作，轉(zhuǎn)染條件簡單，轉(zhuǎn)染效率高，在癌癥的基因治療等方面具有潛在的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明制備的m1(a)和m2(b)的核磁共振氫譜圖；

圖2為本發(fā)明制備的m3的2d-noesy譜圖；

圖3為本發(fā)明制備的m1(a)，m2(b)和m3(c)的原子力顯微鏡(afm)圖；

圖4為本發(fā)明制備的m3的透射電子顯微鏡(tem)圖；

圖5為本發(fā)明制備的m1(a)，m2(b)和m3(c)的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳圖譜；

圖6為本發(fā)明制備的m3在不同n/p比條件下與pdna形成的復(fù)合物粒徑大小圖；

圖7為本發(fā)明制備的m1，m2和m3在不同濃度下的對(duì)hela細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)圖；

圖8為本發(fā)明制備的m1，m2和m3在不同n/p比下對(duì)hela細(xì)胞的熒光素酶基因轉(zhuǎn)染效率圖；

圖9為本發(fā)明制備的m1，m2和m3在不同n/p比下對(duì)hela細(xì)胞的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染的熒光顯微鏡圖；

圖10為本發(fā)明制備的m1，m2和m3在n/p＝60下，與cy3標(biāo)記的pdna所形成的復(fù)合物被hela細(xì)胞內(nèi)吞的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果圖；

圖11為本發(fā)明制備的m1，m2和m3在n/p＝60下，與cy3標(biāo)記的pdna所形成的復(fù)合物被hela細(xì)胞內(nèi)吞入細(xì)胞的胞內(nèi)定位的激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果圖；

圖12為本發(fā)明的工藝流程示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實(shí)施例1

稱取1-金剛烷乙酸(ada-cooh)2.11mg，溶于5mldmso。稱取20.81mgedc和12.49mgnhs，分別溶于2mldmso中，先后將edc溶液和dmso溶液滴加到ada-cooh溶液中，攪拌反應(yīng)3h，得到活化的ada-cooh溶液。稱取第三代聚酰胺-胺樹狀大分子(g3)50mg，溶于5mldmso中。然后將上述經(jīng)活化的ada-cooh溶液逐滴加入到g3溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)3天。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移到截留分子量為1000da的透析袋中，于磷酸鹽(pbs)緩沖液中透析1天后，更換為超純水透析2天。最后經(jīng)冷凍干燥得到淡黃色粉末狀產(chǎn)物g3-ad(m1)，儲(chǔ)存于-20℃。

稱取21.82mgβ-cd和31.17mgcdi分別溶于5mldmso中，兩者混合攪拌反應(yīng)6h。稱取第五代聚酰胺-胺樹狀大分子(g5)溶于30mldmso中，然后將其緩慢滴加到上述溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)60h。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至截留分子量為8000-14000da的透析袋中，于磷酸鹽(pbs)緩沖液中透析1天后，更換為超純水透析2天。最后經(jīng)冷凍干燥得到白色絮狀產(chǎn)物g5-β-cd(m2)，儲(chǔ)存于-20℃。

稱取干燥的m120mg，m210mg，分別溶于5ml超純水中，然后將兩者混合，室溫下攪拌反應(yīng)24小時(shí)，待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至截留分子量為10000da的透析袋中，于超純水中透析3天。最后經(jīng)冷凍干燥得到白色粉末狀產(chǎn)物g5-β-cd/ad-g3(m3)，儲(chǔ)存于-20℃。

實(shí)施例2

對(duì)實(shí)施例1制備的m1、m2、m3進(jìn)行表征。¹hnmr表征結(jié)果如圖1a所示，在化學(xué)位移1.6-1.9ppm處的質(zhì)子峰代表金剛烷基團(tuán)分子結(jié)構(gòu)中的質(zhì)子峰，化學(xué)位移2.2-3.4ppm處的質(zhì)子峰代表g3中酰胺鍵上的質(zhì)子峰，表明ada-cooh已成功修飾在g3表面。通過對(duì)這兩個(gè)區(qū)域中的質(zhì)子峰進(jìn)行積分得出每一個(gè)g3上面修飾了1.3個(gè)ada分子；¹hnmr表征結(jié)果如圖1b所示，在化學(xué)位移2.3-3.2ppm處的質(zhì)子峰代表g5中酰胺鍵上的質(zhì)子峰，在化學(xué)位移3.5-4.1ppm以及5.1ppm處的質(zhì)子峰代表β-cd分子結(jié)構(gòu)中的質(zhì)子峰，表明β-cd已成功修飾在g5表面。通過對(duì)g5和β-cd的質(zhì)子峰區(qū)域進(jìn)行積分，計(jì)算出每個(gè)g5表面修飾了8.7個(gè)β-cd分子。2d-noesy表征結(jié)構(gòu)如圖2所示?；瘜W(xué)位移1.6-1.9ppm處的金剛烷基團(tuán)與化學(xué)位移3.5-4.1ppm處β-cd基團(tuán)出現(xiàn)了明顯的相關(guān)交叉信號(hào)，由此可以說明金剛烷基團(tuán)與β-cd發(fā)生了相互作用，緊密結(jié)合。同時(shí)證明了主體單元g5-β-cd與客體單元g3-ad通過金剛烷與環(huán)糊精的主客體作用成功構(gòu)建出了表面氨基的核殼超結(jié)構(gòu)樹狀大分子g5-β-cd/ad-g3。afm結(jié)果如圖3所示，制備的m1、m2、m3形狀接近球形，m1的粒徑為3.1nm，m2的粒徑為5.2nm，m3的粒徑為8.4nm，由此可以進(jìn)一步證明m1和m2通過主客體的自組裝作用形成了粒徑更大的超分子結(jié)構(gòu)m3。tem結(jié)果如圖4所示，制備的m3平均粒徑在8nm左右，與afm結(jié)果相符。

實(shí)施例3

將實(shí)施例1所制備的3種材料m1、m2、m3以不同的n/p制備載體/pdna復(fù)合物，并進(jìn)行凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)。配制8孔含有溴化乙錠(1mg/ml)的1％的瓊脂糖凝膠，室溫放置待瓊脂糖凝膠凝固。n/p比值分別為：0.125:1，0.25:1，0.5:1，1:1，2:1，5:1。每孔加1μgpdna，配制載體/pdna復(fù)合物，37℃下孵育30min。以不加載體的單獨(dú)pdna作為對(duì)照。制成載體/pdna復(fù)合物后，將對(duì)應(yīng)的復(fù)合物分別加到瓊脂糖凝膠的孔中，在80v電壓下，電泳30min。電泳結(jié)束后將凝膠放置于凝膠成像儀中對(duì)pdna在凝膠中的遷移進(jìn)行分析。結(jié)果如圖5所示。三種材料均可在較低的n/p(n/p＝2)下與pdna很好復(fù)合，阻滯了pdna的遷移。同時(shí)可以看到m2和m3在n/p＝1時(shí)就表現(xiàn)出了對(duì)pdna遷移的阻滯，具有更強(qiáng)的dna壓縮能力。壓縮、包裹dna的能力是將pdna成功傳遞到靶細(xì)胞內(nèi)的前提。

實(shí)施例4

將實(shí)施例1所制備的m3在不同n/p比條件下(0，1，5，10，20，40，60)分別與5μgpdna制備成不同的載體/pdna復(fù)合物，使總體積為100μl，室溫下孵育30min，然后加入1mlpbs。通過馬爾文激光粒度儀(malvern,mk,633nm激光)對(duì)其水動(dòng)力學(xué)直徑進(jìn)行表征，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，在n/p＝10時(shí)載體/pdna復(fù)合物的粒徑達(dá)到最大，然后隨著n/p比的增加，復(fù)合物粒徑下降。當(dāng)n/p比為60時(shí)，復(fù)合物粒徑為227nm。當(dāng)復(fù)合物粒徑在200nm左右時(shí)有利于復(fù)合物通過細(xì)胞內(nèi)吞而進(jìn)入細(xì)胞，有益于基因轉(zhuǎn)染，因此選擇n/p比為20，40，60進(jìn)行后續(xù)基因轉(zhuǎn)染效率的評(píng)價(jià)。

實(shí)施例5

以hela細(xì)胞為模型細(xì)胞來評(píng)價(jià)實(shí)施例1所制備的3種材料的細(xì)胞毒性。以8000/孔的密度將hela細(xì)胞種于96孔板中，在添加了100u/ml青霉素，100u/ml鏈霉素和10％fbs的100μldmem培養(yǎng)液中，37℃，5％co2濃度下過夜培養(yǎng)。然后將培養(yǎng)基換成材料濃度分別為0nm、50nm、100nm、500nm、1000nm、2000nm、3000nm的含m1、m2、和m3/1μgpdna復(fù)合物的細(xì)胞培養(yǎng)基與細(xì)胞共培養(yǎng)24h，隨后加入含10μlcck-8的dmem培養(yǎng)基溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2h。隨后，在測(cè)試波長450nm下于多功能酶標(biāo)儀中測(cè)試吸光值，結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明，隨著材料濃度的增加，細(xì)胞存活率下降，但在一定范圍內(nèi)具有良好的細(xì)胞相容性。m1和m2通過自組裝后形成的m3較m1的細(xì)胞毒性有明顯的下降，這說明β-cd的修飾，以及超分子結(jié)構(gòu)的形成降低了材料的細(xì)胞毒性。

實(shí)施例6

以hela細(xì)胞作為模型細(xì)胞，選用帶有熒光素酶基因的質(zhì)粒作為pdna，以此作為模型評(píng)價(jià)實(shí)施例1制備的3種材料作為基因載體的基因轉(zhuǎn)染效率。以5x10⁴/孔的密度將hela細(xì)胞種于24孔板中，在添加了100u/ml青霉素，100u/ml鏈霉素和10％fbs的100μldmem培養(yǎng)液中，37℃，5％co2濃度下過夜培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿到整個(gè)孔板的70％-80％時(shí)，按照n/p值為20，40，60，制備載體/pdna復(fù)合物，其中每孔中pdna的量為1μg。將培養(yǎng)基換成不含fbs的dmem培養(yǎng)基，再加入上述復(fù)合物與細(xì)胞共培養(yǎng)4h。然后更換含10％fbs的新鮮dmem培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞裂解，并通過promega公司的luciferaseassay來檢測(cè)熒光素酶活性，結(jié)果如圖8所示。結(jié)果表明，通過主客體自組裝形成的超分子復(fù)合物m3在3種n/p下相比于自組裝之前的反應(yīng)單元均具有最高的基因轉(zhuǎn)染效率。其中，在n/p為60時(shí)m3的轉(zhuǎn)染效率是m2的20倍，是m1的170倍。這說明通過β-cd的修飾降低了細(xì)胞毒性，有利于基因的轉(zhuǎn)染。另外，超分子結(jié)構(gòu)的形成可能促進(jìn)了細(xì)胞對(duì)載體/pdna復(fù)合物的內(nèi)吞，從而提高了基因轉(zhuǎn)染效率。

實(shí)施例7

以hela細(xì)胞作為模型細(xì)胞，選用帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒作為pdna，以此作為模型評(píng)價(jià)實(shí)施例1制備的3種材料作為基因載體時(shí)的基因轉(zhuǎn)染效率。以5x10⁴/孔的密度將hela細(xì)胞種于24孔板中，在添加了100u/ml青霉素，100u/ml鏈霉素和10％fbs的100μldmem培養(yǎng)液中，37℃，5％co2濃度下過夜培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿到整個(gè)孔板的70％-80％時(shí)，按照n/p值為20、40、60，制備載體/pdna復(fù)合物，其中每孔中pdna的量為1μg。將培養(yǎng)基換成不含fbs的dmem培養(yǎng)基，再加入上述復(fù)合物與細(xì)胞共培養(yǎng)4h。然后更換含10％fbs的新鮮dmem培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，用熒光顯微鏡觀察，結(jié)果如圖9所示。結(jié)果表明，與熒光素酶基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，在不同n/p比下，主客體自組裝形成的超分子復(fù)合物m3在3種n/p下相比于主客體單元均具有最高的綠色熒光強(qiáng)度，即具有最高的基因轉(zhuǎn)染效率。

實(shí)施例8

以hela細(xì)胞作為模型細(xì)胞，選用帶有cy3標(biāo)記的pdna，以此為模型評(píng)價(jià)實(shí)施例1制備的3種材料作為基因載體時(shí)被細(xì)胞吞噬的效率。以1x10⁵/孔的密度將hela細(xì)胞種于12孔板中，在添加了100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素和10％fbs的100μldmem培養(yǎng)液中，37℃，5％co2濃度下過夜培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿到整個(gè)孔板的70％-80％時(shí)，按照n/p比為60制備載體/pdna復(fù)合物，其中每孔中pdna的量為1μg。將培養(yǎng)基換成不含fbs的dmem培養(yǎng)基，再加入上述復(fù)合物與細(xì)胞共培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，胰酶消化，并收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞對(duì)載體/pdna復(fù)合物的內(nèi)吞。結(jié)果如圖10所示。結(jié)果表明，對(duì)照和未加載體的pdna組都未檢測(cè)到明顯的熒光。主客體自組裝形成的超分子復(fù)合物m3相比于主客體單元具有最高的熒光強(qiáng)度，說明m3有更高細(xì)胞內(nèi)吞效率，這是其具有最高的基因轉(zhuǎn)染效率的重要原因之一。此結(jié)果與以上基因轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn)的結(jié)果保持一致。

實(shí)施例9

以hela細(xì)胞作為模型細(xì)胞，選用帶有cy3標(biāo)記的pdna，以此為模型評(píng)價(jià)實(shí)施例1制備的3種材料作為基因載體時(shí)被細(xì)胞吞噬后的胞內(nèi)定位。以1x10⁵/孔的密度將hela細(xì)胞種于12孔板中，在添加了100u/ml青霉素，100u/ml鏈霉素和10％fbs的100μldmem培養(yǎng)液中，37℃、5％co2濃度下過夜培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿到整個(gè)孔板的70％-80％時(shí)，按照n/p比為60制備載體/pdna復(fù)合物，其中每孔中pdna的量為1μg。將培養(yǎng)基換成不含fbs的dmem培養(yǎng)基，再加入上述復(fù)合物與細(xì)胞共培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，采用激光共聚焦顯微鏡對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察。結(jié)果如圖11所示。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染4小時(shí)后，各載體均能負(fù)載pdna進(jìn)入細(xì)胞，到達(dá)細(xì)胞核周圍。比較紅色熒光點(diǎn)的數(shù)量和強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，主客體自組裝形成的超分子復(fù)合物m3相比于主客體單元具有更強(qiáng)的紅色熒光，這進(jìn)一步印證了實(shí)施例8所得出的結(jié)果。