本發(fā)明屬于微生物領域，涉及一株釀酒酵母及其用于提高葡萄酒酯類物質(zhì)含量的用途。

背景技術(shù)：

葡萄酒是以鮮葡萄或葡萄汁為原料，經(jīng)酵母菌等發(fā)酵釀制而成的，酒精度不低于7.0％的酒精飲品。

葡萄酒是極具個性的飲品，不同產(chǎn)區(qū)的酒風格特征各不相同，這種差異性也正是葡萄酒的魅力所在。而目前我國的葡萄酒產(chǎn)品同質(zhì)化嚴重，很少有能夠代表產(chǎn)地特色的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品，其中最突出的就是香氣質(zhì)量差、缺乏產(chǎn)區(qū)特征，這也成為制約我國葡萄和葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一。

釀酒酵母作為葡萄酒發(fā)酵過程中的主導菌株，對葡萄酒品質(zhì)，特別是在其產(chǎn)地香氣特征的表現(xiàn)上起著決定性作用。其中由釀酒酵母代謝產(chǎn)生的酯類化合物是葡萄酒果香的主要來源，且不同的酯類物質(zhì)在香氣感知時相互之間具有累加效應，故在一定閾值范圍內(nèi)酯類化合物濃度的增加可以增強人們對葡萄酒果香的感知，進而提高葡萄酒的特征香氣。

因此，針對性地開展產(chǎn)地特色的增香型葡萄酒酵母菌種選育從根本上提升葡萄酒的香氣質(zhì)量，對提高我國葡萄酒產(chǎn)品的市場競爭力有著重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一株釀酒酵母，采用該菌株釀造葡萄酒，可以提高其中的酯類物質(zhì)含量，從而可以提高葡萄酒的品質(zhì)。

本發(fā)明用于提高葡萄酒酯類物質(zhì)含量的菌株為釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)sw1009，它屬于子囊菌亞門(ascomycota)、半子囊菌綱(hemiascomycetes)、酵母目(saccharomycetales)、酵母科(saccharomycetaceae)。該菌株已于2017年3月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏號為cgmccno.13440。

本發(fā)明提供的釀酒酵母菌株sw1009是在葡萄表皮篩選的1株耐受性較好，能產(chǎn)生較多酯類物質(zhì)的酵母菌，通過wl培養(yǎng)基聚類培養(yǎng)得到。在wl培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，四周乳白色，中間突出較大，略顯綠色，不透明，生長旺盛，菌落較大，在ypd固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，菌株呈現(xiàn)米白色，該菌株在ypd液體培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)時，6h即可啟動發(fā)酵，11h即可充滿倒立杜氏小管。

本發(fā)明還提供了采用釀酒酵母菌株sw1009發(fā)酵生產(chǎn)葡萄酒的方法，其特征是，

1)挑取釀酒酵母sw1009菌株接種于ypd液體培養(yǎng)基，26～30℃恒溫振蕩培養(yǎng)18～32小時，得到種子液；

2)然后將種子液接種于預冷的葡萄汁(預先冷至6～8℃)中(接種量為0.5×10⁶～3×10⁶cfu/ml)，于6～8℃下保持2-3天后，再對發(fā)酵醪液持續(xù)升溫至17～19℃；

3)將發(fā)酵醪液于17～19℃下恒溫發(fā)酵5～6天后，再將發(fā)酵醪液持續(xù)升溫至26～28℃，于該溫度下恒溫發(fā)酵直至發(fā)酵醪比重介于0.992-0.995之間時，發(fā)酵結(jié)束。

本發(fā)明還提供了該釀酒酵母菌株sw1009在提高酯類物質(zhì)含量方面的用途。

實驗證明，該釀酒酵母菌株sw1009具有發(fā)酵力強、耐受性好(酒精耐受性和二氧化硫耐受性)、酯類物質(zhì)含量高等優(yōu)勢。采用該菌株發(fā)酵赤霞珠葡萄生產(chǎn)葡萄酒，產(chǎn)酒精度為12.79％(v/v)，酯類物質(zhì)總量為19.77mg/l(相同條件下發(fā)酵的商業(yè)酵母71b和d254酵母分別產(chǎn)生15.68mg/l，17.00mg/l)，主要酯類化合物為乙酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和月桂酸乙酯，經(jīng)感官評價可給葡萄酒增加成熟漿果的香氣，因此它可以提高葡萄酒的品質(zhì)。同時本發(fā)明的發(fā)酵工藝簡單，對于葡萄酒生產(chǎn)廠家來說不需要另外添加新的設備，因此在葡萄酒行業(yè)上具有良好的應用前景。

附圖說明

圖1為菌株在wl培養(yǎng)基上的形態(tài)圖；

圖2為菌株發(fā)酵過程中酯類相關基因(atf1、faa1、eht1和iah1)表達量的變化趨勢圖；

圖3為菌株發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒的gc-ms離子流色譜圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發(fā)明技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍中。

實施例1：釀酒酵母菌株sw1009的分離和鑒定

1.葡萄表皮酵母菌富集

取約20g完整的葡萄(煙臺，赤霞珠葡萄)于100ml無菌水中，搖床170rpm室溫富集30min。

2.酵母菌的分離純化

將上述富集液體取1ml加入9ml無菌水中，進行梯度稀釋，分別稀釋到10^-1到10^-4不同濃度，吸取濃度梯度為10^-1到10^-4的菌液各0.1ml涂布于加入氯霉素(100mg/l)的wl培養(yǎng)基平板，28h培養(yǎng)7d，對平板菌落進行拍照，挑取不同形態(tài)特征單菌落接種于ypd固體培養(yǎng)基斜面，28h培養(yǎng)1d進行純化，4℃保存，并且進行測序。本發(fā)明中的酵母在wl培養(yǎng)基的形態(tài)特征見圖1。

3.高產(chǎn)酯釀酒酵母的初篩

將步驟1)所得到的菌株進行發(fā)酵力和耐受性(酒精耐受性和二氧化硫耐受性)試驗，釀酒酵母菌株sw1009的發(fā)酵力和耐受性結(jié)果見表1-2，將得到的耐受性較好的菌株，使用赤霞珠進行發(fā)酵試驗，進一步選取酯類含量較高的菌株進行鑒定。同時在實驗過程中選取富產(chǎn)酯的商品酵母菌株71b和工業(yè)生產(chǎn)中常用的商品酵母菌株d254為對照。

3.1菌株發(fā)酵力分析

取10mlypd液體培養(yǎng)基分裝于試管，放入倒置的杜氏發(fā)酵管(確保充滿液體培養(yǎng)基并無氣泡)，121℃滅菌20min。待培養(yǎng)基冷卻后，培養(yǎng)基中加入100mg/l的氯霉素，用竹簽挑取少許酵母菌體接入上述滅菌ypd液體培養(yǎng)基中，28℃靜置培養(yǎng)，每隔4h觀察一次，記錄酵母菌的起始發(fā)酵時間和氣體充滿杜氏管的時間。實驗結(jié)果見表1。

表1酵母菌株發(fā)酵力實驗結(jié)果

3.2菌株酒精耐受性分析

取10mlypd液體培養(yǎng)基分裝于試管，放入倒置的杜氏發(fā)酵管(確保充滿液體培養(yǎng)基并無氣泡)，121℃滅菌20min。待培養(yǎng)基冷卻后，在超凈工作臺中，用移液槍補加100mg/l的氯霉素，并且加入無水乙醇，使培養(yǎng)基中乙醇體積分數(shù)分別為12％(v/v)，用竹簽挑取少許酵母菌體接入上述滅菌ypd液體培養(yǎng)基中，28℃靜置培養(yǎng)7d，記錄酵母菌生長發(fā)育情況，將耐受12％(v/v)酒精度的酵母，繼續(xù)接種于14％(v/v)的ypd液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隨后依次進行16％(v/v)、18％(v/v)、20％(v/v)酵母菌耐受性分析。實驗結(jié)果見表2。

表2酵母菌株耐受性實驗結(jié)果

3.3菌株二氧化硫耐受性分析

取10mlypd液體培養(yǎng)基分裝于試管，放入倒置的杜氏發(fā)酵管(確保充滿液體培養(yǎng)基并無氣泡)，121℃滅菌20min。待培養(yǎng)基冷卻后，在超凈工作臺中，用移液槍補加100mg/l的氯霉素，并且加入偏重亞硫酸鉀水溶液(其濃度為50％的so2溶液)，使培養(yǎng)基中so2濃度為300mg/l，用竹簽挑取少許酵母菌體接入上述滅菌ypd液體培養(yǎng)基中，28℃靜置培養(yǎng)7d，記錄酵母菌生長發(fā)育情況，將耐受300mg/lso2的酵母，繼續(xù)接種于400mg/lso2的ypd液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隨后依次進行500mg/l和600mg/l酵母菌耐受性分析。實驗結(jié)果見表2。

將得到的耐受性較好的菌株，使用赤霞珠進行發(fā)酵試驗，進一步選取酯類含量較高的菌株sw1009進行鑒定。

4.菌株sw1009鑒定

4.1微生物學特性：在wl培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，四周乳白色，中間突出較大，略顯綠色，不透明，生長旺盛，菌落較大，在ypd固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，菌株呈現(xiàn)米白色。

4.2分子生物學鑒定

對菌株sw1009進行26s測序，得到以下結(jié)果(seqno.1)：gaggaaaagaaaccaaccgggattgccttagtaacggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttggagagggcaactttggggccgttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgaggagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgtgccctctgctccttgtgggtaggggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcaggataaatccataggaatgtagcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgcagcccgtct。

然后將其sw1009菌株26s序列與其他菌株進行比對，比對結(jié)果如表3所示。

表3sw1009菌株26s序列比對結(jié)果

從表3可以看出：本發(fā)明的sw1009菌株的26s序列，與genbank中的收錄的13株釀酒酵母saccharomycescerevisiae的相似度均為99％，且其微生物特性符合釀酒酵母種的描述。鑒于以上結(jié)果，將sw1009菌株鑒定為釀酒酵母saccharomycescerevisiae。該菌株已經(jīng)于2017年3月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏號為cgmccno.13440。

實施例2：

1.赤霞珠葡萄發(fā)酵試驗

1)配制ypd液體培養(yǎng)基，成分(g/l)：酵母膏(或酵母浸粉)10，蛋白胨20，葡萄糖20，其余為是水；ph6.5±0.2；將配制的ypd液體培養(yǎng)基分裝于100ml三角瓶，每瓶50ml，121℃滅菌20min。

2)挑取釀酒酵母sw1009菌株接種于ypd液體培養(yǎng)基，放置于恒溫培養(yǎng)振蕩器，28℃，170r/min培養(yǎng)24h，取100μl菌體懸浮液稀釋200倍，取稀釋液10μl于血球計數(shù)板，顯微鏡下計數(shù)，每個菌體計數(shù)三次。

3)計數(shù)結(jié)束后按照1×10⁶cfu/ml的接種量接種于破碎赤霞珠葡萄汁(商業(yè)酵母71b和d254按照說明書操作)，接種結(jié)束后放置于8℃下保持溫度2天，再對發(fā)酵醪液持續(xù)升溫至18℃，于18℃下恒溫發(fā)酵5天后，再將發(fā)酵醪液持續(xù)升溫至26℃，于該溫度下恒溫發(fā)酵。

發(fā)酵過程監(jiān)控發(fā)酵醪的比重，待發(fā)酵醪比重(相對于20℃的水的比重)介于0.992-0.995之間時，發(fā)酵結(jié)束。經(jīng)檢測，sw1009產(chǎn)酒精度為12.79％(v/v)，同樣的發(fā)酵條件下71b產(chǎn)酒精度12.5％(v/v)，d254產(chǎn)酒精度12.84％(v/v)。

2.赤霞珠葡萄酒香氣成分的采集

將上述發(fā)酵產(chǎn)生的香氣化合物使用ctc自動進樣器進行前處理，取8ml葡萄酒于20ml的頂空進樣瓶，頂空瓶中提前放入2g的氯化鈉，頂空瓶在agitator中預熱10min，后通過dvb/car/pdms萃取頭萃取50min，吸取香氣物質(zhì)，最后進去安捷倫7890b氣相色譜進樣口，解析10min。

3.gc-ms分析條件

采用5977a質(zhì)譜儀進行分析，不分流模式進樣，恒流模式，柱流量0.8ml/min，程序升溫，初始溫度40℃，以1℃min升到45℃，保持2min，以3℃/min升到84℃，保持2min，以3℃/min升到120℃，保持3min，以3℃/min升到200℃，以5℃/min升到230℃，運行時間71.667min，msd傳輸線250℃，質(zhì)譜選擇scan模式進行掃描。

赤霞珠葡萄酒的香味成分的gc-ms離子流色圖譜如圖3所示，赤霞珠葡萄酒的香味成分的分析結(jié)果見表4。它與商業(yè)酵母71b和d254的香氣成分含量比較見表5。

表4sw1009發(fā)酵赤霞珠葡萄酒酯類物質(zhì)

表5不同酵母發(fā)酵赤霞珠葡萄酒酯類物質(zhì)比較

從表1-2可以看出：相比現(xiàn)有的商用酵母71b和d254，本發(fā)明的釀酒酵母菌株sw1009的發(fā)酵力和二氧化硫耐受性略有提高；酒精耐受性提高明顯，比商用酵母71b提高6％，比商用酵母d254提高4％，提高幅度分別為42.8％和25％。

從表5可以看出：相比現(xiàn)有的商用酵母71b和d254，本發(fā)明的釀酒酵母菌株sw1009的酯類物質(zhì)成分的總含量提高明顯，比商用酵母71b提高4.09％，比商用酵母d254提高2.77％；提高幅度分別為26.08％和16.29％。從表5還可以看出：本發(fā)明的葡萄酒中共檢測出18種酯類物質(zhì)，主要酯類物質(zhì)成分為：乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯，癸酸乙酯和乙酸-2-苯乙酯。相比商用酵母71b和d254，本發(fā)明的釀酒酵母菌株sw1009釀造的葡萄酒的辛酸乙酯、己酸乙酯和乙酸-2-苯乙酯含量明顯提高，尤其是辛酸乙酯的含量較高，分別提高了3.8％和2.92％。辛酸乙酯有似白蘭地的香氣并有甜味，己酸乙酯是具有曲香、菠蘿香型的香氣，乙酸苯乙酯是一種帶有密甜底香的玫瑰香氣，三者對提高葡萄酒的香氣都有重要作用，因此本發(fā)明提高了葡萄酒的品質(zhì)。

4.發(fā)酵過程酯類相關基因相對表達量分析乙酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和月桂酸乙酯。

發(fā)酵過程中取樣，共取6個點，使用全式金公司試劑盒對釀酒酵母rna進行提取，并且進行cdna合成，以及熒光定量pcr分析，實驗結(jié)果見圖2。其中atf1編碼釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)中1種醇乙酰轉(zhuǎn)移酶(aatase)，此酶參與乙酸酯的生成；iah1是最終的酯酶基因，一個由ala85-cys86-ser87-ala88-gly89組成的假定活性位點序列，參與乙酸酯的水解；酵母中乙酯的形成通過乙醇o-?；D(zhuǎn)移酶催化，該酶主要由eht1和eeb1基因編碼；乙基酯生物合成受其前體物質(zhì)中鏈脂肪酸(mcfas)濃度的直接影響，同時也受長鏈脂肪酸酰基coa的濃度調(diào)控，faa1基因編碼?；鵦oa合成酶，調(diào)控長鏈?；鵦oa的合成。由圖2可以看出，發(fā)酵過程中，釀酒酵母菌株sw1009的4個與酯類相關的基因表達量處于較高的表達量狀態(tài)。

sequencelisting

<110>山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品研究所

<120>一株釀酒酵母及其用于提高葡萄酒酯類物質(zhì)含量的用途

<130>0

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>587

<212>dna

<213>釀酒酵母（saccharomycescerevisiae）sw1009的26s序列

<400>1

gaggaaaagaaaccaaccgggattgccttagtaacggcgagtgaagcggcaaaagctcaa60

atttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttggagagggcaactttggggcc120

gttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcga180

ggagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctcta240

agtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagta300

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aaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgtgccctctgctccttgtgggtaggg420

gaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcaggataaatccataggaatg480

tagcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgaggactg540

cgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgcagcccgtct587