本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種rhdv的亞單位疫苗。

背景技術(shù)：

兔出血癥(rabbithemorrhagicdisease,rhd)是由兔出血癥病毒(rabbithemorrhagicdiseasevirus,rhdv)引起的兔的一種急性、敗血性、高度接觸性傳染病,以致死性和全身實(shí)質(zhì)器官出血為主要特征。在家兔養(yǎng)殖業(yè)中，危害巨大。

病毒樣顆粒(viruslikeparticles，vlp)是含有病毒一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的空心顆粒，沒有病毒核酸(dna/rna)，不能自主復(fù)制，其在形態(tài)上與真正的病毒粒子相同或相似，可通過與病毒感染一樣的途徑呈遞給免疫細(xì)胞，有效地誘導(dǎo)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)。由于vlps沒有感染性，作為免疫原，它可通過和病毒感染一樣的途徑呈遞給免疫細(xì)胞，有效地誘導(dǎo)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)，而宿主、病毒和疫苗因素共同決定vlps產(chǎn)生的機(jī)體防護(hù)水平。

目前活病毒疫苗的缺陷就是一旦病毒活性恢復(fù)，安全性不能保證。同時(shí)，滅活病毒疫苗可因滅活過程不完全而導(dǎo)致安全性問題。但vlps疫苗沒有感染性，穩(wěn)定性好，不易失活，具有廣闊的發(fā)展前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種rhdv的亞單位疫苗及其應(yīng)用。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種基因工程細(xì)胞，所述基因工程細(xì)胞為真核細(xì)胞，并且所述細(xì)胞的基因組中整合有表達(dá)兔出血癥病毒vp60蛋白的表達(dá)盒；或者所述細(xì)胞中含有表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有表達(dá)所述兔出血癥病毒vp60蛋白的表達(dá)盒；

并且所述基因工程細(xì)胞在胞內(nèi)表達(dá)所述vp60蛋白，且所述vp60蛋白在所述基因工程細(xì)胞內(nèi)部形成病毒樣顆粒(vlp)。

在另一優(yōu)選例中，所述真核細(xì)胞為酵母細(xì)胞，優(yōu)選為畢赤酵母細(xì)胞。

在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)盒包括5'至3'可操作地連接的以下元件：啟動(dòng)子、起始密碼子、所述vp60蛋白的orf序列和終止密碼子。

在另一優(yōu)選例中，所述的起始密碼子和所述vp60蛋白的orf序列直接相連。

在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)盒不含有分泌表達(dá)元件。

在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)盒不含有分泌肽、引導(dǎo)肽、或信號肽。

在另一優(yōu)選例中，所述vp60蛋白的基因序列如seqidno.:1所示。

在另一優(yōu)選例中，所述表達(dá)載體以畢赤酵母ppicx載體為骨架。

本發(fā)明的第二方面，提供了一種病毒樣顆粒(vlp)，所述vlp由本發(fā)明第一方面所述的基因工程細(xì)胞表達(dá)。

本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括本發(fā)明第一方面所述的病毒樣顆粒，和藥學(xué)上可以接受的載體。

在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物包括疫苗組合物。

本發(fā)明的第四方面，提供了一種制備vlp的方法，包括步驟：

在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明第一方面所述的細(xì)胞，從而表達(dá)出本發(fā)明第二方面所述的病毒樣顆粒(vlp)；和

分離所述病毒樣顆粒(vlp)。

本發(fā)明的第五方面，提供了一種分離的經(jīng)密碼子優(yōu)化的多核苷酸，所述多核苷酸編碼seqidno.:2所示的多肽；并且所述多核苷酸選自下組：

(a)序列如seqidno.:1所示的多核苷酸；

(b)核苷酸序列與seqidno.:1所示序列的同源性≥95％(較佳地≥98％)的多核苷酸；

(c)如seqidno.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60個(gè)(較佳地1-30，更佳地1-10個(gè))核苷酸的多核苷酸；

(e)與(a)-(c)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。

本發(fā)明的第六方面，提供了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有本發(fā)明第五方面所述的多核苷酸。

本發(fā)明的第七方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有本發(fā)明第六方面所述的表達(dá)載體，或者在基因組中整合有本發(fā)明第五方面所述的多核苷酸。

本發(fā)明的第八方面，提供了一種藥物組合物，所述的組合物含有本發(fā)明第二方面所述的病毒樣顆粒(vlp)、本發(fā)明第五方面所述的多核苷酸或者本發(fā)明第六方面所述的表達(dá)載體或者本發(fā)明第七方面所述的宿主細(xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料。

在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物包括疫苗組合物。

在另一優(yōu)選例中，所述的疫苗組合物還含有佐劑。

在另一優(yōu)選例中，所述的佐劑包括氧化鋁、皂苷、quila、胞壁酰二肽、礦物油或植物油、基于囊泡的佐劑、非離子嵌段共聚物或deae葡聚糖、細(xì)胞因子(包括il-1、il-2、ifn-r、gm-csf、il-6、il-12、和cpg)。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了ppic3.5k-vp60表達(dá)載體的酶切鑒定。

圖2顯示了sds-page和westernblot檢測rhdvvp60蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)。

圖3顯示了電鏡負(fù)染實(shí)驗(yàn)觀察rhdv病毒顆粒。

圖4顯示了試驗(yàn)兔病理解剖結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，獲得一種制備兔出血癥病毒vlp顆粒的方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，根據(jù)本發(fā)明的方法能夠高效的制備兔出血癥病毒vlp顆粒。

在描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述的具體方法和實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)檫@類方法和條件可以變動(dòng)。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語其目的僅在于描述具體實(shí)施方案，并且不意圖是限制性的，本發(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求書限制。

除非另外定義，否則本文中所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語均具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。如本文所用，在提到具體列舉的數(shù)值中使用時(shí)，術(shù)語“約”意指該值可以從列舉的值變動(dòng)不多于1％。例如，如本文所用，表述“約100”包括99和101和之間的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

雖然在本發(fā)明的實(shí)施或測試中可以使用與本發(fā)明中所述相似或等價(jià)的任何方法和材料，本文在此處例舉優(yōu)選的方法和材料。

兔出血癥病毒(rabbithemorrhagicdiseasevirus,rhdv)

兔出血癥(rabbithemorrhagicdisease,rhd)是rhdv是杯狀病毒科成員,包含主要結(jié)構(gòu)蛋白vp60，vp60在動(dòng)物體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體,與免疫反應(yīng)直接相關(guān),是病毒免疫保護(hù)性抗原。

rhdvvp60的天然基因序列如下：

>gi|358409917|gb|jn165233.1|rabbithemorrhagicdiseasevirusisolatetc/china/2007vp60gene,partialcds

atggagggcaaagcccgcacagcgccgcaaggcgaagcagcaggcactgctaccacagcatcagttcccggaaccacgaccgacggcatggatcctggagtagtggccgcgactagtgtggtcactgcagaaaattcatccgcatcggttgcaacggcggggattggcggcccaccccaacaggtggaccaacaagaaacatggaggacaaacttttactacaatgatgttttcacttggtccgtcgcggatgcgcccggcagcattctctacactgtccaacactctccacagaacaacccattcacagccgtactgagccagatgtacgctggctgggctggtggcatgcagttccgcttcatagttgctggatcaggtgtgtttggtgggcgactggtcgcggctgtgataccaccaggcatcgagattggaccagggttggaggtcaggcaatttcctcatgtcgtcatcgacgcccgttcactcgaacctgttaccatcaccatgccagacttgcgtcccaacatgtaccatccaactggtgaccctggccttgtccccacactagtccttagtgtttacaacaacctcatcaacccgtttggtgggtccaccaacgcaatccaggtaacagtggaaacgaggccgagtgatgactttgagttcgtgatgattagagccccctccagcaaaactgttgactcaatctcacccgcaggcctcctcacgaccccagtcctcactggtgttggcaatgacaacaggtggaacggccaaatagtgggactgcaaccagtacctggggggttttccacgtgcaacaggcattggaacctgaacggcagcacgtatggctggtcaagccctcggtttgccgacattgaccatcgaagaggcagtgcaagttattctgggaacaactccaccaacgtgcttcagttttggtacgctaatgctgggtctgcaattgacaaccctatctcccaggttgcaccggacggcttccctgacatgtcattcgtgccctttaacagccccaacattccgaccgcggggtgggtcgggtttggtggtatttggaacagtaacaacggtgcccccgctgctacaactgtgcaggcctatgagttaggttttgccactggggcaccaaataacctccagcccaccaccaacacttcaggtgcacagactgtcgctaagtccatttatgccgtggtaaccggcacaaaccaaaatccaaccggactgtttgtgatggcctcgggtgttatctccaccccaaacgccagcgccgtcacatacacgccccaaccagacagaattgtgactacacccggcactcctgccgccgcacctgtgggtaagaacacacccatcatgttcgcgtctgttgtcaggcgcaccggtgacgtcaacgccgcagctgggtcaaccaacgggacccagtacggcacgggctcccaaccactgccagtaacaattggactttcgctcaacaactactcgtcagcactcatgcctgggcagtttttcgtttggcagttaacctttgcatctggtttcatggagattggcttaagtgtggacgggtacttttatgcaggaacaggagcctcaaccacgctcattgacttgactgaactcattgacgtacgccccgtgggaccccggccgtccaagagcacactcgtgttcaacctggggggcacaaccaatggcttttcttatgtctga(seqidno.3)

根據(jù)rhdvvp60蛋白的天然基因序列，本發(fā)明人經(jīng)過大量篩選獲得了適合在酵母中表達(dá)的編碼vp60蛋白多肽的優(yōu)化基因序列。

rhdvvp60的優(yōu)化基因序列如下：

>atggaaggaaaagccagaaccgctccacaaggtgaagctgccggaaccgctactaccgcctccgttcctggaactactaccgatggaatggacccaggagttgttgccgctacttccgttgttactgctgagaactcctctgcctctgttgctactgctggtatcggtggtcctccacagcaagttgatcaacaagaaacctggcgtaccaacttctactataacgacgttttcacttggtctgttgctgacgccccaggttctatcttgtacactgttcaacattctccacaaaacaacccattcaccgccgttttgtcccagatgtacgctggttgggctggtggtatgcagttcagattcattgttgccggttccggtgtcttcggtggtagattggtcgctgctgtcatcccacctggtattgagatcggtccaggtttggaggtccgtcaattcccacacgttgttatcgacgcccgttctttggagccagttaccatcactatgccagatttgagacctaacatgtaccacccaactggtgatcctggtcttgtccctactttggttttgtctgtttacaacaatttgatcaacccatttggtggttccaccaacgctattcaggttaccgtcgagaccagaccatccgacgacttcgagtttgtcatgatccgtgctccatcctccaagactgttgactccatctccccagctggtttgttgactactccagtcttgaccggtgtcggaaacgacaaccgttggaacggtcagattgtcggtttgcaacctgtccctggaggtttctctacctgcaaccgtcactggaacttgaacggttccacttacggttggtcctctccaagattcgccgatatcgaccacagaagaggttccgcctcttactccggaaataactccaccaacgtcttgcagttctggtacgccaacgccggttctgccatcgacaacccaatttcccaagttgccccagacggtttcccagatatgtcttttgttccattcaactctcctaacatcccaactgccggttgggttggtttcggtggtatctggaactccaacaacggtgctcctgctgccaccactgtccaggcttacgaacttggtttcgccaccggtgctcctaacaacttgcagccaactactaacacttccggtgctcagaccgttgccaaatccatctacgctgttgtcaccggtaccaatcagaacccaaccggtttgtttgttatggcttccggagtcatctccactcctaacgcctctgctgttacctacaccccacagcctgacagaattgtcactaccccaggaactcctgctgccgctccagttggaaagaacactcctatcatgttcgcctccgtcgttcgtagaaccggtgacgttaacgctgccgctggttccactaacggtacccaatacggtaccggttctcagccattgccagtcaccattggtttgtctttgaataactattcctctgccttgatgccaggtcagttctttgtctggcagttgaccttcgcttccggattcatggagatcggtttgtctgttgatggatacttttacgccggtaccggtgcctctaccactcttatcgatcttaccgaattgatcgatgtccgtccagttggtcctagaccttccaagtccaccttggtcttcaacttgggaggtactaccaatggtttttcttacgtttaa(seqidno.1)

天然vp60蛋白多肽的氨基酸序列如下：

>gi|358409918|gb|aeu09705.1|vp60,partial[rabbithemorrhagicdiseasevirus]

megkartapqgeaagtattasvpgtttdgmdpgvvaatsvvtaenssasvatagiggppqqvdqqetwrtnfyyndvftwsvadapgsilytvqhspqnnpftavlsqmyagwaggmqfrfivagsgvfggrlvaavippgieigpglevrqfphvvidarslepvtitmpdlrpnmyhptgdpglvptlvlsvynnlinpfggstnaiqvtvetrpsddfefvmirapssktvdsispagllttpvltgvgndnrwngqivglqpvpggfstcnrhwnlngstygwssprfadidhrrgsasysgnnstnvlqfwyanagsaidnpisqvapdgfpdmsfvpfnspniptagwvgfggiwnsnngapaattvqayelgfatgapnnlqpttntsgaqtvaksiyavvtgtnqnptglfvmasgvistpnasavtytpqpdrivttpgtpaaapvgkntpimfasvvrrtgdvnaaagstngtqygtgsqplpvtiglslnnyssalmpgqffvwqltfasgfmeiglsvdgyfyagtgasttlidltelidvrpvgprpskstlvfnlggttngfsyv(seqidno.2)

基因工程細(xì)胞

本發(fā)明提供了一種基因工程細(xì)胞，所述基因工程細(xì)胞為真核細(xì)胞，并且所述細(xì)胞的基因組中整合有兔出血癥病毒vp60蛋白的表達(dá)盒；或者所述細(xì)胞中含有表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有所述兔出血癥病毒vp60蛋白的表達(dá)盒；

并且所述基因工程細(xì)胞在胞內(nèi)表達(dá)所述vp60蛋白，且所述vp60蛋白在所述基因工程細(xì)胞內(nèi)部形成病毒樣顆粒(vlp)。

在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞為酵母細(xì)胞，優(yōu)選為畢赤酵母細(xì)胞，更優(yōu)選為畢赤酵母km71菌株。

在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)盒包括5'至3'可操作地連接的以下元件：啟動(dòng)子、起始密碼子、所述vp60蛋白的orf序列和終止密碼子。

本發(fā)明中，術(shù)語“可操作地連接”意指這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸的編碼序列的適當(dāng)位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。

組合物和施用方法

本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有：(i)本發(fā)明的重組病毒樣顆粒(vlp)或本發(fā)明的可編碼重組病毒樣顆粒的多核苷酸，以及(ii)藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的賦形劑或佐劑。

本發(fā)明中，術(shù)語“含有”表示各種成分可一起應(yīng)用于或存在于本發(fā)明的組合物中。因此，術(shù)語“主要由...組成”和“由...組成”包含在術(shù)語“含有”中。

本發(fā)明的組合物包括藥物組合物和疫苗組合物。

本發(fā)明的組合物可以是單價(jià)的(僅含有一種重組病毒樣顆?；蚨嗪塑账?，也可以是多價(jià)的(含有多種重組病毒樣顆粒或多核苷酸)。

本發(fā)明的藥物組合物或疫苗組合物可制備成各種常規(guī)劑型，其中包括(但并不限于)：注射劑、粒劑、片劑、丸劑、栓劑、膠囊、懸浮液、噴霧劑等。

(1)藥物組合物

本發(fā)明的藥物組合物包含(或含有)治療有效量的本發(fā)明重組病毒樣顆?；蚨嗪塑账?。

本文所用的術(shù)語“治療有效量”指治療劑治療、緩解或預(yù)防目標(biāo)疾病或狀況的量，或是表現(xiàn)出可檢測的治療或預(yù)防效果的量。該效果可通過例如抗原水平來檢測。治療效果也包括生理性癥狀的減少。對于某一對象的精確有效量取決于該對象的體型和健康狀況、病癥的性質(zhì)和程度、以及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。因此，預(yù)先指定準(zhǔn)確的有效量是沒用的。然而，對于某給定的狀況而言，可以用常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定該有效量。

為了本發(fā)明的目的，有效的劑量為給予個(gè)體約0.001毫克/千克至1000毫克/千克，較佳地約0.01毫克/千克至100毫克/千克體重的重組病毒樣顆粒。

藥物組合物還可含有藥學(xué)上可接受的載體。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑(例如本發(fā)明的重組病毒樣顆粒)給藥的載體。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體：它們本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該組合物的個(gè)體有害的抗體，且給藥后沒有過分的毒性。合適的載體可以是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸(polylacticacid)、聚乙醇酸等。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在remington’spharmaceuticalsciences(mackpub.co.，n.j.1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的充分討論。

組合物中藥學(xué)上可接受的載體可包括液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、ph緩沖物質(zhì)等。通常，可將組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液、液體賦形劑的的固體形式。脂質(zhì)體也包括在藥學(xué)上可接受的載體的定義中。

(ii)疫苗組合物

本發(fā)明的疫苗(組合物)可以是預(yù)防性的(即預(yù)防疾病)或治療性的(即在患病后治療疾病)。

這些疫苗包含免疫性抗原(包括本發(fā)明重組病毒樣顆粒)，并且通常與“藥學(xué)上可接受的載體”組合，這些載體包括本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該組合物的個(gè)體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂質(zhì)凝集物(如油滴或脂質(zhì)體)等。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。另外，這些載體可起免疫刺激劑(“佐劑”)作用。另外，抗原也可以和細(xì)菌類毒素(如白喉、破傷風(fēng)、霍亂、幽門螺桿菌等病原體的類毒素)偶聯(lián)。

增強(qiáng)免疫組合物效果的優(yōu)選佐劑包括但不限于：(1)鋁鹽(alum)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)水包油型乳劑配方，例如，(a)mf59(參見wo90/14837)，(b)saf，和(c)ribi佐劑系統(tǒng)(ras)(ribiimmunochem，hamilton，mt)，(3)皂素佐劑；(4)freund完全佐劑(cfa)和freund不完全佐劑(ifa)；(5)細(xì)胞因子，如白介素(如il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-7、il-12等)、干擾素(如干擾素)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(m-cfs)、腫瘤壞死因子(tnf)等；(6)細(xì)菌adp-核糖基化毒素(如大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素lt)的脫毒變異體；以及(7)作為免疫刺激劑來增強(qiáng)組合物效果的其它物質(zhì)。

包括免疫原性組合物在內(nèi)的疫苗組合物(例如，可包括抗原、藥學(xué)上可接受的載體以及佐劑)，通常含有稀釋劑，如水，鹽水，甘油，乙醇等。另外，輔助性物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、ph緩沖物質(zhì)等可存在于這類運(yùn)載體中。

更具體地，包括免疫原性組合物在內(nèi)的疫苗，包含免疫學(xué)有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的組分。“免疫學(xué)有效量”指以單劑或連續(xù)劑一部分給予個(gè)體的量對治療或預(yù)防是有效的。該用量可根據(jù)所治療個(gè)體的健康狀況和生理狀況、所治療個(gè)體的類別(如人)、個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護(hù)程度、疫苗的配制、治療醫(yī)師對醫(yī)療狀況的評估、及其它的相關(guān)因素而定。預(yù)計(jì)該用量將在相對較寬的范圍內(nèi)，可通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定。

通常，可將疫苗組合物或免疫原性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液、液體賦形劑的固體形式。該制劑還可乳化或包封在脂質(zhì)體中，以增強(qiáng)佐劑效果。

此外，本發(fā)明的疫苗組合物可以是單價(jià)的或多價(jià)疫苗。

(iii)給藥途徑和劑量

一旦配成本發(fā)明的組合物，可將其直接給予對象。待治療的對象可以是哺乳動(dòng)物，尤其是人。

當(dāng)用作疫苗時(shí)，可用已知的方法將本發(fā)明的重組病毒樣顆粒直接施用于個(gè)體。通常采用與常規(guī)疫苗相同的施用途徑和/或模擬病原體感染路徑施用這些疫苗。

給予本發(fā)明藥物組合物或疫苗組合物的途徑包括(但并不限于)：肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)鼻、經(jīng)口服或其它腸胃外給藥途徑。如果需要，可以組合給藥途徑，或根據(jù)疾病情況進(jìn)行調(diào)節(jié)。疫苗組合物可以單劑量或多劑量給予，且可以包括給予加強(qiáng)劑量以引發(fā)和/或維持免疫力。

應(yīng)以“有效量”給予重組病毒樣顆粒疫苗，即重組病毒樣顆粒的量在所選用的給藥路徑中足以引發(fā)免疫應(yīng)答，能有效促使保護(hù)宿主抵抗相關(guān)的疾病。

代表性的疾病包括(但并不限于)：兔出血癥病毒感染等。

在各疫苗劑份中所選用的重組病毒樣顆粒的量，是按可引發(fā)免疫保護(hù)性應(yīng)答而無明顯的副作用的量而定。通常，在感染宿主細(xì)胞后，各劑的疫苗足以含有約1μg-1000mg，較佳地為1μg-100mg，更佳地10μg-50mg蛋白質(zhì)?？捎冒ㄓ^察對象中的抗體滴定度和其它反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)研究方法來確定具體疫苗的最佳用量。可通過監(jiān)控疫苗提供的免疫力水平來確定是否需要增強(qiáng)劑量。在評估了血清中的抗體滴定度后，可能需要選用增強(qiáng)劑量免疫接種。施用佐劑和/或免疫刺激劑就可提高對本發(fā)明的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。

優(yōu)選方法是從腸胃外(皮下或肌內(nèi))途徑通過注射給予免疫原性組合物。

此外，本發(fā)明的疫苗可以結(jié)合其它免疫調(diào)節(jié)劑一起給予，或者與其他治療劑一起給予。

本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)首次實(shí)現(xiàn)了在基因工程細(xì)胞內(nèi)部表達(dá)形成兔出血癥病毒病毒樣顆粒(vlp)；

(2)本發(fā)明的重組兔出血癥病毒病毒樣顆粒能夠誘發(fā)動(dòng)物體產(chǎn)生抗兔出血癥病毒的免疫反應(yīng)；

(3)本發(fā)明的經(jīng)優(yōu)化的rhdvvp60基因序列能夠高效的在酵母細(xì)胞中表達(dá)，且能夠形成vlp，因此本發(fā)明提供了一種能夠大量制備兔出血癥病毒病毒樣顆粒的方法。

(4)本發(fā)明的重組兔出血癥病毒病毒樣顆粒能夠特異性地與抗兔出血癥病毒抗體結(jié)合，可以用于兔出血癥病毒抗體的檢測。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步詳陳本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明詳細(xì)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如美國sambrook.j等著《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(黃培堂等譯，北京：科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。以下實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料和試劑如無特別說明均可從市售渠道獲得。

實(shí)施例1表達(dá)rhdvvp60蛋白vlp的畢赤酵母工程菌的構(gòu)建

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌dh5α；pichiapastoris宿主菌gs115和酵母表達(dá)質(zhì)粒ppic3.5k均購自invitrogen公司；rhdvvp60基因(優(yōu)化后)的由本蘇州金唯智公司合成。

2.工具酶、抗體、試劑盒及主要化學(xué)試劑

dna限制性內(nèi)切酶bamhi和noti酶購自neb公司、taqdna聚合酶、dnamarker、dntps；t4dna均購自takara公司。質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒均購自qiagen公司；pvdf膜(0.45微米規(guī)格)為roche公司產(chǎn)品；pmsf購自碧云天公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠igg購自上?；迳锟萍加邢薰?。鼠抗rhdvvp60蛋白單克隆抗體購自北京嘉美諾生物科技有限公司。yeastnitrogenbase(withoutaminoacid)購自bd公司，dab辣根過氧化物酶顯色試劑盒和d-biotin為上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品。g418為gibco公司產(chǎn)品。

3.主要儀器

pcr儀購自abi公司，蛋白電泳儀和westernblot轉(zhuǎn)移裝置購自bio-rad公司，電子顯微鏡為beckman公司產(chǎn)品，恒溫培養(yǎng)箱和恒溫培養(yǎng)搖床購自上海智城分析儀器制造有限公司，核酸電泳儀和小型蛋白脫色搖床為北京六一公司產(chǎn)品。

4.主要培養(yǎng)基和試劑的配制

培養(yǎng)基

lb液體培養(yǎng)基：將10g胰蛋白胨，5g酵母浸出物，10g氯化鈉用約800mlddh2o溶解后定容至1000ml，于121℃高壓蒸汽滅菌20min后，4℃保存。

lb固體培養(yǎng)基：在配好液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以15g/1000ml液體培養(yǎng)基加入瓊脂粉，121℃高壓蒸汽滅菌20min，待溫度降至55℃左右，加入相應(yīng)抗生素并鋪制平皿，4℃保存。

酵母培養(yǎng)基儲(chǔ)液配方:

ypd培養(yǎng)基：1％酵母抽提物，2％蛋白胨，2％葡萄糖。在900ml去離子水中溶解10g酵母抽提物與20g蛋白胨、20g葡萄糖，121℃滅菌20min，配制平板則于滅菌前加細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂粉至20g/l。

ypdg418抗性平板：配制方法與ypd平板相似，滅菌后等待培養(yǎng)液冷至55℃時(shí)加無菌g418儲(chǔ)存液至終濃度分別為1mg/ml，2mg/ml，3mg/ml，未加g418的培養(yǎng)基可儲(chǔ)存在室溫，3個(gè)月內(nèi)使用。加g418后，須置4℃避光保存，1-2周內(nèi)使用。

10×gy(10％甘油)：將甘油與ddh2o按1:9的比例混合，過濾除菌或高壓滅菌，儲(chǔ)存于4℃。

10×m(5％甲醇)：將甲醇與ddh2o按1:19的比例混合，過濾除菌，儲(chǔ)存于4℃。

10×d(20％葡萄糖溶液)：在500mlddh2o中溶解200gd-葡萄糖，充分溶解后加入ddh2o至終體積1000ml。過濾除菌或高壓滅菌，儲(chǔ)存于4℃，一年內(nèi)使用。

10×ynb：在700mlddh2o中溶解134gynb，加入ddh2o定容到1000ml。過濾除菌后，儲(chǔ)存于4℃，一年內(nèi)使用。

500×b(0.02％生物素)：在100ml去離子水中溶解20mgbiotin，過濾除菌，存于4℃，一年內(nèi)使用。

1m(ph6.0)的磷酸鹽緩沖液：將132ml1m的k2hpo，868ml1m的kh2po4溶液混合，用koh或磷酸調(diào)節(jié)ph值至6.0，高壓滅菌后儲(chǔ)存于室溫。

md和mm平板：

md：1.34％ynb，4×10^-5％biotin，1％甘油。

mm：1.34％ynb，4×10^-5％biotin，0.5％甲醇。

在800ml無菌水加15g瓊脂糖滅菌,冷卻至60℃后加100ml10×ynb溶液，2ml500×b，100ml10×d(md)或10×m(mm)溶液，倒平板，凝固后儲(chǔ)存于4℃，3個(gè)月內(nèi)使用。

bmgy/bmmy培養(yǎng)基：

酵母粉10g，蛋白胨20g，用700mlddh2o溶解，冷至室溫，121℃高壓蒸汽滅菌20min，待溫度降至室溫，加入下列試劑：100ml1mph6.0磷酸鉀緩沖液，100ml10×ynb，2ml500×b，100ml10×gy或10×m，放置于4℃，可放2個(gè)月。

試劑

核酸電泳相關(guān)溶液

50×tae緩沖液(ph8.5)：量取tris堿242g，na2edta-2h2o37.2g放置到1l的燒杯中，加入800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?，加?7.1ml的醋酸，攪拌充分后加去離子水到1l，室溫保存。

蛋白電泳相關(guān)溶液

5×tris-甘氨酸電泳緩沖液：稱取15.1gtris堿，94g甘氨酸(電泳級)(ph8.3)，sds5.0g，加入約800ml的去離子水，攪拌溶解，加ddh2o定容至1l，室溫保存；

1.5mtris緩沖液(ph8.8)：18.1gtris堿，溶于適量ddh2o，用hc1調(diào)ph至8.8，定容至100ml；

1.0mtris緩沖液(ph6.8)：12.1gtris堿，溶于適量ddh2o，用hcl調(diào)ph至6.8，定容至100ml；

蛋白上樣loadingbuffer(5×)：250mmtris-cl(ph6.8)，5％(v/v)β-巰基乙醇(β-me)，10％sds，0.5％(w/v)溴酚藍(lán)，50％甘油。

5ml的配置方法：量取1.25ml的1mtris-cl(ph6.8)于15ml離心管中,稱取0.5gsds，0.025g溴酚藍(lán)后混勾，再加入2.5ml甘油，補(bǔ)加ddh2o溶解后定容到5ml，小份分裝。使用前每500μl中加入25的β-me混勻，則為還原性上樣緩沖液。

12％sds分離膠和5％濃縮膠

蛋白質(zhì)western-blot相關(guān)試劑

轉(zhuǎn)膜緩沖液：稱取甘氨酸2.9g，tris堿5.8g，sds0.37g，量取甲醇200ml，加ddh2o至1000ml。溶解后室溫保存。

tbs緩沖液(100mmtris-hcl，ph7.5，150mmnacl)：取1mol/ltris-hcl(ph7.5)10ml,nacl8.8g，用ddh2o定容至1000ml。

tbst緩沖液：含0.05％tween-20的tbs緩沖液，取tween-200.5ml，tbs1000ml，混勻后即可使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。

封閉液：含5％脫脂奶粉的tbst緩沖液，脫脂奶粉5g，tbst100ml。溶解后4℃保存。使用時(shí)，恢復(fù)室溫，用量以蓋過膜面即可，一次性使用。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.重組表達(dá)質(zhì)粒ppic3.5k-vp60的構(gòu)建

根據(jù)公布的rhdvvp60蛋白的基因序列，進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化設(shè)計(jì)了大量的序列片段，并分別進(jìn)行人工合成。

人工合成vp60基因序列后和ppic3.5k載體用bamhi和ecori雙酶切；之后用核酸凝膠回收試劑盒回收酶切后的vp60基因和ppic3.5k載體相應(yīng)片段，用t4連接酶分別將vp60基因(bamhi/ecori)和ppic9k載體(bamhi/ecori)，進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)，連接產(chǎn)物涂于amp抗性的lb平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h，每板挑取5個(gè)克隆進(jìn)行菌落pcr鑒定，陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后小提質(zhì)粒初步得到ppic9k-vp60，經(jīng)bamhi/ecori雙酶切鑒定，酶切大小正確的質(zhì)粒送蘇州金唯智公司進(jìn)行基因測序。

在表達(dá)基因優(yōu)化過程中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化獲得的不同的vp60基因序列，在表達(dá)水平上差異巨大，而且很多基因序列無法形成病毒性顆粒，或者形成的病毒性顆粒免疫原性很低。經(jīng)過大量篩選、驗(yàn)證，獲得了能夠在酵母中高效表達(dá)的vp60基因序列，而且該序列表達(dá)的vp60蛋白能夠在細(xì)胞中形成正確折疊的vlp顆粒，非常適合具有天然vp60免疫原性的vlp的制備，其具體序列如下。

rhdvvp60的優(yōu)化基因序列

>atggaaggaaaagccagaaccgctccacaaggtgaagctgccggaaccgctactaccgcctccgttcctggaactactaccgatggaatggacccaggagttgttgccgctacttccgttgttactgctgagaactcctctgcctctgttgctactgctggtatcggtggtcctccacagcaagttgatcaacaagaaacctggcgtaccaacttctactataacgacgttttcacttggtctgttgctgacgccccaggttctatcttgtacactgttcaacattctccacaaaacaacccattcaccgccgttttgtcccagatgtacgctggttgggctggtggtatgcagttcagattcattgttgccggttccggtgtcttcggtggtagattggtcgctgctgtcatcccacctggtattgagatcggtccaggtttggaggtccgtcaattcccacacgttgttatcgacgcccgttctttggagccagttaccatcactatgccagatttgagacctaacatgtaccacccaactggtgatcctggtcttgtccctactttggttttgtctgtttacaacaatttgatcaacccatttggtggttccaccaacgctattcaggttaccgtcgagaccagaccatccgacgacttcgagtttgtcatgatccgtgctccatcctccaagactgttgactccatctccccagctggtttgttgactactccagtcttgaccggtgtcggaaacgacaaccgttggaacggtcagattgtcggtttgcaacctgtccctggaggtttctctacctgcaaccgtcactggaacttgaacggttccacttacggttggtcctctccaagattcgccgatatcgaccacagaagaggttccgcctcttactccggaaataactccaccaacgtcttgcagttctggtacgccaacgccggttctgccatcgacaacccaatttcccaagttgccccagacggtttcccagatatgtcttttgttccattcaactctcctaacatcccaactgccggttgggttggtttcggtggtatctggaactccaacaacggtgctcctgctgccaccactgtccaggcttacgaacttggtttcgccaccggtgctcctaacaacttgcagccaactactaacacttccggtgctcagaccgttgccaaatccatctacgctgttgtcaccggtaccaatcagaacccaaccggtttgtttgttatggcttccggagtcatctccactcctaacgcctctgctgttacctacaccccacagcctgacagaattgtcactaccccaggaactcctgctgccgctccagttggaaagaacactcctatcatgttcgcctccgtcgttcgtagaaccggtgacgttaacgctgccgctggttccactaacggtacccaatacggtaccggttctcagccattgccagtcaccattggtttgtctttgaataactattcctctgccttgatgccaggtcagttctttgtctggcagttgaccttcgcttccggattcatggagatcggtttgtctgttgatggatacttttacgccggtaccggtgcctctaccactcttatcgatcttaccgaattgatcgatgtccgtccagttggtcctagaccttccaagtccaccttggtcttcaacttgggaggtactaccaatggtttttcttacgtttaa

2.重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母

2.1質(zhì)粒dna的大量制備和線性化

質(zhì)粒的大量提取：將經(jīng)酶切鑒定含有陽性克隆的單菌落接種于3mllb培養(yǎng)基(含100g/mlamp)中，37℃振蕩過夜。當(dāng)細(xì)菌生長至對數(shù)晚期，菌濃約od600＝0.60時(shí)，將此培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至500ml(含100g/mlamp)lb培養(yǎng)瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)12～16小時(shí)，收集菌液，4000rpm4℃離心10分鐘，去上清，按照qiagen公司的質(zhì)粒大提試劑盒說明書步驟大提質(zhì)粒。

質(zhì)粒dna的線性化酶切：

酶切體系如下：

37℃酶切3小時(shí)，加等體積酚：氯仿，混勻，12000rpm離心10分鐘，吸取上層水相，再加等體積氯仿：異戊醇，混勻，12000rpm離心10分鐘，吸取上層水相，加1/4體積的醋酸銨和2倍體積的無水乙醇，于-20℃放置20分鐘，然后12000rpm離心15分鐘，倒去上清，用70％乙醇和無水乙醇分別洗沉淀一次，置37℃干燥后重懸于15μlte緩沖液。

2.2線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞

感受態(tài)細(xì)胞的制備：

(1)接種畢赤酵母單菌落于裝有5mlypd培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，28℃220rpm培養(yǎng)過夜。

(2)取0.1-0.5ml培養(yǎng)物接種于500ml新鮮培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，至od600約為1.3-1.5。

(3)4℃，1500×g，5分鐘離心收集細(xì)胞，沉淀重溶于500ml冰凍的無菌水中。

(4)4℃，1500×g，5分鐘離心收集細(xì)胞，沉淀重溶于250ml冰凍的無菌水中。

(5)4℃，1500×g，5分鐘離心收集細(xì)胞，沉淀重溶于20ml冰凍的1m山梨醇中。

(6)4℃，1500×g，5分鐘離心收集細(xì)胞，沉淀重溶于1ml冰凍的1m山梨醇中。

(7)分裝至預(yù)凍的1.5ml離心管中，每支離心管分裝80μl。

電轉(zhuǎn)化：

(1)取5-20μg線性化的dna，溶于5-10μlte中，與80μl電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞混合，然后轉(zhuǎn)移至冰凍的0.2cm的電轉(zhuǎn)杯中。

(2)冰上孵育電轉(zhuǎn)杯5分鐘。

(3)轉(zhuǎn)化：電轉(zhuǎn)儀為bio-radgenepulse，電壓1500v，電容25μf，電阻200ω。

(4)立即加入lml“冰凍的1m山梨醇于轉(zhuǎn)化杯中，把電轉(zhuǎn)杯中的溶液轉(zhuǎn)至1.5ml無菌離心管中。

(5)取200-600μl溶液涂于md平板，28℃培養(yǎng)，挑選his+/muts表型克隆。

3.利用g418抗性篩選畢赤酵母多拷貝轉(zhuǎn)化子

對于利用ppic3.5k質(zhì)粒進(jìn)行電轉(zhuǎn)化的酵母菌，在md板上長出單克隆菌落以后，隨機(jī)挑選若干菌落到預(yù)先添加了100μlypd液體培養(yǎng)基的96孔板中，28℃培養(yǎng)16-20h，然后再各取10μl菌液接菌到另外一塊預(yù)先添加了100μlypd的96孔板中。經(jīng)過同步化以后，再取10μl菌液接菌到含1mg/ml、2mg/ml和3mg/mlg418抗性的ypd平板上。28℃培養(yǎng)2-5d待長出單菌落。

4pcr法鑒定陽性重組子

在單菌落上挑取部分酵母菌于5μl1％蝸牛酶/sce溶液，37℃輕搖3h，酶解破壁，100℃加熱15分鐘后稀釋至20μl，取5μl作模板，以引物el和e2進(jìn)行pcr反應(yīng)。

反應(yīng)體系：h2o75μl，dntps(2.5mm/each)5μl，10×taq酶反應(yīng)緩沖液10μl，模板5μl，引物el2μl，引物e22μl。

pcr反應(yīng)條件：95℃5分鐘，加taq酶1μl/管(4μ)，30個(gè)溫度循環(huán)，72℃10分鐘

溫度循環(huán)條件；95℃30秒，60℃30秒，72℃120秒。產(chǎn)物鑒定方法同上。

5融合基因在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)

1.挑取gs115-ppic3.5k-vp60酵母平板(2mg/ml)上的單克隆到背面畫格子的ypd平板，每個(gè)方格生長一個(gè)單克隆，28℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.60h后平板上酵母生長起來，分別挑取3個(gè)克隆到含有10mlbmgy培養(yǎng)基的50ml離心管中，做好記錄，加蓋四層滅菌紗布，28℃250rpm培養(yǎng)至od600大約2-6(對數(shù)期生長，大約16-18h)。

3.室溫1500g離心5min，收集細(xì)胞，去除上清，用bmmy重懸細(xì)胞至od600＝1.0，管內(nèi)剩余10ml培養(yǎng)液，多余棄掉，培養(yǎng)物加蓋四層滅菌紗布，放入搖床繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)。

4.24小時(shí)后，補(bǔ)加甲醇至終濃度為0.5％(約1ml5％的甲醇，檢查培養(yǎng)基的量，確保正確加入甲醇，因?yàn)檎舭l(fā)作用會(huì)減少培養(yǎng)基的體積)以繼續(xù)誘導(dǎo)。

5.24h后1500×g，5分鐘離心收集細(xì)胞。

6.收集細(xì)胞，室溫最大轉(zhuǎn)速離心2-3min，離心后每管取80mg濕重的酵母菌(加入同等重量的beads，150μl的裂解液)進(jìn)行破碎，sds-page和elisa方法檢測蛋白表達(dá)情況。

6酵母細(xì)胞蛋白抽提物的制備

取誘導(dǎo)表達(dá)后收集的細(xì)胞在每支1.5mleppendorf管中加入80mg濕重的酵母菌。以冰冷的去離子水洗2遍，加入冰冷的裂解緩沖液(含100mmpmsf)160μl加入等體積的酸洗beads(0.5mm)。強(qiáng)烈振蕩30秒，然后冰浴30秒，重復(fù)此振蕩加冰浴操作12次。12000rpm離心15分鐘，取上清即得蛋白抽提物。

7sds-page和westernblot

1)取酵母細(xì)胞抽提物20μl，加入5×sds-pageloadingbuffer5微升混勻，100℃煮沸5min；

2)將蛋白膠安裝在電泳架上，放入電泳槽中，灌入電泳液，拔去梳子，在加樣孔中加入25μl處理好的蛋白樣品，進(jìn)行sds-page電泳：100v電壓下電泳20min后，待蛋白條帶開始移動(dòng)到分離膠后調(diào)節(jié)電壓為150v，電泳1h；

3)電泳完畢后采用濕轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移到pvdf膜上，轉(zhuǎn)膜電流280ma轉(zhuǎn)1h；

4)轉(zhuǎn)膜結(jié)束將膜放入塑料小盒中，加入5％脫脂奶粉在室溫?fù)u床搖蕩封閉1h以消除非特異背景；

5)封閉完畢，tbst洗膜3次，每次5min；

6)加入1％脫脂奶粉(tbst配置)稀釋的anti-rhdvvp60單克隆抗體作為一抗(1:1000稀釋)，于室溫?fù)u床搖蕩孵育2h(或4℃孵育過夜)；

7)孵育結(jié)束回收一抗，用tbst洗膜3次，5min/次；

8)加hrp標(biāo)記的goat-anti-mouse二抗，于搖床上室溫孵育1h；

9)用tbst洗3次，每次5min；

10)將膜轉(zhuǎn)至新鮮配制dab溶液中進(jìn)行顯色，細(xì)心觀察，一旦蛋白質(zhì)雜交條帶顯現(xiàn)，立即用水漂洗終止反應(yīng)，轉(zhuǎn)至pbst溶液中。

8電鏡觀察鑒定畢赤酵母中表達(dá)的vp60蛋白形成vlp

選取酵母細(xì)胞蛋白抽提物樣品用于電鏡觀察。采用常規(guī)的負(fù)染技術(shù)，把等量的樣品和2％的磷鎢酸染液混合后用毛細(xì)管滴至有膜的載網(wǎng)上，吸去過多的液體將載網(wǎng)放于37℃烘干后進(jìn)行電鏡觀察，并根據(jù)照片上顆粒的直徑和放大倍數(shù)來估算顆粒的實(shí)際大小。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1重組表達(dá)質(zhì)粒ppic3.5k-vp60的構(gòu)建

重組質(zhì)粒ppic3.5k-vp60經(jīng)bsrgi酶切成大小約為7000bp和5500bp的兩條片段(圖1)；初步確認(rèn)為陽性重組質(zhì)粒，將此質(zhì)粒送金唯志公司測序，測序結(jié)果經(jīng)ebi中的clustalw2比對，和優(yōu)化過的vp60cdna序列完全一致。

圖1顯示了ppic3.5k-vp60表達(dá)載體的酶切鑒定，lane1:未消化的ppic3.5k-vp60；lane2:用bsrgi消化；lane3:分子量標(biāo)記。

ppic3.5k-vp60與bsrgi酶切后的ppic3.5k-vp60同步進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測結(jié)果顯示ppic3.5k-vp60重組載體大約12000bp，而bsrgi酶切后的重組載體ppic3.5k-vp60出現(xiàn)約為7000bp和5500bp的兩條片段

2重組質(zhì)粒ppic3.5k-vp60轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞后，用g418抗性篩選畢赤酵母多拷貝轉(zhuǎn)化子以及pcr法鑒定陽性重組子。

3westernblot鑒定vp60蛋白在畢赤酵母細(xì)胞中表達(dá)

挑取3個(gè)km71單菌落接種至bmgy液體培養(yǎng)基中，28℃，250rpm搖菌培養(yǎng)至0d600＝6，離心后加入bmmy重懸菌體使菌液0d600＝1，然后接種至bmmy培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，作為陰性對照,轉(zhuǎn)化ppic3.5k空載體的km71菌株同步進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。每隔24h向培養(yǎng)基中加入100×甲醇使其終農(nóng)度達(dá)到0.5％，誘導(dǎo)培養(yǎng)48h后，離心收集菌體沉淀，進(jìn)行破碎后抽提蛋白，蛋白抽提液進(jìn)行westernblot檢測。結(jié)果顯示在ppic3.5k-vp60/km71蛋白抽提物樣品在60kda左右處都有蛋白條帶，然而在ppic3.5k/km71蛋白抽提物樣品中沒有檢測到目的蛋白條帶。

此結(jié)果表明vp60蛋白成功在畢赤酵母中表達(dá)，篩選后挑選的三個(gè)克隆的表達(dá)量沒有顯著差異。

圖2顯示了sds-page和westernblot檢測rhdvvp60蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)。

4電鏡觀察vp60蛋白形成的vlp顆粒

將甲醇誘導(dǎo)后的酵母細(xì)胞蛋白抽提物樣品做電鏡負(fù)染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3：負(fù)染之后在電鏡下能觀察到明顯的病毒顆粒，結(jié)果表明在畢赤酵母中表達(dá)的rhdvvp60蛋白能夠組裝成病毒顆粒。

圖3顯示了電鏡負(fù)染實(shí)驗(yàn)觀察rhdv病毒顆粒。

實(shí)施例2rhdv病毒樣顆粒疫苗活性檢測

本發(fā)明的兔病毒性出血癥病毒(rhdv)病毒樣顆粒疫苗是利用酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)rhdv的vp60結(jié)構(gòu)蛋白，然后在體外組裝形成病毒樣顆粒，并加入適量佐劑制成的疫苗。按現(xiàn)行《中國獸藥典》方法進(jìn)行了細(xì)菌和霉菌、支原體和外源病毒的檢驗(yàn)，均符合規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)將本發(fā)明生產(chǎn)的疫苗的安全性和免疫效力試驗(yàn)總結(jié)如下。

1毒種

1.1檢驗(yàn)用毒種來源

效檢所用毒種系無菌采取感染rhdv病死的兔肝臟組織，然后進(jìn)行組織研磨(1g肝臟組織加入含抗生素的pbs3ml，抗生素為青霉素、鏈霉素各1000iu/ml)，研磨后4000r/min離心10分鐘取上清，由上海海利生物股份有限公司工程技術(shù)中心保管、鑒定和供應(yīng)。

1.2試驗(yàn)試劑

效檢所用兔病毒性出血癥病毒滅活疫苗購自南京天邦生物科技有限公司；兔病毒性出血癥病毒樣顆?？乖杀竟こ讨行闹苽洳⒓尤脒m量佐劑混合而成，抗原含量分別為1mg/ml和2mg/ml；其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)優(yōu)級純。

1.3試驗(yàn)材料

手術(shù)托盤及解剖器械、組織研磨器、注射器、采血器、乳化器、索尼照相機(jī)等。

1.4試驗(yàn)動(dòng)物

45-60日齡的體重1.5kg以上的健康spf家兔，購自青島康大生物科技有限公司，用于本試驗(yàn)。

2疫苗的免疫效力檢驗(yàn)

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將16只spf兔隨機(jī)分為4組，每組4只：第一組為pbs對照組，皮下注射1mlpbs；第二組為商品疫苗免疫組，皮下注射1ml商品疫苗；第三組為低劑量抗原免疫組，皮下注射1ml抗原(1mg/ml)；第四組為高劑量抗原免疫組，皮下注射1ml抗原(2mg/ml)。

2.2免疫效果比較

各組家兔免疫21天后均皮下注射rhdv病毒液1ml。攻毒后臨床觀察7日，記錄臨床反應(yīng)情況并統(tǒng)計(jì)各組家兔死亡個(gè)數(shù)，對感染后發(fā)病死亡兔及時(shí)進(jìn)行解剖，記錄病死兔解剖的眼觀病理變化并拍照，評價(jià)疫苗的免疫效果。

3結(jié)果

3.1臨床癥狀表現(xiàn)

pbs組試驗(yàn)感染兔分別于感染后4-28h，體溫升高出現(xiàn)兔瘟的典型癥狀，16-34h后體溫升至峰值(40-41.5℃)，其中3只病兔高溫分別持續(xù)10-18h，體溫開始下降后7-12.5小時(shí)死亡。升溫明顯之后表現(xiàn)精神沉郁，食欲減退飲欲增強(qiáng)；進(jìn)而呼吸急促，可視黏膜發(fā)紺，少尿，蛋白尿，嗜眠；呈現(xiàn)腹脹，便秘，臨死前表現(xiàn)短期興奮，掙扎，籠內(nèi)狂奔，然后兩前肢臥地，兩后肢支起，全身震顫，抽搐，最后側(cè)臥地上，四肢不斷滑動(dòng)，最后扭向一側(cè)，角弓反張姿勢，血液凝固不良呈暗紅色，眼結(jié)膜充血，鼻孔周圍帶有血液污染，有時(shí)流出鮮紅色泡沫狀血液，齒齦出血，突然跳起慘叫；個(gè)別病兔陰門流血。剖檢時(shí)眼觀病變符合急性兔瘟。其余免疫組家兔在攻毒后3d內(nèi)出現(xiàn)一過性食欲減退，精神沉郁，但隨之恢復(fù)正常。

3.2死亡情況統(tǒng)計(jì)

pbs組家兔在攻毒后60h左右死亡兩只(2/4)，84h左右死亡一只(1/4)，剩余一只觀察7d未死亡；免疫組家兔攻毒后均未死亡，這說明疫苗免疫效果良好。

3.3病理解剖學(xué)觀察

家兔攻毒后，病理解剖結(jié)果如圖4所示，pbs組家兔攻毒后臟器變化符合兔瘟，而免疫組家兔臟器未見異常。

4實(shí)驗(yàn)室試制產(chǎn)品總結(jié)

本研究以酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的rhdv病毒樣顆粒為抗原，在實(shí)驗(yàn)室條件下生產(chǎn)制造了疫苗，并對疫苗進(jìn)行了效力檢驗(yàn)，結(jié)果表明，生產(chǎn)的疫苗符合本疫苗規(guī)程規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，疫苗接種試驗(yàn)兔對動(dòng)物安全可靠，無毒副作用，而且疫苗具有良好的免疫效果。

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