本發(fā)明屬于分子遺傳育種領(lǐng)域，涉及基于高分辨率溶解曲線鑒定梨果肉低石細(xì)胞含量的snp標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

梨在我國栽培歷史悠久，同時(shí)也是世界上重要的落葉果樹。梨果實(shí)營養(yǎng)價(jià)值高,肉脆多汁，深受人們的喜愛。梨果實(shí)的食用品質(zhì)一直是人們所關(guān)注的問題，它是決定梨果實(shí)經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要因素，因此提高梨的食用品質(zhì)具有重要的意義。梨果實(shí)食用品質(zhì)受眾多因素的影響，其中石細(xì)胞是影響梨果實(shí)品質(zhì)的重要因素之一。石細(xì)胞是梨果實(shí)中特有的一類厚壁細(xì)胞，它不僅影響梨果實(shí)的食用品質(zhì)，而且影響其加工品質(zhì)。降低梨果實(shí)石細(xì)胞的含量，對改善梨的品質(zhì)至關(guān)重要。近年來，我國梨的主栽品種碭山酥梨由于品種退化或是管理不善的原因，石細(xì)胞含量增加，肉質(zhì)變粗，口感多渣，嚴(yán)重影響了碭山酥梨的品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此，優(yōu)質(zhì)低石細(xì)胞含量梨育種不僅成為二十一世紀(jì)國際梨育種的主要目標(biāo)之一，也成為最近幾年我國梨品種品質(zhì)改良的熱點(diǎn)和顯著趨勢。

梨新品種的選育主要以雜交選育為主，而雜交選育通常是通過表型進(jìn)行的，多數(shù)控制梨果實(shí)經(jīng)濟(jì)性狀的基因?yàn)閿?shù)量性狀(qtl)基因，并且梨的童期較長，利用傳統(tǒng)的育種技術(shù)選育新的品種需要很長的時(shí)間，因此培育出品質(zhì)優(yōu)良、抗病、抗蟲、豐產(chǎn)耐貯的綜合性狀優(yōu)良的新品種具有很大困難。利用分子標(biāo)記輔助選擇(mas)育種技術(shù)可以提高選擇效率，加快育種步伐。snp(singlenucleotidepolymorphism,單核苷酸多態(tài)性)分子標(biāo)記作第三代分子標(biāo)記的代表，具有變異豐富、高度穩(wěn)定且易實(shí)現(xiàn)高通量自動化分析等特點(diǎn)，是傳統(tǒng)的分子標(biāo)記無可比擬的。近年來snp分子標(biāo)記受到了分子育種和系統(tǒng)進(jìn)化研究領(lǐng)域的高度關(guān)注[1,2]，在群體遺傳及系統(tǒng)發(fā)育分析[3]、遺傳圖譜構(gòu)建[4]和物種多樣性分析[5]等方面得到廣發(fā)應(yīng)用，成為作物研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要工具。

目前有關(guān)梨數(shù)量性狀的qtl定位研究仍屬起步階段，已有的研究主要是針對一些病害或生長性狀，對梨果肉低石細(xì)胞含量的snp分子標(biāo)記開發(fā)應(yīng)用研究尚未有報(bào)道。因此，開展梨果肉低石細(xì)胞含量的snp分子標(biāo)記開發(fā)，并建立自然群體輔助選擇技術(shù)體系，對于提高育種效率，節(jié)約生產(chǎn)成本顯得尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是利用梨的重測序數(shù)據(jù)信息，開發(fā)基于高分辨率溶解曲線鑒定梨果肉低石細(xì)胞含量的snp特異標(biāo)記psc397-7、psc397-12的引物。通過該分子標(biāo)記引物可以預(yù)測低果肉石細(xì)胞含量的梨品種，為實(shí)現(xiàn)梨果肉石細(xì)胞含量早期鑒定和篩選提供分子標(biāo)記輔助育種的技術(shù)支持。

與梨果肉石細(xì)胞含量的緊密相關(guān)的snp標(biāo)記，選自位于ajsu00000000的梨基因組序列chr5的第26607192個(gè)堿基或第26607490個(gè)堿基處的位點(diǎn)psc397-7或psc397-12；psc397-7位點(diǎn)在低石細(xì)胞含量品種中為a，高石細(xì)胞含量品種中為g；psc397-12位點(diǎn)在低石細(xì)胞含量品種中為g，高石細(xì)胞含量品種中為a。

本發(fā)明所述的snp標(biāo)記在鑒定梨果肉高或低石細(xì)胞含量中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的snp標(biāo)記在梨果肉石細(xì)胞含量早期鑒定和篩選的分子育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明與梨果肉石細(xì)胞含量的緊密相關(guān)的snp標(biāo)記引物對，其特征在于選以下任意一對：psc397-7-f：seqidno.1，psc397-7-r：seqidno.2；或者psc397-12-f：seqidno.3，psc397-12-r：seqidno.4。

本發(fā)明所述的snp標(biāo)記引物對在鑒定梨果肉高或低石細(xì)胞含量中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的snp標(biāo)記引物對在梨果肉石細(xì)胞含量早期鑒定和篩選的分子育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)ajsu00000000的梨基因組序列chr5的第26607192和26607490個(gè)堿基處分別存在一個(gè)與梨果肉低石細(xì)胞含量相關(guān)的位點(diǎn)psc397-7和psc397-12。psc397-7位點(diǎn)在低石細(xì)胞含量品種中為a，高石細(xì)胞含量品種中為g；psc397-12位點(diǎn)在低石細(xì)胞含量品種中為g，高石細(xì)胞含量品種中為a。通過檢測該位點(diǎn)的基因型可以預(yù)測梨果肉石細(xì)胞含量，以實(shí)現(xiàn)果肉低石細(xì)胞含量的早期鑒定和篩選。其中psc397-7的snp標(biāo)記引物對為psc397-7-f：seqidno.1，psc397-7-r：seqidno.2；psc397-12位點(diǎn)的引物對為psc397-12-f：seqidno.3，psc397-12-r：seqidno.4。

一種基于高分辨率溶解曲線鑒定梨果肉高或低石細(xì)胞含量的方法，采用本發(fā)明所述的任意一對snp標(biāo)記引物對對果肉石細(xì)胞含量高的對照梨品種和果肉石細(xì)胞含量低的對照梨品種，以及待鑒定果肉石細(xì)胞含量的梨品種進(jìn)行高分辨率溶解曲線分析，通過對待鑒定梨品種的高分辨率溶解曲線與上述兩種對照梨品種的高分辨率溶解曲線的比較，鑒定該梨品種的果肉石細(xì)胞含量是高還是低；其中所述的果肉石細(xì)胞含量高的對照梨品種選自：碭山酥梨；所述的果肉石細(xì)胞含量低的對照梨品種選自：脆綠。

其中，所述的高分辨率溶解曲線反應(yīng)體系按照lightcycler480highresolutionmeltingmaster試劑盒中的說明書進(jìn)行，hrm分析在lightcycler480ii熒光定量pcr儀上進(jìn)行。

高分辨率溶解曲線反應(yīng)體系為20μl：含有30ng梨基因組dna模板，1×mastermix，2.5mmol/lmgcl2，200nm本發(fā)明所述的snp標(biāo)記引物對；擴(kuò)增程序采用降落式pcr：95℃預(yù)變性10min，然后95℃變性10s、65-55℃退火10s，每循環(huán)下降0.5℃，72℃延伸10s的程序進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；pcr循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解，其程序?yàn)椋?5℃1min，40℃1min，65℃1s，再從70℃連續(xù)升溫至95℃，每升高0.04℃，收集熒光1次，最后降溫至40℃；最后，在lightcycler480ii的genescanning軟件中自動生成擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。

有益效果

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)ajsu00000000的梨基因組序列chr5的第26607192和26607490個(gè)堿基處分別存在一個(gè)與梨果肉低石細(xì)胞含量相關(guān)的位點(diǎn)psc397-7和psc397-12，通過檢測該位點(diǎn)的基因型可以預(yù)測梨果肉石細(xì)胞含量，以實(shí)現(xiàn)果肉低石細(xì)胞含量的早期鑒定和篩選?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，申請人開發(fā)了上述兩個(gè)位點(diǎn)的snp標(biāo)記引物。利用開發(fā)的兩對snp標(biāo)記引物，對56個(gè)梨自然群體進(jìn)行差異基因型檢測，能很好地用于鑒定低果肉石細(xì)胞含量群體，與果實(shí)實(shí)際果肉石細(xì)胞含量相符。群體試驗(yàn)表明，開發(fā)的snp標(biāo)記特異引物可以對自然群體低果肉石細(xì)胞含量品種進(jìn)行良好分型，因此，具有良好的應(yīng)用價(jià)值，可實(shí)現(xiàn)對低梨果肉石細(xì)胞含量品種的預(yù)先選擇和輔助育種。

附圖說明

圖1snp標(biāo)記psc397-7、psc397-12開發(fā)的hrm特異標(biāo)記引物，56個(gè)梨自然群體個(gè)體中檢測的歸一化平移溶解曲線，可良好分型。

(a)psc397-7標(biāo)記引物檢測的歸一化平移溶解曲線。

(b)檢測個(gè)體的排列，a1-c6為高石細(xì)胞含量群體，e1-g2低石細(xì)胞含量群體。

(c)psc397-12標(biāo)記引物檢測的歸一化平移溶解曲線。

(d)檢測個(gè)體的排列，a1-c6為高石細(xì)胞含量群體，e1-g2低石細(xì)胞含量群體。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做出詳細(xì)的描述。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。

實(shí)施例1石細(xì)胞含量的測定

石細(xì)胞的分離稱量參照tao等(2009)的方法進(jìn)行[6]。將果實(shí)去皮去核并取100g果肉加蒸餾水打漿，再用蒸餾水稀釋勻漿液，攪拌后于室溫下靜置30min，棄去漂浮物，沉淀物重新懸浮于0.5mol/l鹽酸中30min，棄去漂浮物，用蒸餾水洗滌。重復(fù)以上步驟直至石細(xì)胞與其他細(xì)胞碎片分離，烘干后稱量。56個(gè)梨自然群體花后35天果肉石細(xì)胞含量見表1。

表156個(gè)梨自然群體花后35天果肉石細(xì)胞含量

注：序號1-30為高石細(xì)胞含量品種，31-56為低石細(xì)胞含量品種。

實(shí)施例2利用snp標(biāo)記位點(diǎn)psc397-7、psc397-12開發(fā)hrm特異引物

從碭山酥梨全基因組數(shù)據(jù)庫中搜索出第5條染色體上snp標(biāo)記psc397-7、psc397-12的dna序列，選取的該位點(diǎn)前后300bp的序列，依據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，開發(fā)設(shè)計(jì)snp標(biāo)記引物(表2)。利用設(shè)計(jì)的snp標(biāo)記引物在碭山酥梨的基因組dna上進(jìn)行pcr擴(kuò)增，引物均擴(kuò)增正常，pcr產(chǎn)物符合預(yù)測大小。

表2snp標(biāo)記引物

實(shí)施例3利用hrm(high-resolutionmelting，高分辨率溶解曲線)技術(shù)對梨果肉石細(xì)胞含量進(jìn)行分型

hrm反應(yīng)體系按照lightcycler480highresolutionmeltingmaster試劑盒中的說明書進(jìn)行，hrm分析是在lightcycler480ii熒光定量pcr儀上進(jìn)行。20μl反應(yīng)體系：含有30ng梨基因組dna模板，1×mastermix，2.5mmol/lmgcl2，200nm所述的引物(psc397-7-f：seqidno.1/psc397-7-r：seqidno.2或psc397-12-f：seqidno.3，/psc397-12-r：seqidno.4)；擴(kuò)增程序采用降落式pcr(touchdownpcr)：95℃預(yù)變性10min，然后95℃變性10s、65-55℃(每循環(huán)下降0.5℃)退火10s、72℃延伸10s的程序進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。pcr循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解，其程序?yàn)椋?5℃1min，40℃1min，65℃1s，再從70℃連續(xù)升溫至95℃，每升高0.04℃，收集熒光1次，最后降溫至40℃。最后，在lightcycler480ii的genescanning軟件中自動生成擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。

利用實(shí)施例2得到的snp標(biāo)記引物對56個(gè)梨自然群體進(jìn)行hrm分析(圖1)。

psc397-7引物分型結(jié)果：

線型1—紅色曲線，21個(gè)體線型相似，其中20個(gè)體為高果肉石細(xì)胞含量；線型2—藍(lán)色曲線，31個(gè)體線型相似，其中25個(gè)體為低果肉石細(xì)胞含量；線型3—綠色曲線，4個(gè)體線型相似，其中4個(gè)體為高果肉石細(xì)胞含量。統(tǒng)計(jì)分析表明，56個(gè)個(gè)體分型為三種基因型，分離比例為21：31：4。根據(jù)psc397-7引物分型結(jié)果將56個(gè)自然群體果肉石細(xì)胞含量生理數(shù)據(jù)進(jìn)行fisher’sexacttest(p-value＝3e-9)。

psc397-12引物分型結(jié)果：

線型1—紅色曲線，21個(gè)體線型相似，其中21個(gè)體為高果肉石細(xì)胞含量；線型2—藍(lán)色曲線，31個(gè)體線型相似，其中25個(gè)體為低果肉石細(xì)胞含量；線型3—綠色曲線，4個(gè)體線型相似，其中3個(gè)體為高果肉石細(xì)胞含量。統(tǒng)計(jì)分析表明，56個(gè)個(gè)體分型為三種基因型，分離比例為21：31：4。根據(jù)psc397-12引物分型結(jié)果將56個(gè)自然群體果肉石細(xì)胞含量生理數(shù)據(jù)進(jìn)行fisher’sexacttest(p-value＝5.83e-10)。

將兩對引物的分型結(jié)果相結(jié)合，對梨果肉低石細(xì)胞含量的群體鑒定準(zhǔn)確率達(dá)到了92.3％。因此，通過對梨花后35天果肉石細(xì)胞含量的生理性狀測定結(jié)果與hrm分型結(jié)果的比較分析，證明psc397-7和psc397-12標(biāo)記的基因型與果肉石細(xì)胞含量有關(guān)，將兩組分型結(jié)果相結(jié)合，能更好地用于檢測梨果肉低石細(xì)胞含量個(gè)體。

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<120>基于高分辨率溶解曲線鑒定梨果肉低石細(xì)胞含量的snp標(biāo)記及其應(yīng)用

<160>2

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>psc397-7-f

<400>1

tacatgcaaagctggttcataact24

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<212>dna

<213>人工序列

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<223>psc397-7-r

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