本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種磁性人工受體及其制備方法和在高選擇性、高特異性垂釣中藥潛在抗腦卒中活性成分中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腦卒中是一種突發(fā)性局部腦組織缺血導(dǎo)致的疾病，具有高死亡率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)。fda獲準(zhǔn)的唯一藥物組織型纖溶酶原激活劑(tissueplasminogenativator，tpa)由于時(shí)間窗狹窄，并發(fā)癥危險(xiǎn)，禁忌癥限制等大大降低了使用效率，因此腦卒中藥物的研發(fā)迫在眉睫。針對(duì)腦卒中損傷機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，阻斷突觸后密度蛋白-95(psd-95)與神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nnos)的偶聯(lián)，能夠降低no的釋放，減輕缺血性腦卒中的神經(jīng)細(xì)胞凋亡和損傷，在不影響其他神經(jīng)功能的基礎(chǔ)上發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。由此設(shè)計(jì)的小分子解偶聯(lián)劑zl006具有較好的生物活性，但是zl006脂溶性差，不易透過(guò)血腦屏障，限制了其臨床使用，因此新的小分子解偶聯(lián)劑成為腦卒中藥物研究的熱點(diǎn)。

近年來(lái)，中藥治療腦卒中已經(jīng)取得了實(shí)際的進(jìn)展，例如丹參注射液治療出血性腦卒中以其療效好、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)應(yīng)用日益廣泛。然而中藥成分復(fù)雜，含量低和不穩(wěn)定等特點(diǎn)限制了中藥的進(jìn)一步發(fā)展，因此，分離，提取中藥中的有效成分是中藥開發(fā)的重要內(nèi)容。傳統(tǒng)的分離提取技術(shù)在無(wú)效成分的去除和有效成分的保留上，存在操作復(fù)雜，分離時(shí)間長(zhǎng)，效率低等不足。分子印記聚合物(molecularlyimprintedpolymers，mips)是模擬自然界中受體-抗體相互作用原理，通過(guò)分子印記技術(shù)合成的納米聚合物材料，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)模板分子或與模板分子結(jié)構(gòu)相似的分子特異性識(shí)別，選擇性吸附。在中藥成分分離，富集，提取等方面有很好的應(yīng)用前景。

磁性表面分子印記聚合物，采用沉淀聚合的方式，在聚合物的表面形成印記空穴，提高了mip結(jié)合速率，且利用磁性加快分離效率。中國(guó)專利(申請(qǐng)?zhí)?201019026093.4)用6-n-(2-羥基-3,5-二氯芐基)氨基苯并三氮唑或者4-n-(2-羥基-3,5-二氯芐基)氨基水楊酸為模板，合成了psd-95/nnos解偶聯(lián)劑分子印記聚合物，但合成的本體mip存在剛性低、不穩(wěn)定、吸附量小、操作繁瑣且需要研磨，印記位點(diǎn)易破壞等缺陷。而以磁性fe3o4為載體，zl006為模板，制備磁性表面分子印記聚合物作為人工受體，將其用于實(shí)際樣品中psd-95/nnos解偶聯(lián)劑的垂釣尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問(wèn)題：本發(fā)明提供一種磁性人工受體及其制備方法和應(yīng)用，具體來(lái)說(shuō)是從中藥中高效、特異性垂釣nnos-psd-95解偶聯(lián)劑的方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)nnos-psd-95解偶聯(lián)劑的選擇性捕獲，為找到活性顯著、毒副作用小的抗腦卒中候選藥物奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為中藥活性成分的的特異性和高效篩選提供新思路和新方法。

技術(shù)方案：一種磁性人工受體的制備方法，按比例關(guān)系，包括以下步驟：(1)fe3o4@sio2復(fù)合顆粒的制備：fecl3·6h2o和fecl2·4h2o用水熱法反應(yīng)制備得到fe3o4磁性納米粒，取0.3g制得的fe3o4磁性納米粒超聲分散于50ml乙醇中，加入2ml去離子水和2ml氨水，攪拌均勻后，以20μl/min的速度滴加5ml正硅酸乙酯，室溫下攪拌反應(yīng)12h，產(chǎn)物磁性分離，并用去離子水洗至中性，室溫真空干燥后備用；(2)fe3o4@sio2@mps復(fù)合顆粒的制備：取上述fe3o4@sio2復(fù)合顆粒0.5g超聲分散于50ml甲苯中，加入10ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，以500r/min的速度機(jī)械攪拌均勻，充入氮?dú)獬?5min，升溫至55℃，繼續(xù)攪拌反應(yīng)24h，產(chǎn)物磁性分離，用甲苯洗3次，甲醇洗3次，室溫真空干燥后備用；(3)磁性人工受體的制備：將模板分子和功能單體超聲分散于致孔劑中，室溫下避光靜置4h，形成預(yù)聚合溶液；充氮?dú)獬?5min，再加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，500r/min的速度機(jī)械攪拌溶解；取上述fe3o4@sio2@mps復(fù)合顆粒超聲分散于致孔劑中，邊攪拌邊加入到預(yù)聚合溶液中，50℃攪拌反應(yīng)1h，升高溫度至60℃，繼續(xù)攪拌反應(yīng)24h，產(chǎn)物用酸性洗脫液反復(fù)洗滌至檢測(cè)不到模板分子為止，甲醇洗至中性，真空干燥即得；其中模板分子為zl006，功能單體為甲基丙烯酸、丙烯酸、2-乙烯基吡啶、2-(三氟甲基)丙烯酸或4-乙烯基吡啶，交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯或三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，引發(fā)劑為偶氮二異丁腈，所述zl006與功能單體的摩爾比為1:4～1:9；功能單體與交聯(lián)劑的摩爾比為1:3～1:6；致孔劑與模板分子的摩爾量之比為100～300ml/mmol；引發(fā)劑用量為模板分子、功能單體和交聯(lián)劑總質(zhì)量的3％～5％；致孔劑為乙醇、乙腈、體積比1:1～9:1的乙腈-乙醇混合液或體積比1:1～9:1的乙腈-甲醇混合液；fe3o4@sio2@mps復(fù)合顆粒與模板分子的摩爾量之比為1:1～1:5g/mmol；酸性洗脫液為體積比為1:1～9:1的甲醇-冰醋酸混合溶液。

上述制備方法制得的磁性人工受體。

上述磁性人工受體在篩選中藥潛在抗腦卒中活性成分中的應(yīng)用。

應(yīng)用具體步驟為，將磁性人工受體超聲5～10min，均勻分散于預(yù)篩選中藥材的提取液中，將上述所得溶液置于振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化0.5～3小時(shí)后，磁性分離人工受體微球，淋洗液淋洗，去除人工受體微球表面的非特異性吸附組分，最后加入酸性溶劑振蕩洗脫，磁性分離洗脫液，得到具有潛在抗腦卒中活性的化學(xué)成分。

上述中藥材提取溶劑為各體積比的乙醇-水混合液、乙醇溶液，乙腈溶液或各體積比甲醇-水混合液，再加入甲苯稀釋作為提取液其中中藥材提取溶劑中還含有體積分?jǐn)?shù)50％～90％的甲苯。

上述中藥材的提取液與磁性人工受體的液質(zhì)比為1:4～1:20(ml/mg)，孵化溫度為20～40℃，振蕩培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速為100～200r/min。

上述淋洗液為乙醇、乙腈、甲苯、體積比1:1～9:1的甲苯-乙腈混合液或體積比1:1～9:1的甲苯-乙醇混合液。

上述酸性溶劑為體積比4:1～9:1的甲醇-冰醋酸的混合液，振蕩培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速為100～200r/min，洗脫時(shí)間為0.5～1小時(shí)，溫度為20～40℃。

有益效果：由于中藥體系是一個(gè)復(fù)雜的、化學(xué)成分多樣化的天然組合化合物庫(kù)，非特異性、非選擇性的體外化學(xué)成分分離-活性追蹤等傳統(tǒng)方法，從成千上萬(wàn)化學(xué)成分或藥材中找出對(duì)特定靶點(diǎn)有針對(duì)性作用的藥物或成分是一項(xiàng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作，本發(fā)明應(yīng)用分子印記技術(shù)構(gòu)建人工受體為“定向捕集”nnos-psd-95解偶聯(lián)提供了可能，大大提高天然藥物篩選的效率。

本發(fā)明以zl006為模板，在磁性納米硅膠材料的表面設(shè)計(jì)合成有序、致密分子印記殼層，減少了印記位點(diǎn)被“包埋”的現(xiàn)象，其結(jié)合速率和分離效率較高。同時(shí)將磁性材料、納米硅膠以及表面分子印記技術(shù)相結(jié)合，可在外磁場(chǎng)作用下實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)物質(zhì)的快速直接分離，為中藥活性物質(zhì)的選擇性快速分離富集與檢測(cè)提供了一種新的強(qiáng)有力手段。

磁性人工受體表面的空穴能夠從天然植物中分離出與之結(jié)構(gòu)相似的化合物，其他結(jié)構(gòu)的化合物不能被選擇吸附，提高了篩選天然活性成分的效率，且分離富集的化合物可作為臨床藥理研究的原料來(lái)源。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1用磁性人工受體垂釣虎杖提取液前后的高效液相色譜圖。

a虎杖提取液處理前后的高效液相色譜圖，b檢測(cè)化合物的結(jié)構(gòu)式。

圖2是磁性人工受體的靜態(tài)吸附等溫曲線。

圖3是磁性人工受體的吸附動(dòng)力學(xué)曲線圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖實(shí)施例及測(cè)試?yán)龑?duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

聚乙二醇200(peg-200)

正硅酸乙酯(teos)

甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(mps)

甲基丙烯酸(maa)

乙二醇二甲基丙烯酸酯(egdma)

偶氮二異丁腈(aibn)

實(shí)施例1

磁性人工受體的制備

制備fe3o4磁性納米粒：取fecl3·6h2o(4.72g)溶解于80ml去離子水中，通氮?dú)獬?5min，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，邊攪拌邊加入fecl2·4h2o(1.72g)，升高溫度至80℃，逐滴加入氨水10ml，繼續(xù)反應(yīng)1h，劇烈攪拌下加入2mlpeg-200溶液，反應(yīng)10min。利用磁性分離出fe3o4納米粒，去離子水洗至中性，分散于乙醇中備用。

fe3o4@sio2復(fù)合顆粒的制備：取干燥的fe3o4磁性納米粒(0.3g)超聲分散于50ml乙醇中，加入去離子水(2ml)，氨水(2ml)以200r/min速度機(jī)械攪拌均勻，以20μl/min的速度滴加teos(5ml)，室溫下攪拌反應(yīng)12h，產(chǎn)物磁性分離，用去離子水洗至中性，室溫真空干燥后備用。

fe3o4@sio2@mps復(fù)合顆粒的制備：取上述fe3o4@sio2復(fù)合顆粒(0.5g)超聲分散于50ml甲苯中，充入氮?dú)獬?5min，加入mps(10ml)，500r/min的速度機(jī)械攪拌均勻，升溫至55℃，繼續(xù)攪拌反應(yīng)24h，產(chǎn)物磁性分離，用甲苯洗3次，甲醇洗3次，室溫真空干燥后備用。

磁性人工受體(mip)的制備：將zl006(0.23g)和maa(0.36ml)超聲分散于乙腈-乙醇(8:2，v/v)混合溶液(30ml)中，室溫下避光靜置4h，形成預(yù)聚合溶液。充氮?dú)獬?5min，加入egdma(2.64ml)和aibn(0.13g)，500r/min的速度機(jī)械攪拌溶解。取上述fe3o4@sio2@mps復(fù)合顆粒(0.1g)超聲分散于乙腈-乙醇(8:2，v/v)混合溶液(20ml)中，邊攪拌邊加入到預(yù)聚合溶液中，50℃攪拌1h，升高溫度至60℃，繼續(xù)攪拌24h。產(chǎn)物用甲醇-冰醋酸(9:1，v/v)反復(fù)洗滌至zl006完全脫去。真空干燥即得mip。

磁性非人工受體(nip)的制備過(guò)程，除在合成過(guò)程中不添加模板分子外，其余步驟同mip。

以下所用mip和nip用此方法合成所得。

應(yīng)用1：

虎杖干燥后磨成粉，過(guò)200目篩。取虎杖粉末(2g)加入到乙醇(10ml)中加熱回流1h，粗提液過(guò)濾，補(bǔ)加乙醇至10ml，再加入9倍體積的甲苯稀釋得提取液。

磁性人工受體微球(100mg)超聲5min，均勻分散于虎杖提取液(5ml)中，將上述溶液置于振蕩培養(yǎng)箱中150r/min孵化2h，磁性分離出人工受體微球。加入甲苯(5ml)淋洗3次，磁性分離，去除殘留液。再加入甲醇-冰醋酸(9:1，v/v)(5ml)混合后置于振蕩培養(yǎng)箱中160r/min振蕩洗脫1h，磁性分離，收集洗脫液。將洗脫液蒸發(fā)至干，并復(fù)溶于乙醇(1ml)中。

取虎杖提取液(5ml)蒸發(fā)至干，復(fù)溶于乙醇(1ml)中，作為上樣液。將復(fù)溶后的上樣液和洗脫液分別用0.22μm尼龍濾膜濾過(guò)，再經(jīng)高效液相色譜法(hplc)檢測(cè)。色譜條件：色譜柱為wondacractods-2(5μm，4.6×250mm)分析柱；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20μl；流速1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：290nm(uv)；流動(dòng)相為水(a)-乙腈(b)；梯度洗脫，洗脫方法為：0～40min，b:17％～61％；40～55min，b：61％～100％，如圖1。

從圖1可以看出，洗脫液中化合物1、2、3、4、5因結(jié)構(gòu)與zl006相似被保留，說(shuō)明磁性人工受體對(duì)與模板結(jié)構(gòu)相似的化合物有選擇性，垂釣成功。

應(yīng)用2：

制何首烏干燥后磨成粉，過(guò)200目篩。取制何首烏粉末(1g)加入到乙醇(10ml)中加熱回流1h，粗提液過(guò)濾，補(bǔ)加乙醇至10ml，再加入9倍體積的甲苯稀釋得提取液。

磁性人工受體微球(20mg)超聲5min，均勻分散于制何首烏提取液(5ml)中，將上述溶液置于振蕩培養(yǎng)箱中150r/min孵化1h。磁性分離出人工受體微球，加入甲苯-乙腈(9:1，v/v)混合液(5ml)淋洗3次，磁性分離，去除殘留液。再加入甲醇-冰醋酸(9:1，v/v)(5ml)混合后置于振蕩培養(yǎng)箱中200r/min振蕩洗脫1h，磁性分離，收集洗脫液。將洗脫液蒸發(fā)至干，并復(fù)溶于乙醇(1ml)中。

取何首烏提取液(5ml)蒸發(fā)至干，并復(fù)溶于乙醇(1ml)中，作為上樣液。將復(fù)溶后的上樣液和洗脫液分別用0.22μm尼龍濾膜濾過(guò)，再經(jīng)高效液相色譜法(hplc)檢測(cè)。色譜條件：色譜柱為wondacractods-2(5μm，4.6×250mm)分析柱；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20μl；流速1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：290nm(uv)；流動(dòng)相為水(a)-乙腈(b)；梯度洗脫，洗脫方法為：0～40min，b:17％～61％；40～55min，b：61％～100％。

應(yīng)用3：

大黃干燥后磨成粉，過(guò)200目篩。取大黃粉末(1g)加入到乙醇(10ml)中加熱回流1h，粗提液過(guò)濾，補(bǔ)加乙醇至10ml，再加入5倍體積的甲苯稀釋得提取液。

磁性人工受體微球(80mg)超聲5min，均勻分散于虎杖提取液(5ml)中，將上述溶液置于振蕩培養(yǎng)箱中150r/min孵化2h。磁性分離出人工受體微球，加入甲苯(5ml)淋洗3次，磁性分離，去除殘留液。再加入甲醇-冰醋酸(9:1，v/v)(5ml)混合后置于振蕩培養(yǎng)箱中160r/min振蕩洗脫1h，磁性分離，收集洗脫液。將洗脫液蒸發(fā)至干，并復(fù)溶于1ml乙醇中。

取大黃提取液(5ml)蒸發(fā)至干，復(fù)溶于乙醇(1ml)中，作為上樣液。將復(fù)溶后的上樣液和洗脫液分別用0.22μm尼龍濾膜濾過(guò)，再經(jīng)高效液相色譜法(hplc)檢測(cè)。色譜條件：色譜柱為wondacractods-2(5μm，4.6×250mm)分析柱；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20μl；流速1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：320nm(uv)；流動(dòng)相為水(a)-乙腈(b)；梯度洗脫，洗脫方法為：0～40min，b:17％～53％；40～55min，b：53％～100％。

取上述合成的mip和nip進(jìn)行如下測(cè)試實(shí)驗(yàn)。

測(cè)試實(shí)施例1.靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

精密稱取mip與nip各5份(20.0mg)，置于15ml三角瓶中，磁性微球超聲10min分別均勻分散在0.5mmol/l，1.0mmol/l，3.0mmol/l，5.0mmol/l，7.0mmol/lzl006的乙腈-乙醇(8:2，v/v)混合溶液中，將上述溶液置于振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化1h，取上清液，經(jīng)0.22μm尼龍膜濾過(guò)，取續(xù)濾液稀釋定容，紫外-可見分光光度儀于305nm處測(cè)定樣品吸附前后的濃度，根據(jù)式(1)計(jì)算出平衡吸附量qe，平行操作三次。

式中：c0和ce分別為模板分子的起始濃度和平衡濃度(mmol/l)；v為吸附溶液的體積(ml)；m為印記聚合物的質(zhì)量(g)。

從圖2可以看出，mip的最大吸附量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于nip，說(shuō)明mip對(duì)zl006的吸附不同于物理吸附，而是一種有特異性識(shí)別位點(diǎn)的選擇性吸附，這種分子識(shí)別特性來(lái)自于該聚合物的結(jié)合基團(tuán)與模板分子的功能基之間的氫鍵作用和空穴的幾何選擇性。

測(cè)試實(shí)施例2.動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

精密稱取mip與nip各7份(20.0mg)，置于15ml三角瓶中，磁性微球超聲10min分別均勻分散于5.0mmol/lzl006的乙腈-乙醇(8:2，v/v)混合溶液中，將上述溶液置于振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化1h，取上清液，經(jīng)0.22μm尼龍膜濾過(guò)，取續(xù)濾液稀釋定容，紫外-可見分光光度儀于305nm處測(cè)定樣品吸附前后的濃度，根據(jù)式(1)計(jì)算出平衡吸附量qe，平行操作三次。

從圖3可以看出，隨著吸附時(shí)間的增加，印記材料對(duì)zl006的吸附量不斷上升，40分鐘后基本達(dá)到吸附平衡。實(shí)驗(yàn)表明，印記材料對(duì)zl006具有較快的吸附速率，與傳統(tǒng)分離和富集方式相比更加快速。