本發(fā)明屬于分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測貓皰疹病毒的方法，即通過篩選獲得的寡核苷酸引物，通過sybrgreeni熒光定量pcr方法檢測貓皰疹病毒。

背景技術(shù)：

貓皰疹病毒(fhv，貓鼻氣管炎)，該病毒主要侵害仔貓，能致發(fā)貓鼻氣管炎病，感染貓癥狀嚴重時，出現(xiàn)體溫升高，明顯的上呼吸道感染，病毒在病貓的鼻、咽喉、氣管和支氣管以及舌、結(jié)膜等的部位增殖。該病最早從美國發(fā)現(xiàn)，隨后在加拿大、英國、荷蘭、瑞士、匈牙利、越南等地發(fā)現(xiàn)和流行，我國已多次發(fā)現(xiàn)可疑病例，并分離到病毒。但目前在實驗動物國家標準及地方標準中，均沒有對實驗用貓的檢測要求及相關(guān)規(guī)定。

對于貓皰疹病毒病的診斷可根據(jù)本病的流行病學(xué)特點、臨診表現(xiàn)及典型病理變化做出初步診斷，若要進一步確診需要進行實驗室診斷。貓皰疹病毒病的實驗室診斷方法主要包括病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷。然而在病原學(xué)診斷方面，由于分離培養(yǎng)工作量相對較大，且病毒自身對外界環(huán)境的抵抗力較低，因此分離的成功率并不是非常高。分離培養(yǎng)之后的最為快捷、簡便的病毒電鏡鑒定也僅僅能夠觀察到病毒的病態(tài)結(jié)構(gòu)，無法完成同科病毒的區(qū)別；常用的血清學(xué)診斷方法主要有瓊脂擴散試驗、spa協(xié)同凝集試驗等，此類試驗只能粗略進行抗體的測定，而且靈敏度也不高。這就需要我國進一步加快研究步伐，加快推進貓皰疹病毒早期準確診斷的研究進程，努力開創(chuàng)貓皰疹病毒診斷的嶄新局面。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種檢測貓皰疹病毒的方法，即通過篩選獲得的寡核苷酸引物，通過sybrgreeni熒光定量pcr方法檢測貓皰疹病毒。

本發(fā)明首先提供一種用于檢測貓皰疹病毒的引物對，其上下游引物的序列分別為seqidno:1和seqidno:2，其具體序列信息如下：

上游引物：acgctacaattatactcaagccagaa(seqidno:1)

下游引物：tcagctgttatcttcggatcca(seqidno:2)

本發(fā)明的引物可以用來制備檢測貓皰疹病毒的生物制品，例如試劑盒；

本發(fā)明的引物對用于非疾病診斷和治療目的的貓皰疹病毒的檢測，其一種具體步驟如下：

1)提取待檢測的樣品的核酸備用；

2)使用上述的引物，進行sybrgreeni熒光定量pcr檢測，其中反應(yīng)體系由以下組分組成：

pcr反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，94℃變性50s，60℃退火45s，72℃延伸30s，共30個循環(huán)，72℃終延伸7min；

3)標準曲線的建立：

以貓皰疹病毒基因組為模板，使用上述的上游引物和下游引物進行擴增，將獲得的目的片段克隆到pmd18-t載體，制備標準品，以標準品為模板進行熒光定量pcr的擴增，建立標準曲線；

4)按照步驟3)的擴增條件對待檢測樣品進行pcr擴增，確定是否存在貓皰疹病毒。

本發(fā)明篩選的引物既能保證鑒定病原的正確，又不能漏檢同種不同株病原。另外，本發(fā)明的擴增片段長度適宜，既能在電泳中相互分開，又不太離散，避免多重pcr中優(yōu)先擴增小片段后阻礙長片段擴增的情形，同時引物二聚體等非特異性擴增產(chǎn)物很少。另外，通過熒光定量反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，得到特異性和靈敏性較高的fhv的熒光定量pcr檢測方法。經(jīng)最終實驗證實，本發(fā)明的熒光定量pcr方法由于引物設(shè)計和反應(yīng)體系的選取，敏感性較高，且成本低廉，能夠快速實現(xiàn)對fhv的特異性和敏感性檢測。

附圖說明

圖1：fhv基因片段的pcr擴增圖；

圖2：重組質(zhì)粒的pcr鑒定圖；

圖3：標準品的擴增曲線圖；

圖4：標準曲線圖；

圖5：標準品的溶解曲線圖。

具體實施方式

本發(fā)明在建立特異、敏感、快速、定量準確的fhvsybrgreeni熒光定量pcr檢測方法，通過分子生物學(xué)手段，開展對貓攜帶fhv核酸的檢測。雙鏈dna特異熒光染料sybrgreenⅰ實時熒光定量pcr法，可以和一切雙鏈dna特異性結(jié)合，可以選擇各種dna模板，價格便宜，不需要對探針進行設(shè)計。對今后開展實驗用貓的檢測工作及實驗貓標準化研究具有積極的促進作用，同時通過對fhv攜帶情況的檢測，為貓質(zhì)量控制標準的制定提供參考依據(jù)。

本發(fā)明所使用的毒株和臨床樣本信息如下：

貓皰疹病毒(fhv)購自美國attcc公司；貓細小病毒(fpv)、單純皰疹病毒ⅰ型(hsv-1)、犬皰疹病毒(chv)、豬偽狂犬病毒(prv)由中國食品藥品檢定研究院實驗動物質(zhì)量檢測室提供。

主要試劑和儀器信息如下：

sybrpremixextaq、taq聚合酶、dntps、pmd18-t載體、膠回收試劑盒等購自takara寶生物工程(大連)有限公司；凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒大量提取試劑盒均購于omega公司；depc購自sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

超凈工作臺(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司、dl-cj-2fn)；熒光定量pcr儀lightⅱ(roche)；42℃可調(diào)恒溫水浴鍋(北京市長風儀器公司、hw.sy21-k)；高速離心機(長沙市湘儀離心機有限公司、h2050r-1)；電子天平(上海?？惦娮觾x器廠、yb202n)；dyy-ⅲ-7型電泳儀(北京六一儀器廠)；紫外凝膠成像系統(tǒng)(美國genegeniusuvp型)；uv2550型紫外可見分光光度計(日本島津公司)。

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。

實施例1：引物的設(shè)計和篩選

通過dnastar軟件中的meglign比對genbank中登錄的fhv-1c-27株基因(序列fj478159)，利用primerpremier5.0軟件，pcr引物和taqman探針序列，使用熒光基團作為探針的發(fā)光基團，以對應(yīng)的熒光定量pcr儀的不同波長段用于檢測。設(shè)計并合成一對fhv的特異性引物p1/p2。對所設(shè)計的引物進行以下分析：引物間的干擾，發(fā)卡結(jié)構(gòu)和二聚體。并通過ncbi的blast功能對其特異性進行初步鑒定。經(jīng)篩選，排除了引物自身及引物之間存在互補序列、擴增產(chǎn)物的單鏈能形成二級結(jié)構(gòu)的引物，選留如下表1所示的引物及探針序列。引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，用depc水稀釋到10pmol/μl，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1：特異性引物p1/p2

2.2臨床樣本處理

以棉花棒抹取咽喉、眼睛、鼻分泌物或潰瘍傷口獲取樣品，加適量滅菌的pbs稀釋后，充分反復(fù)凍融3次，5000rpm離心20min，取上清(病毒懸液)，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3dna提取

采用takara公司的dnaisoreagent試劑提取樣品中dna。主要步驟：

1.樣品處理，若是含有液體采樣管，則直接進行下一步；若無液體，需加1ml的pbs緩沖液，振蕩混勻，進行下一步；

2.取上清500μl，再加500μl裂解液dnaisoreagent于1.5ml離心管中，顛倒混勻6～8次，靜置10min；

3.離心10000g，10min；

4.取上清800μl，加到另一干凈的1.5ml離心管中，再加入300μl無水乙醇，顛倒混勻5～6次，離心4000g，2min；

5.倒上清，留沉淀，加75％酒精1ml，顛倒混勻5～8次，離心12000g，5min；

6.倒上清，用吸水紙吸干，晾5min；

7.加ddh2o，20μl，加的過程中邊轉(zhuǎn)邊吹打，獲得dna并保存(-20℃)。

2.4標準陽性質(zhì)控品的制備

2.4.1目的基因片pcr擴增

以fhv-1c-27基因組為模板、p1和p2為引物，應(yīng)用常規(guī)pcr方法對fhv-1c-27株基因(序列fj478159)進行擴增。pcr擴增的反應(yīng)體系及條件如下：

pcr反應(yīng)體系

pcr反應(yīng)條件

2.4.2目的片段膠回收

將擴增后的基因片段pcr產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖eb凝膠電泳分離后進行切取，操作步驟參照omega公司膠回收試劑盒的說明，如下：

在紫外凝膠成像儀下，切取片段置于滅菌的1.5mleppendorf管中，加入bindingbuffer，置于60℃水浴10min，使凝膠完全融化，將融化后的液體轉(zhuǎn)移到吸附柱中，并把吸附柱放于2ml離心管中，12000×g離心1min；棄濾液，將吸附柱再放回離心管中，再加入300μlbindingbuffer到吸附柱中，12000×g離心1min；棄濾液，將吸附柱重新套回離心管中，加入700μlspwwashbuffer(使用前嚴格的按照要求加入無水乙醇并混勻)，12000×g離心1min；重復(fù)上步，棄濾液，將吸附柱重新套回離心管中，12000×g離心2min；最后把柱子置于1.5ml離心管內(nèi)，并加入35μlelutionbuffer，12000×g離心1min。洗脫純化的dna產(chǎn)物，-70℃凍存?zhèn)溆?/p>

2.4.3純化產(chǎn)物與t載體連接

分別將上述膠回收純化的產(chǎn)物與載體pmd18-t連接，放置于連接儀中，16℃過夜。連接體系如下：

solutionⅰ5μl

pmd18-t載體1μl

膠回收純化的產(chǎn)物4μl

2.4.4連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

⑴從-70℃冰箱中取出感受態(tài)細胞jm109，置37℃水浴中，細胞一經(jīng)融化，立即把離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，放置10min。

⑵用一預(yù)冷的無菌吸頭，把感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的無菌微離心，管中，置冰浴中。

⑶將重組dna加入到感受態(tài)細胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)幾次，混勻內(nèi)容物，在冰上放置30min。

⑷將管放到42℃的水浴內(nèi)，熱激90s，不要搖動。

⑸迅速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冷卻1～2min。

⑹每管加200μl的lb培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫至37℃，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育45min，以最大限度地提高轉(zhuǎn)化率，復(fù)蘇期間應(yīng)溫和地搖動細胞(轉(zhuǎn)速≤225r/min)。

⑺將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移到amp平板上，涂勻，每樣60μl。

⑻將平板置于37℃溫箱中，直至液體充分吸收后，倒置平皿培養(yǎng)16～18h。

⑼用滅菌牙簽挑取可疑菌落接種于含amp(100μg/ml)液體lb培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒進行酶切鑒定。取部分菌液加入終濃度30％的甘油保存菌種。

質(zhì)粒的小量提取用minipreps小量質(zhì)粒純化試劑盒提取質(zhì)粒具體操作按使用說明書進行。將提取純化質(zhì)粒用于熒光測序。測序由聯(lián)合基因科技有限公司完成。

2.4.5pcr鑒定

在無菌條件下分別取200μl的菌液于1.5mlep管中，在沸水中水浴5min后冰浴2min，5000rpm離心5min。取上清作為模板，反應(yīng)體系和條件如下：

pcr反應(yīng)體系

pcr反應(yīng)條件

將pcr鑒定為陽性的克隆送北京華大基因研究中心有限公司測序，測序為陽性的重組質(zhì)粒進行保存，備用。

2.4.6質(zhì)粒的大量提取純化對測序鑒定為陽性克隆的重組質(zhì)粒進行質(zhì)粒的大量制備，按maxipreps試劑盒說明書進行大量質(zhì)粒純化。

2.5實時熒光定量pcr標準曲線的建立

2.5.1熒光定量pcr反應(yīng)體系的優(yōu)化

熒光定量pcr反應(yīng)體系的優(yōu)化主要針對引物的最佳濃度進行優(yōu)化，熒光定量pcr反應(yīng)體系為20μl，引物濃度分別按終濃度為0.8μm(引物各加1.6μl)、0.4μm(引物各加0.8μl)和0.2μm(引物各加0.4μl)的劑量進行優(yōu)化。

2.5.2熒光定量pcr反應(yīng)程序的優(yōu)化

在熒光定量pcr反應(yīng)中，根據(jù)premixextaqtmⅱ(perfectrealtime)試劑盒說明書中提供的儀器反應(yīng)參數(shù)對熒光定量pcr反應(yīng)程序進行優(yōu)化，調(diào)整退火溫度及退火時間，確定最佳反應(yīng)條件。其中退火溫度在58℃～62℃范圍內(nèi)進行優(yōu)化，退火時間在20s～30s范圍內(nèi)進行優(yōu)化。

2.5.3標準曲線的構(gòu)建

將標準品質(zhì)粒按10倍梯度稀釋，得到1×10¹⁰、1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴個拷貝/μl系列標準模板，采用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和程序進行熒光定量pcr反應(yīng)，得到相應(yīng)的cq值，其中cq值作為縱坐標，把起始模板濃度的對數(shù)作為橫坐標，制作標準曲線。

2.6fhv-1熒光定量pcr檢測方法的建立

標準品稀釋成倍數(shù)為10¹⁰～10⁴作為模板并設(shè)置3個平行重復(fù)，用熒光定量pcr儀器進行sybrgreenⅰ熒光pcr擴增。反應(yīng)體系為20μl，2×sybrpremixextaq為10.0μl，上下游引物各為0.4μl(10μm)，ddh2o為7.2μl，混合均勻。反應(yīng)程序為stage1:預(yù)變形95℃30s，1個循環(huán)；stage2：pcr反應(yīng)95℃5s、60℃30s，40個循環(huán)；stage3：溶解曲線的分析95℃0、65℃15s、95℃0s。反應(yīng)結(jié)束后處理獲得的數(shù)據(jù)，并得到相應(yīng)樣品和標準品的數(shù)據(jù)，同時熒光定量pcr結(jié)束后，pcr產(chǎn)物與溴酚藍緩沖液按比例混勻，用2.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并用生物電泳圖像分析儀器進行拍照分析。

以空白對照不出現(xiàn)陽性為準來調(diào)節(jié)擴增曲線的基線，通常取3～15個循環(huán)的熒光信號平均值作為基線的調(diào)整。縱坐標是以基線可擴增曲線交點的循環(huán)次數(shù)cq值，橫坐標是dna濃度的對數(shù)值，制作標準曲線。熒光定量pcr檢測以cq值>31判定為陰性，其中cq值<31且擴增曲線良好可直接判定為陽性；cq值在30～31之間的需重復(fù)試驗，兩次試驗均能得到良好的s型擴增曲線，可判定為陽性。

2.6特異性試驗

選取部分重要的貓病毒性傳染病病原，主要為dna病毒，包括fpv、hsv-1、chv、prv4種貓病病毒作為熒光定量pcr特異性試驗的檢測毒株，已鑒定的fhv-1做陽性對照，同時設(shè)定空白對照，特異性試驗平行做3次重復(fù)。

2.7敏感性試驗

將fhv作10^-1～10^-12倍稀釋，震蕩混合均勻后，將稀釋好的病毒液接種到已鋪滿單層lmh細胞的96孔板中(每個稀釋度做8個平行重復(fù))，于37℃、co2細胞培養(yǎng)箱中吸附2h，棄掉含吸附液后，每孔加100μldmem細胞培養(yǎng)液(2％血清)，于37℃、co2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5d。同時每天觀察細胞病變且記錄。按reedmuench方法計算病毒tcid50，結(jié)果為10⁸tcid50/ml。

取感染滴度為10⁸tcid50/mlfhv-1病毒液，用pbs做10倍梯度稀釋，稀釋范圍為10^-1～10^-12。以上述樣品的基因組作為模板，按照優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行熒光定量pcr反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳進行分析。同理對上述樣品進行常規(guī)pcr檢測，并與熒光定量pcr敏感性進行比較。對反應(yīng)產(chǎn)物進行電泳分析后與熒光定量pcr產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果進行比較，分析兩種檢測方法在敏感性上的差異。

2.8穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗

組內(nèi)重復(fù)性試驗中對稀釋的標準品濃度為10¹⁰拷貝/μl～10⁴拷貝/μl的基因組作為模板進行3個平行重復(fù)，在相同反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下完成熒光定量pcr的檢測。組間重復(fù)性試驗將3次梯度稀釋濃度為10¹⁰拷貝/μl～10⁴拷貝/μl的標準品的基因組作為模板在相同反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下進行3次熒光定量pcr檢測。分別計算出cq值的變異系數(shù)cv％來驗證檢測體系的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

3結(jié)果與分析

目的片段pcr擴增

fhvc-27株基因(序列fj478159)經(jīng)pcr擴增得到的產(chǎn)物，經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠成像儀下觀察，以dl2000maker為標準，在約200bp處出現(xiàn)一特異性條帶，與預(yù)期大小206bp符合，初步判定為fhvc-27株基因片段，結(jié)果見圖1。

重組質(zhì)粒的鑒定

fhvc-27株基因片段克隆至pmd18-t載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)pcr鑒定，在約200bp處分別出現(xiàn)一特異性條帶，與預(yù)期片段大小206bp(如圖2)。經(jīng)測序鑒定，構(gòu)建的重組質(zhì)粒中正確插入目的基因片段。

3.1fhvqpcr檢測方法的最終反應(yīng)條件的確定

通過反復(fù)多次qpcr反應(yīng)過程中的退火溫度、延伸時間、循環(huán)次數(shù)等條件的優(yōu)化，確定了fhvpcr最佳反應(yīng)體系(見表2)。最佳擴增條件：95℃預(yù)變性30s，94℃變性5s，60℃退火20s，72℃延伸90s，共30個循環(huán)，72℃終延伸10min。通過建立的體系以fhv毒株提取的dna作為模板，進行qpcr擴增，擴增出的基因片段大小與預(yù)期大小相符。pcr產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司測序，結(jié)果與genbank發(fā)表的fhv基因序列的同源性在98.7～99.6％。

表2fhvqpcr反應(yīng)體系

3.2標準陽性質(zhì)控品的制備

陽性克隆經(jīng)測序進行鑒定，測序結(jié)果與genbank中fhv-1標準株核苷酸序列進行比對，其同源性均為100％。說明成功制備了陽性質(zhì)粒標準品，可作為熒光定量pcr檢測的標準對照品。

3.3熒光定量pcr標準曲線的建立

以10倍梯度稀釋的質(zhì)粒濃度為1×10¹⁰拷貝/μl～1×10⁴拷貝/μl作為標準品進行擴增，可得到較整齊的擴增曲線(如圖3)，擴增效率為1.904，斜率為-3.575，表明質(zhì)粒濃度從10⁴～10¹⁰拷貝/μl具有良好的線性關(guān)系(如圖4)。

對于溶解曲線的分析，溫度在80℃時出現(xiàn)單一特異峰并且無引物二聚體及非特異性峰(如圖5)。熒光定量pcr擴增完成后，pcr產(chǎn)物用2.0％瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定，結(jié)果顯示標準品均200bp處存在條帶，與熒光定量pcr判定結(jié)果一致。

3.4sybrgreenipcr檢測方法的特異性、敏感性、重復(fù)性試驗結(jié)果

3.4.1熒光定量pcr檢測方法特異性檢測

熒光定量pcr對fhv-1基因組擴增的cq值均小于31，且擴增曲線明顯，判定為陽性。陰性對照crfk細胞，為直線無擴增。熒光定量pcr對fpv、hsv-1、chv、prv的基因組作為模板進行擴增，均為直線無擴增，即判定為陰性。同時對上述熒光定量pcr擴增結(jié)果進行2％瓊脂糖凝膠的電泳，結(jié)果表明，含有fhv-1基因組的樣品均在約200bp處檢測到特異性條帶，其它4種貓病病毒基因組樣品未檢測到擴增片段，結(jié)果與熒光定量pcr判定結(jié)果一致。因此，說明本研究建立的fhv熒光定量pcr檢測方法具有良好的特異性。

3.4.2熒光定量pcr檢測方法敏感性檢測

以稀釋濃度范圍分別為10^-1～10^-12的不同稀釋度病毒基因組及其基因組的原液為模板進行fhv-1熒光定量pcr檢測，并應(yīng)用lightcycler480軟件進行數(shù)據(jù)處理，得到的平均cq值。結(jié)果表明，fhv-1稀釋度在10^-1～10^-6時能夠得到有效擴增，平均cq值均小于31。對fhv的檢測下限為10^-6稀釋，相當于10²tcid50/ml。對上述熒光定量pcr擴增結(jié)果進行2％瓊脂糖凝膠的電泳，濃度為10^-1～10^-6fhv-1基因組樣品均檢測到約206bp的條帶。同理進行常規(guī)pcr檢測及電泳分析，結(jié)果濃度為10^-1～10^-5的fhv-1種的基因組樣品在大約200bp附近均存在一條特異性條帶，與預(yù)期片段大小為206bp相符，因此其靈敏度到達稀釋度為10³tcid50/ml。說明本研究建立的檢測fhvsybrgreeni熒光定量pcr的方法具有較高的敏感性。

表不同稀釋度fhv種的cq值

3.4.3熒光定量pcr檢測方法重復(fù)性和穩(wěn)定性檢測

對10倍梯度稀釋1×10¹⁰拷貝/μl～1×10⁴拷貝/μl的標準品進行熒光定量pcr的組內(nèi)重復(fù)性試驗級組間重復(fù)性試驗，檢測cq值的變異系數(shù)(cv％)均小于5％。證明本研究建立的熒光定量pcr檢測方法重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。

本發(fā)明成功建立了一種fhvsybrgreeni熒光定量pcr檢測方法，結(jié)果表明所建立的方法能快速準確地檢測fhv。根據(jù)上述研究結(jié)果，本研究所建立的sybrgreeni熒光定量pcr檢測方法具有很好的應(yīng)用性。

sequencelisting

<110>青島農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種檢測貓皰疹病毒的方法

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