本發(fā)明涉及生物柴油制備技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種微藻油脂的提取方法。

背景技術(shù)：

微藻具有光合作用效率高、生長速率快、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)和油脂產(chǎn)率高等優(yōu)勢(shì)，是最有潛力的生物柴油原料?，F(xiàn)有技術(shù)一般采用有機(jī)溶劑萃取法來提取微藻中的油脂。然而，大多數(shù)種類的微藻細(xì)胞具有纖維素性細(xì)胞壁，細(xì)胞壁厚且質(zhì)地堅(jiān)硬，將微藻油脂包裹在其中，如果直接使用傳統(tǒng)有機(jī)溶劑萃取微藻油脂，在萃取過程中微藻細(xì)胞的細(xì)胞壁難以破裂，導(dǎo)致從細(xì)胞中釋放的微藻油脂量少，造成提取效率偏低。因此，若要進(jìn)一步提高有機(jī)溶劑萃取法對(duì)微藻油脂的提取效率，往往需要在萃取前對(duì)微藻細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，使微藻細(xì)胞壁在萃取時(shí)更容易破裂。

現(xiàn)有技術(shù)中已出現(xiàn)用酸或堿對(duì)微藻細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理的方法。微藻細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分是纖維素和半纖維素。硫酸、鹽酸等能導(dǎo)致纖維素和半纖維素發(fā)生水解，從而降低纖維素和半纖維素的聚合度和結(jié)晶度，使微藻細(xì)胞壁發(fā)生降解因此在萃取過程中更容易破裂。氫氧化鈉、氫氧化鉀等能削弱纖維素與半纖維素之間的氫鍵，同樣能使微藻細(xì)胞壁發(fā)生降解。但是，酸或堿會(huì)腐蝕生產(chǎn)設(shè)備，而且微藻細(xì)胞預(yù)處理所產(chǎn)生的廢水的酸堿濃度下降，難以回收利用，直接排放又會(huì)對(duì)水體、農(nóng)田等環(huán)境造成污染，必須經(jīng)過處理才能排放。

離子液體，是指由陰陽離子組成的室溫熔鹽，其具有不揮發(fā)、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、寬電化學(xué)電位窗口及性質(zhì)可調(diào)控性等優(yōu)點(diǎn)。離子液體對(duì)生物材料，包括纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等都表現(xiàn)出良好的溶解性，目前已嘗試用離子液體對(duì)微藻細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。常見的應(yīng)用較多的是咪唑類、吡啶類離子液體，此類離子液體的主要原料如烷基取代咪唑、烷基取代吡啶等來源于石油，大多是揮發(fā)性有機(jī)物，并且價(jià)格昂貴。離子液體的制備方法有直接合成法、間接合成法、微波合成法、超聲波合成法和電化學(xué)合成法等，這些制備方法過程復(fù)雜，通常需要用到揮發(fā)性溶劑，合成過程中易產(chǎn)生污染環(huán)境的物質(zhì)，并且耗能高。有研究表明，離子液體具有毒性并且生物降解性差。以上缺點(diǎn)嚴(yán)重限制了離子液體在微藻細(xì)胞預(yù)處理中的廣泛應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明的目的在于，提供一種微藻油脂的提取方法，該提取方法選用低共熔溶劑對(duì)微藻細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，并結(jié)合有機(jī)溶劑提取微藻油脂的技術(shù)，具有成本低和提取率高的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種微藻油脂的提取方法，包括以下步驟：

(1)預(yù)處理：取低共熔溶劑與微藻藻粉混合均勻，室溫下攪拌混合液，然后對(duì)混合液進(jìn)行離心分離，將所得固相冷凍干燥后，得到經(jīng)過預(yù)處理的微藻藻粉；所述低共熔溶劑由氫鍵受體和氫鍵供體混合加熱制得，所述氫鍵受體為氯化膽堿、甜菜堿和季銨鹽中的一種或多種組合，所述氫鍵供體為多元醇、羧酸類化合物和酰胺類化合物中的一種或多種組合；

(2)油脂提?。簩⒔?jīng)過預(yù)處理的微藻藻粉和有機(jī)溶劑加入提取罐中，加熱進(jìn)行提??；

(3)后處理：將油脂提取后所得的提取液冷卻至室溫，再加入去離子水，攪拌后靜置，最后取上層有機(jī)相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸去有機(jī)溶劑，得到微藻油脂。

低共熔溶劑(deepeutecticsolvent,des)是由氫鍵受體和氫鍵供體通過氫鍵作用相互締合形成的，由于組分間形成的氫鍵和范德華力阻礙了體系的再結(jié)晶，進(jìn)而降低了體系的熔點(diǎn)，因此低共熔溶劑的熔點(diǎn)低于各組分的熔點(diǎn)，其在常溫條件下通常以液態(tài)的形式存在，所以預(yù)處理可以在室溫下進(jìn)行，方便操作。

在預(yù)處理過程中，低共熔溶劑中的氫鍵受體與纖維素分子鏈、半纖維素分子鏈上的羥基形成了氫鍵作用，使得纖維素和半纖維素的分子間及各自分子內(nèi)的氫鍵作用減弱，從而降低了纖維素和半纖維素的聚合度和結(jié)晶度，使微藻細(xì)胞壁發(fā)生降解因此在步驟(2)油脂提取的過程中更容易破裂，更容易釋放出微藻油脂，進(jìn)而有效提高提取率。

本發(fā)明選用低共熔溶劑對(duì)微藻細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，相比于酸、堿試劑，低共熔溶劑在預(yù)處理的離心操作后可直接循環(huán)使用，降低了生產(chǎn)成本和后處理成本，相比于離子液體，低共熔溶劑由原料混合加熱制得，制備方法簡單、耗能低，制備過程中不需要用到揮發(fā)性溶劑，并且無副產(chǎn)物產(chǎn)生，因此更綠色環(huán)保。本發(fā)明提供的微藻油脂的提取方法解決了酸、堿和離子液體預(yù)處理微藻的成本偏高和污染環(huán)境的難題，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述低共熔溶劑中的氫鍵受體為氯化膽堿，氫鍵供體為甘油、乙二酸、檸檬酸、乳酸或尿素，所述氫鍵受體和氫鍵供體的摩爾比為1:1～3。

氯化膽堿的分子式為hoch2ch2n(ch3)3cl，是常用的低共熔溶劑氫鍵受體，其來源易得，常作為禽畜飼料添加劑，也是一種植物光合作用促進(jìn)劑，無毒無害，對(duì)環(huán)境友好。在預(yù)處理中，氯化膽堿中的cl^-與纖維素或半纖維素中的羥基氫形成o—h…cl^-連接，實(shí)現(xiàn)降低纖維素和半纖維素的聚合度和結(jié)晶度，使微藻細(xì)胞壁發(fā)生降解的目的。甘油、乳酸、尿素都是人體和動(dòng)物的代謝產(chǎn)物，無毒無害。乙二酸、檸檬酸廣泛存在與植物體中，無毒無害，對(duì)環(huán)境友好。

低共熔溶劑的熔點(diǎn)隨氫鍵供體與氫鍵受體形成氫鍵的能力增強(qiáng)而降低，與組分間的配比也密切相關(guān)。低共熔溶劑的熔點(diǎn)越低，其在室溫下的操作溫度范圍越大，使預(yù)處理可以在較寬的室溫范圍內(nèi)下進(jìn)行。此外，低共熔溶劑由于組分之間的氫鍵作用，流動(dòng)性降低，其黏度也和組分間的配比有關(guān)，如果低共熔溶劑的黏度過大，不利于預(yù)處理中離心分離操作的進(jìn)行及分離效果。本發(fā)明通過選用合適的氫鍵供體和氫鍵受體，并將氫鍵受體與氫鍵供體的配比調(diào)整至適宜范圍，使低共熔溶劑獲得較低的熔點(diǎn)和黏度。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述微藻藻粉為小球藻、綠球藻或柵藻。所述微藻藻粉為市售產(chǎn)品或培育所得。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述微藻藻粉按質(zhì)量百分比計(jì)的含水率為1％～3％，總脂含量為10％～25％。以干燥的微藻藻粉為原料，能減少水分對(duì)預(yù)處理過程造成的不良影響。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述低共熔溶劑與微藻藻粉的用量比為(5～10)ml低共熔溶劑:1g微藻藻粉，保證有足夠的低共熔溶劑與微藻細(xì)胞壁作用，同時(shí)減少不必要的低共熔溶劑用量，減少離心分離的處理量，降低能耗。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，室溫下攪拌混合液的時(shí)間為12h～72h，避免處理時(shí)間過短，低共熔溶劑對(duì)微藻細(xì)胞壁的降解效果不足，也避免處理時(shí)間過長，微藻細(xì)胞壁在預(yù)處理時(shí)就提前破裂，釋放出微藻油脂與低共熔溶劑混合，兩者難以分離，不利于微藻油脂的提取。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，冷凍干燥的溫度為-80℃～-40℃，時(shí)間為24h～48h，既確保微藻藻粉中的油脂品質(zhì)不被破壞，又能徹底除去水分，避免水分對(duì)油脂提取過程造成不良影響。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，步驟(2)中，所述有機(jī)溶劑為正己烷、乙酸乙酯、乙醇和甲醇中的一種或多種組合。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述有機(jī)溶劑與微藻藻粉的用量比為(10～40)ml有機(jī)溶劑:1g微藻藻粉，保證有足夠的有機(jī)溶劑充分萃取微藻油脂，同時(shí)減少不必要的有機(jī)溶劑用量，減少后處理的處理量，降低能耗。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，加熱進(jìn)行提取的溫度為50℃～90℃，時(shí)間為0.25h～2.5h，適宜的提取條件有助于提高有機(jī)溶劑對(duì)微藻油脂的提取率。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

制備低共熔溶劑：按1:1的摩爾比將氯化膽堿和尿素混合均勻，在90℃恒溫下加熱攪拌2h，得到無色透明液體，冷卻至室溫后得到低共熔溶劑。

微藻油脂的提取按以下步驟進(jìn)行：

(1)預(yù)處理：按5ml低共熔溶劑:1g小球藻藻粉的用量比，取制備好的低共熔溶劑與小球藻藻粉混合均勻，在室溫23℃～28℃下磁力攪拌混合液24h，然后以10000rpm的轉(zhuǎn)速對(duì)混合液離心處理10min，取下層固相。再用去離子水洗滌下層固相3次，每次洗滌后以6000rpm的轉(zhuǎn)速對(duì)洗滌混合液離心處理10min，然后將洗滌好的固相置于-80℃的冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48h，得到經(jīng)過預(yù)處理的小球藻藻粉。

(2)油脂提?。喊?0ml正己烷:1g小球藻藻粉的用量比，將正己烷和經(jīng)過預(yù)處理的小球藻藻粉加入提取罐中，在50℃下提取2h。

(3)后處理：將油脂提取后所得的提取液冷卻至室溫，再加入去離子水，攪拌10min后靜置，最后取上層有機(jī)相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸去正己烷，得到小球藻油脂。

本實(shí)施例中，所用的原料小球藻藻粉按質(zhì)量百分比計(jì)的含水率為1.05％，總脂含量為10.33％，總碳水化合物含量為33.03％。

本實(shí)施例的小球藻藻粉油脂提取率為75.52％。

實(shí)施例2

制備低共熔溶劑：按1:2的摩爾比將氯化膽堿和甘油混合均勻，在80℃恒溫下加熱攪拌2h，得到無色透明液體，冷卻至室溫后得到低共熔溶劑。

微藻油脂的提取按以下步驟進(jìn)行：

(1)預(yù)處理：按25ml低共熔溶劑:1g綠球藻藻粉的用量比，取制備好的低共熔溶劑與綠球藻藻粉混合均勻，在室溫23℃～28℃下磁力攪拌混合液24h，然后以10000rpm的轉(zhuǎn)速對(duì)混合液離心處理10min，取下層固相。再用去離子水洗滌下層固相3次，每次洗滌后以6000rpm的轉(zhuǎn)速對(duì)洗滌混合液離心處理10min，然后將洗滌好的固相置于-80℃的冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48h，得到經(jīng)過預(yù)處理的綠球藻藻粉。

(2)油脂提取：按10ml乙酸乙酯:1g綠球藻藻粉的用量比，將乙酸乙酯和經(jīng)過預(yù)處理的綠球藻藻粉加入提取罐中，在50℃下提取2h。

(3)后處理：將油脂提取后所得的提取液冷卻至室溫，然后加入去離子水，攪拌10min后靜置，最后取上層有機(jī)相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸去乙酸乙酯，得到綠球藻油脂。

本實(shí)施例中，所用的原料綠球藻藻粉按質(zhì)量百分比計(jì)的含水率為2.25％，總脂含量為20.58％，總碳水化合物含量為34.18％。

本實(shí)施例的綠球藻藻粉油脂提取率為80.90％。

實(shí)施例3

制備低共熔溶劑：按1:3的摩爾比將氯化膽堿和乙二酸混合均勻，在70℃恒溫下加熱攪拌2h，得到無色透明液體，冷卻至室溫后得到低共熔溶劑。

微藻油脂的提取按以下步驟進(jìn)行：

(1)預(yù)處理：按40ml低共熔溶劑:1g柵藻藻粉的用量比，取制備好的低共熔溶劑與柵藻藻粉混合均勻，在室溫23℃～28℃下磁力攪拌混合液72h，然后以10000rpm的轉(zhuǎn)速對(duì)混合液離心處理10min，取下層固相。再用去離子水洗滌下層固相3次，每次洗滌后以6000rpm的轉(zhuǎn)速對(duì)洗滌混合液離心處理10min，然后將洗滌好的固相置于-80℃的冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48h，得到經(jīng)過預(yù)處理的柵藻藻粉。

(2)油脂提?。喊?0ml乙酸乙酯-乙醇混合溶劑:1g柵藻藻粉的用量比，將乙酸乙酯-乙醇混合溶劑和經(jīng)過預(yù)處理的柵藻藻粉加入提取罐中，在50℃下提取2h。所述乙酸乙酯-乙醇混合溶劑中，乙酸乙酯與乙醇的體積比為1:1。

(3)后處理：將油脂提取后所得的提取液冷卻至室溫，然后加入去離子水，攪拌10min后靜置，最后取上層有機(jī)相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸去乙酸乙酯-乙醇混合溶劑，得到柵藻油脂。

本實(shí)施例中，所用的原料柵藻藻粉按質(zhì)量百分比計(jì)的含水率為3.00％，總脂含量為24.67％，總碳水化合物含量為36.78％。

本實(shí)施例的柵藻藻粉油脂提取率為66.92％。

對(duì)比例1

本對(duì)比例提取微藻油脂省去了步驟(1)預(yù)處理，其他步驟、原料、試劑及工藝參數(shù)均與實(shí)施例1的相同。

本對(duì)比例的小球藻藻粉油脂提取率為52.3％。

對(duì)比例2

本對(duì)比例提取微藻油脂省去了步驟(1)預(yù)處理，其他步驟、原料、試劑及工藝參數(shù)均與實(shí)施例2的相同。

本對(duì)比例的綠球藻藻粉油脂提取率為54.83％。

對(duì)比例3

本對(duì)比例提取微藻油脂省去了步驟(1)預(yù)處理，其他步驟、原料、試劑及工藝參數(shù)均與實(shí)施例3的相同。

本對(duì)比例的柵藻藻粉油脂提取率為55.46％。

本發(fā)明選用低共熔溶劑對(duì)微藻細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，使油脂提取率從不經(jīng)過預(yù)處理時(shí)的52.03％～55.46％提高至66.92％～80.90％。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提高了微藻油脂提取工藝的環(huán)保性和可持續(xù)性，其經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益可觀。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。