本發(fā)明涉及海洋生物多糖技術(shù)領(lǐng)域，具體來說涉及一種綠藻多糖及其制備方法。

背景技術(shù)：

海藻自古就在我國(guó)沿海民間直接用作藥材醫(yī)治各種疾病，有關(guān)海藻中有效成分的分離及其化學(xué)組成的研究，始于上世紀(jì)50年代中期。至今，從海藻中分離出的各種化合物中，多糖類化合物占有重要地位。多糖作為海藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)的主要支撐物質(zhì)，大量存在于其細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)中。由于海藻多糖獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，引起人們的廣泛關(guān)注。有關(guān)海藻多糖的化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)和生物活性已被大量研究。但是，這些研究主要集中于來自于各種褐藻和紅藻的多糖，而有關(guān)綠藻中的多糖的研究極少。

目前，綠藻多糖的研究主要集中于綠藻中的石莼屬、松藻屬、滸苔屬、礁膜屬、蕨藻屬和剛毛藻屬中的藻類，其化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)隨著綠藻種類的不同而不同，已有資料表明這些多糖主要分為兩類：木糖-阿拉伯糖-半乳糖聚合物，這類多糖以阿拉伯糖和半乳糖為主要組分，并含有較高的硫酸根，其代表藻類為松藻、蕨藻和剛毛藻等；葡萄糖醛酸-木糖-鼠李糖聚合物，此類多糖以鼠李糖、木糖和葡萄糖醛酸為主要組分，代表藻屬為石莼、礁膜、滸苔和頂管藻等。由于綠藻多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和不均一性，大大限制了對(duì)其深入研究。迄今尚未見有關(guān)從綠藻中提取分離到由葡萄糖醛酸和鼠李糖為組成單元、且葡萄糖醛酸位于支鏈的硫酸多糖的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種綠藻多糖及其制備方法，本發(fā)明的綠藻多糖是以α-l-(1,3)-連接的鼠李糖和α-l-(1,2)-連接的鼠李糖為主鏈，β-d-葡萄糖醛酸位于支鏈的一種結(jié)構(gòu)新穎的海洋硫酸多糖。本發(fā)明的綠藻多糖具有明顯抗凝血活性、纖溶和溶栓活性以及降血糖降血脂活性，可用于制備抗凝血和降血糖藥物及保健食品。

為此，本發(fā)明提供了一種綠藻多糖，所述綠藻多糖是由鼠李糖和葡萄糖醛酸組成的一種硫酸多糖，其中，鼠李糖的摩爾百分比為96.12％，葡萄糖醛酸的摩爾百分比為3.88％；所述綠藻多糖的主鏈由α-l-(1,3)-連接的鼠李糖和α-l-(1,2)-連接的鼠李糖組成，α-l-(1,3)-連接的鼠李糖和α-l-(1,2)-連接的鼠李糖的摩爾比為5：3，在α-l-(1,3)-連接的鼠李糖的c2位存在支鏈；所述綠藻多糖的支鏈由α-l-(1,3)-連接的鼠李糖和末端連接的β-d-葡萄糖醛酸組成，β-d-葡萄糖醛酸位于支鏈的非還原端，β-d-葡萄糖醛酸與鼠李糖之間以1,3糖苷鍵連接；所述綠藻多糖的結(jié)構(gòu)分子式如式ⅰ所示，其中，n＝30，m＝0-5，r1＝h或so3h，r2＝h或so3h，r3＝h或so3h，r4＝h或so3h；

本發(fā)明還提供了綠藻多糖的制備方法，所述方法包括如下步驟：

(1)向干燥的袋礁膜中加水浸泡形成勻漿，在20℃-24℃下提取0.5-4小時(shí)，分離出清液；其中，水的質(zhì)量為袋礁膜質(zhì)量的10-60倍；

(2)將所得清液減壓濃縮、脫鹽得到第一多糖溶液，將所述第一多糖溶液減壓濃縮、干燥得到多糖，將所述多糖加水溶解得到第二多糖溶液，所述第二多糖溶液中所述多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％-6％；

(3)將所述第二多糖溶液通過離子交換色譜柱分離和凝膠色譜柱分離，然后減壓濃縮、脫鹽，將脫鹽后的溶液減壓濃縮、干燥，得到所述綠藻多糖。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：本發(fā)明提供了一種綠藻多糖及其制備方法，本發(fā)明的綠藻多糖是以α-l-(1,3)-連接的鼠李糖和α-l-(1,2)-連接的鼠李糖為主鏈，β-d-葡萄糖醛酸位于支鏈的一種結(jié)構(gòu)新穎的海洋硫酸多糖。本發(fā)明的綠藻多糖具有明顯抗凝血活性、纖溶和溶栓活性以及降血糖降血脂活性，可用于制備抗凝血和降血糖藥物及保健食品。本發(fā)明的綠藻多糖來源于天然海藻，對(duì)人體無毒副作用，可以通過添加各種附劑制成片劑、散劑、顆粒劑、膠囊等作為預(yù)防和治療血栓栓塞性疾病的抗凝血藥物以及預(yù)防和治療糖尿病的降血糖藥物，將具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的具體實(shí)施方式后，本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得更加清楚。

附圖說明

圖1是所述綠藻多糖的純度測(cè)定的高效凝膠滲透色譜和葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的分子量對(duì)數(shù)對(duì)保留時(shí)間(高效凝膠滲透色譜法測(cè)定)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其回歸方程；

圖2是本發(fā)明所述綠藻多糖的單糖組成測(cè)定的柱前衍生高效液相色譜；

圖3是本發(fā)明所述綠藻多糖中單糖的絕對(duì)構(gòu)型測(cè)定的柱前衍生高效液相色譜；

圖4是本發(fā)明所述綠藻多糖的紅外光譜；

圖5是本發(fā)明所述綠藻多糖脫硫后的¹hnmr譜；

圖6是本發(fā)明所述綠藻多糖脫硫后的¹³cnmr譜；

圖7是本發(fā)明所述綠藻多糖脫硫后的¹h-¹hcosy譜；

圖8是本發(fā)明所述綠藻多糖脫硫后的¹h-¹³chsqc譜；

圖9是本發(fā)明所述綠藻多糖脫硫后的¹h-¹³chmbc譜；

圖10是本發(fā)明所述綠藻多糖的¹hnmr譜；

圖11是本發(fā)明所述綠藻多糖的¹³cnmr譜；

圖12是本發(fā)明所述綠藻糖的¹h-¹hcosy譜；

圖13是本發(fā)明所述綠藻多糖的¹h-¹³chsqc譜；

圖14是本發(fā)明所述綠藻多糖的¹h-¹hnoesy譜；

圖15是本發(fā)明所述綠藻多糖經(jīng)降解得到的寡糖在凝膠色譜柱bio-gelp4的分離純化圖；

圖16是本發(fā)明所述綠藻多糖經(jīng)降解得到的寡糖組分s1的esi-ms譜；

圖17是本發(fā)明所述綠藻多糖經(jīng)降解得到的寡糖組分s2的esi-ms譜；

圖18是本發(fā)明所述綠藻多糖經(jīng)降解得到的寡糖組分s3的esi-ms譜；

圖19是本發(fā)明所述綠藻多糖經(jīng)降解得到的寡糖組分s4的esi-ms譜；

圖20是本發(fā)明所述綠藻多糖經(jīng)降解得到的寡糖組分s1的碎片離子m/z243的esi-cid-ms/ms譜和質(zhì)譜斷裂模式示意圖；

圖21是本發(fā)明所述綠藻多糖經(jīng)降解得到的寡糖組分s2的碎片離子m/z389的esi-cid-ms/ms譜和質(zhì)譜斷裂模式示意圖；

圖22是本發(fā)明所述綠藻多糖經(jīng)降解得到的寡糖組分s2的碎片離子m/z339的esi-cid-ms/ms譜和質(zhì)譜斷裂模式示意圖；

圖23是本發(fā)明所述綠藻多糖經(jīng)降解得到的寡糖組分s3的碎片離子m/z485的esi-cid-ms/ms譜和質(zhì)譜斷裂模式示意圖；

圖24是本發(fā)明所述綠藻多糖經(jīng)降解得到的寡糖組分s4的碎片離子m/z419的esi-cid-ms/ms譜和質(zhì)譜斷裂模式示意圖；

圖25是本發(fā)明所述綠藻多糖經(jīng)降解得到的寡糖組分s4的碎片離子m/z565的esi-cid-ms/ms譜和質(zhì)譜斷裂模式示意圖；

圖26是本發(fā)明所述綠藻多糖對(duì)大鼠血漿纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物含量的影響；統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：**p<0.01，與空白組比較；##p<0.01，與尿激酶組比較；

圖27是本發(fā)明所述綠藻多糖對(duì)大鼠血漿d-二聚體含量的影響；統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：**p<0.01，與空白組比較；##p<0.01，與尿激酶組比較；

圖28是本發(fā)明所述綠藻多糖對(duì)大鼠血漿纖溶酶原激活抑制物水平的影響；統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：*p<0.05，**p<0.01，與空白組比較；##p<0.01，與尿激酶組比較；

圖29是本發(fā)明所述綠藻多糖的體外血凝塊溶解率分析結(jié)果；統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：**p<0.01，與空白組比較；#p<0.05，##p<0.01，與尿激酶組比較；

圖30是本發(fā)明所述綠藻多糖對(duì)hepg2細(xì)胞葡萄糖消耗能力的影響；統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：**p<0.01，與空白組比較；

圖31是本發(fā)明所述綠藻多糖對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島素抵抗hepg2細(xì)胞葡萄糖消耗能力的影響；統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：*p<0.05，與空白組比較；#p<0.05，與模型組比較；

圖32是本發(fā)明所述綠藻多糖對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島素抵抗hepg2細(xì)胞甘油三酯含量的影響；統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：**p<0.01，與空白組比較；##p<0.01，與模型組比較；

圖33是本發(fā)明所述綠藻多糖對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島素抵抗hepg2細(xì)胞總膽固醇含量的影響；統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：**p<0.01，與空白組比較；##p<0.01，與模型組比較。

具體實(shí)施方式

以下對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明，應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

本發(fā)明的綠藻多糖是由鼠李糖和葡萄糖醛酸組成的一種硫酸多糖，其中，鼠李糖的摩爾百分比為96.12％，葡萄糖醛酸的摩爾百分比為3.88％；所述綠藻多糖的主鏈由α-l-(1,3)-連接的鼠李糖和α-l-(1,2)-連接的鼠李糖組成，α-l-(1,3)-連接的鼠李糖和α-l-(1,2)-連接的鼠李糖的摩爾比為5：3，在α-l-(1,3)-連接的鼠李糖的c2位存在支鏈；所述綠藻多糖的支鏈由α-l-(1,3)-連接的鼠李糖和末端連接的β-d-葡萄糖醛酸組成，β-d-葡萄糖醛酸位于支鏈的非還原端，β-d-葡萄糖醛酸與鼠李糖之間以1,3糖苷鍵連接；所述綠藻多糖的結(jié)構(gòu)分子式如式ⅰ所示，其中，n＝30，m＝0-5，r1＝h或so3h，r2＝h或so3h，r3＝h或so3h，r4＝h或so3h；

本發(fā)明的綠藻多糖是以α-l-(1,3)-連接的鼠李糖和α-l-(1,2)-連接的鼠李糖為主鏈，β-d-葡萄糖醛酸位于支鏈的一種結(jié)構(gòu)新穎的海洋硫酸多糖。本發(fā)明的綠藻多糖具有明顯抗凝血活性、纖溶和溶栓活性以及降血糖降血脂活性，可用于制備抗凝血和降血糖藥物及保健食品。本發(fā)明的綠藻多糖來源于天然海藻，對(duì)人體無毒副作用，可以通過添加各種附劑制成片劑、散劑、顆粒劑、膠囊等作為預(yù)防和治療血栓栓塞性疾病的抗凝血藥物以及預(yù)防和治療糖尿病的降血糖藥物，將具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

綠藻多糖的平均分子量為58.4千道爾頓。

在綠藻多糖的鼠李糖中，17.77％的α-l-(1,3)-連接的鼠李糖被硫酸化形成硫酸基并位于α-l-(1,3)-連接的鼠李糖的c2位，4.15％的α-l-(1,2)-連接的鼠李糖被硫酸化形成硫酸基并位于α-l-(1,2)-連接的鼠李糖的c3位。

在綠藻多糖的糖鏈中，每10個(gè)鼠李糖基中存在一個(gè)支鏈。

本發(fā)明還提供了綠藻多糖的制備方法，所述方法包括如下步驟：

(1)向干燥的袋礁膜中加水浸泡形成勻漿，在20℃-24℃下提取0.5-4小時(shí)，分離出清液；其中，水的質(zhì)量為袋礁膜質(zhì)量的10-60倍；

(2)將所得清液減壓濃縮、脫鹽得到第一多糖溶液，將所述第一多糖溶液減壓濃縮、干燥得到多糖，將所述多糖加水溶解得到第二多糖溶液，所述第二多糖溶液中所述多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％-6％；

(3)將所述第二多糖溶液通過離子交換色譜柱分離和凝膠色譜柱分離，然后減壓濃縮、脫鹽，將脫鹽后的溶液減壓濃縮、干燥，得到所述綠藻多糖。

步驟(1)中，向干燥的袋礁膜中加水浸泡形成勻漿的方法為：將干燥的袋礁膜直接浸泡于水中形成勻漿，或者將干燥的袋礁膜研磨或絞碎后與水混合形成勻漿，或者將干燥的袋礁膜加工成干燥粉末與水混合形成勻漿。

步驟(2)和步驟(3)中，脫鹽的方法為透析脫鹽。

步驟(2)和步驟(3)中，干燥的方法為冷凍干燥，或者向減壓濃縮后的多糖溶液中加入1-6倍多糖溶液體積的、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95％乙醇使多糖沉淀，將所得沉淀在40℃-80℃烘箱中干燥0.1-6小時(shí)。

步驟(3)中，離子交換色譜柱為色譜柱qsepharosefastflow，依次用蒸餾水、0.5mol/l氯化鈉水溶液、1.0mol/l氯化鈉水溶液、1.5mol/l氯化鈉水溶液和2.0mol/l氯化鈉水溶液洗脫。

步驟(3)中，凝膠色譜柱為色譜柱sephacryls-400hr，所用的洗脫液為0.2mol/l碳酸氫銨水溶液。

實(shí)施例1

(1)向50克干燥的袋礁膜中加1500克水浸泡形成勻漿，在21℃下攪拌提取3.0小時(shí)，離心棄去沉淀，分離出清液；

(2)將所得清液減壓濃縮、透析脫鹽得到第一多糖溶液，透析脫鹽的步驟包括：將減壓濃縮后的清液置于截留分子量為3500道爾頓的透析袋中透析3天，電導(dǎo)率儀測(cè)試透析后外液至恒定值時(shí)停止透析；

將第一多糖溶液減壓濃縮、向濃縮后第一多糖溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95％乙醇使多糖沉淀，乙醇的體積為第一多糖溶液體積的四倍，將所得沉淀在40℃烘箱中干燥4小時(shí)，得到5克多糖。將多糖加水溶解得到第二多糖溶液，每毫升第二多糖溶液中多糖的質(zhì)量為50毫克。

(3)將第二多糖溶液通過陰離子交換柱qsepharosefastflow分離，依次分別用蒸餾水、0.5mol/l氯化鈉水溶液、1.0mol/l氯化鈉水溶液、1.5mol/l氯化鈉水溶液和2.0mol/l氯化鈉水溶液洗脫2個(gè)柱體積，收集2.0mol/l氯化鈉水溶液的洗脫液，將所得多糖溶液減壓濃縮，然后進(jìn)行透析去除鹽，將除去鹽后的多糖溶液減壓濃縮，干燥后加蒸餾水溶解，使溶液中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％；

再通過凝膠色譜柱sephacryls-400/hr進(jìn)一步分離，用0.2mol/l碳酸氫銨水溶液洗脫，硫酸-苯酚法檢測(cè)，收集多糖洗脫峰的洗脫液，將所得多糖溶液減壓濃縮，然后進(jìn)行透析去除鹽，將除去鹽后的多糖溶液減壓濃縮，冷凍干燥，得到0.14克綠藻多糖。

以下為綠藻多糖的結(jié)構(gòu)測(cè)試和分析，包括綠藻多糖的單糖組成分析、甲基化分析、核磁共振波譜、寡糖的電噴霧負(fù)離子各離子峰的表征和電噴霧電離-碰撞誘導(dǎo)解離二級(jí)質(zhì)譜的序列分析等。

綠藻多糖為白色粉末，其硫酸基重量百分比為28.83％(氯化鋇-明膠比濁法測(cè)定)，其糖醛酸重量百分比為5.09％(硫酸咔唑法)。

綠藻多糖的純度和分子量通過高效凝膠滲透色譜法測(cè)定，結(jié)果如圖1左側(cè)的視圖a所示，綠藻多糖呈現(xiàn)單一對(duì)稱峰，說明綠藻多糖的純度高。在同樣的分析條件下，繪制葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(分子量為：708，344，200，107，47.1和21.1千道爾頓)的分子量對(duì)數(shù)對(duì)保留時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，結(jié)果如圖1右側(cè)的視圖b所示；通過將綠藻多糖的保留時(shí)間(如圖1左側(cè)的視圖a所示)代入圖1右側(cè)的視圖b中的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算得到綠藻多糖的平均分子量為58.4千道爾頓。

綠藻多糖的單糖組成通過柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。根據(jù)保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行計(jì)算，并與鼠李糖、葡萄糖、葡萄糖胺、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸進(jìn)行對(duì)照，可知綠藻多糖主要含有鼠李糖及少量葡萄糖醛酸，鼠李糖的摩爾百分比為96.12％，葡萄糖醛酸的摩爾百分比為3.88％。

綠藻多糖中單糖的絕對(duì)構(gòu)型通過柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明綠藻多糖中鼠李糖的保留時(shí)間為29.88分鐘，其與l-鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致，說明綠藻多糖中的鼠李糖的絕對(duì)構(gòu)型為l型，葡萄糖醛酸的保留時(shí)間為18.51分鐘，其與d-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致，說明綠藻多糖中的葡萄糖醛酸的絕對(duì)構(gòu)型為d型。

綠藻多糖的紅外光譜如圖4所示，波數(shù)3458cm^–1的強(qiáng)吸收峰為o-h的伸縮振動(dòng)，2928cm^–1吸收峰為c-h的伸縮振動(dòng)吸收，1640cm^–1和1429cm^–1吸收峰為coo–的非對(duì)稱以及對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，1240cm^–1吸收峰為硫酸基的s＝o伸縮振動(dòng)，1051cm^–1吸收峰為c-o-c環(huán)內(nèi)醚的c-o伸縮振動(dòng)和o–h的變角振動(dòng)，850cm^–1吸收峰為硫酸基的c-o-s的伸縮振動(dòng)吸收。

綠藻多糖中糖基的連接方式和硫酸基位置首先通過甲基化分析測(cè)定，綠藻多糖脫硫前和脫硫后的甲基化分析結(jié)果表明，脫硫前綠藻多糖主要含有1,3、1,2和1,2,3連接的l-鼠李糖，三者的摩爾百分比約為41.08:25.69:33.23；脫硫后與脫硫前的綠藻多糖相比，1,2連接的鼠李糖和1,3連接的鼠李糖的摩爾百分比增大，1,2,3連接的鼠李糖的摩爾百分比減小，脫硫后綠藻多糖中1,3、1,2和1,2,3連接的鼠李糖的摩爾百分比約為58.85:29.84:11.31。說明硫酸基位于1,2連接的鼠李糖的c3位和1,3連接的鼠李糖的c2位，而且，可以推斷綠藻多糖中鼠李糖總數(shù)的21.92％(摩爾百分比)被硫酸基取代，且1,3連接的鼠李糖的17.77％被硫酸基取代，1,2連接的鼠李糖的4.15％被硫酸基取代。另外，通過對(duì)綠藻多糖中的糖醛酸還原后產(chǎn)物的甲基化分析說明，綠藻多糖中的葡萄糖醛酸是以末端連接的形式存在。

圖5為脫硫后的綠藻多糖的核磁共振氫譜(¹hnmr譜)，化學(xué)位移5.00～5.50ppm，為α吡喃型鼠李糖端基氫信號(hào)所在的區(qū)域(以下將α吡喃型鼠李糖基簡(jiǎn)寫為α-rhap)，異頭區(qū)顯示5個(gè)異頭氫信號(hào)，分別為5.00、5.07、5.23、5.29和5.38ppm，其摩爾比為1.00:1.03:1.01:0.21:0.21，依次命名為a、b、c、d和e。高場(chǎng)區(qū)1.35ppm為鼠李糖基的c6甲基氫信號(hào)，3.30～4.50ppm為鼠李糖糖環(huán)碳上無取代基團(tuán)時(shí)h2～h5的信號(hào)。

圖6為脫硫后的綠藻多糖的核磁共振碳譜(¹³cnmr譜)，圖6中出現(xiàn)三個(gè)主要的異頭碳信號(hào)：103.54、102.41和102.22ppm，鼠李糖基的c2～c5信號(hào)主要集中于70～80ppm，18.26ppm為鼠李糖基的c6信號(hào)，由3.89ppm的h5信號(hào)和70.80ppm的c5信號(hào)也可以推斷出鼠李糖基為α型。由于葡萄糖醛酸含量較低且信號(hào)重疊嚴(yán)重，在核磁上確定它的信號(hào)非常困難。¹³cnmr譜中105.72ppm為非還原端葡萄糖醛酸基的異頭碳信號(hào)，177.33ppm為葡萄糖醛酸的羧基碳信號(hào)。

圖7為脫硫后的綠藻多糖的同核化學(xué)位移相關(guān)譜(¹h-¹hcosy譜)，圖8為脫硫后的綠藻多糖的異核單量子化學(xué)位移相關(guān)譜(¹h-¹³chsqc譜)。從圖7和圖8可以得出，a和b糖基中，5.00和5.07ppm的h1與103.54ppm的c1相關(guān)，由于79.43ppm的c3位化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)，因此a和b糖基歸屬為→3)-α-l-rhap-(1→。c糖基5.23ppm的h1與102.41ppm的c1相關(guān)，且其相關(guān)信號(hào)4.11/79.01ppm的h2/c2存在，表明c糖基為→2)-α-l-rhap-(1→。d糖基5.29ppm的h1與102.22ppm的c1相關(guān)，其相關(guān)信號(hào)4.11/79.01ppm的h2/c2和4.00/79.43ppm的h3/c3存在，證明了c2和c3取代，因此d糖基為→2,3)-α-l-rhap-(1→。e糖基歸屬為→2)-α-l-rhap(3so4)-(1→，其5.38ppm的h1與102.22ppm的c1相關(guān)，由于4.61ppm的h3被硫酸基取代，因此，化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)。e糖基的出現(xiàn)表明多糖的脫硫并不完全，但是由于其信號(hào)強(qiáng)度較弱，因此大部分硫酸基已經(jīng)被脫除。

圖9為脫硫后的綠藻多糖的異核多鍵化學(xué)位移相關(guān)譜(¹h-¹³chmbc譜)，圖9給出不同糖環(huán)上碳?xì)渲g的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)。a糖基的h1與c、d和e糖基的c2相關(guān)，推出片段→3)-α-l-rhap-(1→2)-α-l-rhap→、→3)-α-l-rhap-(1→2,3)-α-l-rhap→和→3)-α-l-rhap-(1→2)-α-l-rhap(3so4)-(1→。b糖基的h1與a和d糖基的c3相關(guān)，推出→3)-α-l-rhap-(1→3)-α-l-rhap→和→3)-α-l-rhap-(1→2,3)-α-l-rhap→。c糖基的h1與a和b糖基的c3相關(guān)，可推出→2)-α-l-rhap-(1→3)-α-l-rhap→。此外，相關(guān)信號(hào)h1(d)/c2(c)、h1(d)/c2(e)、h1(e)/c3(a)和h1(e)/c3(b)表明可能存在以下序列片段→2,3)-α-l-rhap-(1→2)-α-l-rhap→、→2,3)-α-l-rhap-(1→2)-α-l-rhap(3so4)→和→2)-α-l-rhap(3so4)-(1→3)-α-l-rhap→。

圖10為綠藻多糖的核磁共振氫譜(¹hnmr譜)，存在六種異頭氫信號(hào)，化學(xué)位移分別為5.00、5.07、5.23、5.29、5.38和5.50ppm，均為α吡喃型的鼠李糖端基氫信號(hào)，依次命名為a、b、c、d、e和f，其摩爾比為1.00:2.40:2.07:0.50:0.88:1.45。與脫硫后的綠藻多糖的¹hnmr譜相比，綠藻多糖的¹hnmr譜顯示了一個(gè)額外的異頭氫信號(hào)5.50ppm，而且5.38和5.50ppm的異頭氫信號(hào)強(qiáng)度較高。圖11為綠藻多糖的核磁共振碳譜(¹³cnmr譜)，圖12為綠藻多糖的同核化學(xué)位移相關(guān)譜(¹h-¹hcosy譜)，圖13為綠藻多糖的異核單量子化學(xué)位移相關(guān)譜(¹h-¹³chsqc譜)，圖14為綠藻多糖的核歐沃豪斯效應(yīng)相關(guān)譜(¹h-¹hnoesy譜)；通過圖10-圖13可知，f糖基歸屬為→3)-α-l-rhap(2so4)-(1→，其h1與100.61ppm的c1相關(guān)；e糖基歸屬為→2)-α-l-rhap(3so4)-(1→，其h1與100.61ppm的c1相關(guān)；根據(jù)綠藻多糖的脫硫后多糖的信號(hào)歸屬，a和b糖基的h1信號(hào)與103.16和102.78ppm的c1信號(hào)相關(guān)，h3(3.92/3.96ppm)與c3(78.30ppm)相關(guān)，因此a和b歸屬為→3)-α-l-rhap-(1→；c糖基的h1與101.42ppm的c1相關(guān)，4.30ppm的h2與78.86ppm的c-2相關(guān)，c歸屬為→2)-α-l-rhap-(1→；d糖基歸屬為→2,3)-α-l-rhap-(1→，其h1與101.42ppm的c1相關(guān)，h2/c2和h3/c3的相關(guān)信號(hào)分別為4.30/78.86ppm和3.97/78.30ppm。

從圖14可以看出不同糖環(huán)上氫氫之間的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)，a糖基的h1與4.30ppm的c糖基、d糖基和e糖基的h2相關(guān)，表明存在→3)-α-l-rhap-(1→2)-α-l-rhap-(1→、→3)-α-l-rhap-(1→2,3)-α-l-rhap-(1→和→3)-α-l-rhap-(1→2)-α-l-rhap(3so4)-(1→片段。b糖基的h1與a糖基、f糖基的h3(3.92/4.11ppm)相關(guān)，此外，b糖基的3.96ppm的h3與f糖基的5.50ppm的h1相關(guān)，表明存在以下片段→3)-α-l-rhap-(1→3)-α-l-rhap-(1→、→3)-α-l-rhap-(1→3)-α-l-rhap(2so4)-(1→和→3)-α-l-rhap(2so4)-(1→3)-α-l-rhap-(1→。c糖基、d糖基和e糖基的h1(5.23、5.29、5.38ppm)與b糖基的h3(3.96ppm)相關(guān)，表明存在以下片段→2)-α-l-rhap-(1→3)-α-l-rhap-(1→、→2,3)-α-l-rhap-(1→3)-α-l-rhap-(1→和→2)-α-l-rhap(3so4)-(1→3)-α-l-rhap-(1→。c糖基的h1與f糖基的h3相關(guān)，表明存在→2)-α-l-rhap-(1→3)-α-l-rhap(2so4)-(1→。

為進(jìn)一步研究綠藻多糖的結(jié)構(gòu)，采用酸解法對(duì)綠藻多糖進(jìn)行降解，選用凝膠柱bio-gelp4對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。對(duì)綠藻多糖經(jīng)降解所得的寡糖片段采用電噴霧電離質(zhì)譜(esi-ms)測(cè)定寡糖片段的分子量，采用電噴霧電離-碰撞誘導(dǎo)解離二級(jí)質(zhì)譜(esi-cid-ms/ms)技術(shù)對(duì)寡糖組分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，最終確定綠藻多糖的結(jié)構(gòu)。

綠藻多糖的降解：綠藻多糖加水配成質(zhì)量百分比為1％的綠藻多糖溶液，加入適量鹽酸至反應(yīng)體系鹽酸濃度為0.1mol/l，在60℃時(shí)反應(yīng)9小時(shí)，所得水解物用1.0mol/l氫氧化鈉中和，然后置于截留分子量為100道爾頓的透析袋中透析3天，將所得水解物溶液在40℃減壓濃縮，然后向濃縮液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95％的乙醇(濃縮液與乙醇的體積比3：1)，通過離心(4500轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)，獲得了兩種產(chǎn)物，即上清液和沉淀。上清液部分經(jīng)減壓濃縮后凍干，沉淀部分用無水乙醇脫水后于40℃烘干。通過柱前衍生高效液相色譜測(cè)定它們的單糖組成，結(jié)果表明，所得沉淀部分中僅含有鼠李糖，而凍干后的上清液部分含有鼠李糖和葡萄糖醛酸。由此得知，葡萄糖醛酸片段更容易被降解下來，推測(cè)其位于綠藻多糖的支鏈。

寡糖的分離：采用凝膠柱bio-gelp4(100×1.6cm)層析柱對(duì)綠藻多糖的降解產(chǎn)物，即凍干后的上清液部分進(jìn)行分離，洗脫液為0.2mol/l碳酸氫銨水溶液，采用苯酚硫酸法檢測(cè)，收集主峰部分，脫鹽后凍干即得寡糖，所得寡糖依次命名為s1、s2、s3和s4。圖15是綠藻多糖經(jīng)降解得到的寡糖在凝膠色譜柱bio-gelp4的分離純化圖,通過負(fù)離子方式的esi-ms譜分析各寡糖組分的分子量，結(jié)果如圖16-圖19所示，從圖16-圖19可以看出，s1為硫酸化鼠李單糖，s2主要為硫酸化鼠李二糖，s3為硫酸化或非硫酸化二糖與三糖，s4為高聚合度的寡糖。葡萄糖醛酸片段主要存在于寡糖組分s2、s3和s4中，以鼠李單糖和糖醛酸(r+ga)，鼠李二糖和糖醛酸(r2+ga)，硫酸化鼠李單糖和糖醛酸(rs+ga)以及硫酸化鼠李二糖和糖醛酸(r2s+ga)的形式存在，而硫酸化鼠李單糖(rs)和硫酸化鼠李二糖(r2s)是寡糖s1與s2的主要組分。r代表鼠李糖，ga代表葡萄糖醛酸，s代表硫酸基。

寡糖的序列分析：應(yīng)用電噴霧電離質(zhì)譜并利用撞擊分散誘導(dǎo)技術(shù)對(duì)所得的寡糖進(jìn)行序列分析。首先，對(duì)寡糖組分s1中硫酸化鼠李單糖進(jìn)行序列分析，寡糖組分s1的碎片離子質(zhì)荷比(以下將質(zhì)荷比簡(jiǎn)寫為m/z)243的esi-cid-ms/ms譜如圖20中左側(cè)的視圖a所示。從硫酸化鼠李單糖m/z243的二級(jí)質(zhì)譜圖中可以看到，主要有m/z139環(huán)內(nèi)斷裂碎片離子，歸屬為^0,2x，因此硫酸基位于c2位。少量m/z225為硫酸化鼠李單糖(rs)失去一分子水所產(chǎn)生的離子。寡糖組分s1的碎片離子m/z243的質(zhì)譜斷裂模式示意圖如圖20中右側(cè)的視圖b所示。

對(duì)寡糖組分s2中硫酸化鼠李二糖(r2s)以及葡萄糖醛酸鼠李二糖(r+ga)進(jìn)行序列分析。寡糖組分s2的碎片離子m/z389的esi-cid-ms/ms譜如圖21左側(cè)的視圖a所示。在硫酸化鼠李二糖m/z389的二級(jí)質(zhì)譜中，碎片離子m/z225和m/z243由鼠李糖糖環(huán)間的斷裂產(chǎn)生，分別歸屬為b1和c1。由此推斷，硫酸化鼠李二糖是在硫酸化鼠李單糖的基礎(chǔ)上連接了另一個(gè)鼠李糖。其他碎片離子峰均由鼠李糖環(huán)內(nèi)斷裂產(chǎn)生，m/z285和m/z315分別歸屬為^0,2x1和^0,3x1。由上述分析可以推斷得出，硫酸化鼠李二糖的結(jié)構(gòu)為α-l-rhap(2so4)-(1→3)-α-l-rhap。寡糖組分s2的碎片離子m/z389的的質(zhì)譜斷裂模式示意圖如圖21右側(cè)的視圖b所示。

寡糖組分s2的碎片離子m/z339的esi-cid-ms/ms譜如圖22左側(cè)的視圖a所示，在葡萄糖醛酸鼠李糖m/z339的二級(jí)質(zhì)譜中，碎片離子m/z321由r+ga脫去一分子水產(chǎn)生。在m/z321的三級(jí)質(zhì)譜中，m/z193仍舊出現(xiàn)，而且只在還原端葡萄糖醛酸中出現(xiàn)的^2,5a2–型離子并沒有出現(xiàn)，因此葡萄糖醛酸位于非還原端。葡萄糖醛酸鼠李二糖(r+ga)的結(jié)構(gòu)為β-d-glcpa-(1→3)-α-l-rhap。寡糖組分s2的碎片離子m/z339的質(zhì)譜斷裂模式示意圖如圖22右側(cè)的視圖b所示。

對(duì)寡糖組分s3的碎片離子m/z485的esi-cid-ms/ms譜如圖23左側(cè)的視圖a所示，葡萄糖醛酸鼠李三糖m/z485的二級(jí)質(zhì)譜顯示了與葡萄糖醛酸鼠李二糖m/z339相似的碎片離子，給出了鼠李糖環(huán)間斷裂離子c3(m/z467)、c2(m/z339)、b2(m/z321)、c1(m/z193)以及環(huán)內(nèi)斷裂離子峰^1,3a2(m/z235)，由此推斷葡萄糖醛酸鼠李三糖是在葡萄糖醛酸鼠李二糖的基礎(chǔ)上又連接了一個(gè)鼠李糖，其結(jié)構(gòu)為β-d-glca-(1→3)-α-l-rhap-(1→3)-α-l-rhap。根據(jù)以上的二級(jí)質(zhì)譜序列分析方法可以推斷ga+rn的結(jié)構(gòu)。寡糖組分s3的碎片離子m/z485的質(zhì)譜斷裂模式示意圖如圖23右側(cè)的視圖b所示。

對(duì)寡糖組分s4的碎片離子m/z419的esi-cid-ms/ms譜如圖24左側(cè)的視圖a所示。硫酸化葡萄糖醛酸鼠李二糖m/z419是由葡萄糖醛酸鼠李二糖硫酸酯化得到。在其二級(jí)質(zhì)譜中，碎片離子m/z243的出現(xiàn)表明硫酸基團(tuán)位于鼠李糖上，其結(jié)構(gòu)推斷為β-d-glca-(1→3)-α-l-rhap(2so4)。寡糖組分s4的碎片離子m/z419的質(zhì)譜斷裂模式示意圖如圖24右側(cè)的視圖b所示。

寡糖組分s4的碎片離子m/z565的esi-cid-ms/ms譜如圖25左側(cè)的視圖a所示。硫酸化葡萄糖醛酸鼠李三糖m/z565由葡萄糖醛酸鼠李三糖硫酸化得到。其結(jié)構(gòu)推斷為β-d-glca-(1→3)-α-l-rhap(2so4)-(1→3)-α-l-rhap。寡糖組分s4的碎片離子m/z565的質(zhì)譜斷裂模式示意圖如圖25右側(cè)的視圖b所示。

以下為綠藻多糖的性能測(cè)試和分析，本發(fā)明的綠藻多糖能夠顯著延長(zhǎng)活化部分凝血酶時(shí)間和凝血酶原時(shí)間，降低纖維蛋白原含量，說明其具有較好的抗凝血活性。本發(fā)明的綠藻多糖能夠顯著增加大鼠血漿纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物和d-二聚體含量，降低纖溶酶原激活抑制物水平，增加血凝塊溶解率，其活性高于尿激酶，說明其具有很好的纖溶和溶栓作用。另外，本發(fā)明的綠藻多糖能夠增加人肝癌細(xì)胞株(以下將人肝癌細(xì)胞株簡(jiǎn)寫為hepg2)細(xì)胞及胰島素抵抗hepg2細(xì)胞的葡萄糖消耗能力，降低胰島素抵抗hepg2細(xì)胞的甘油三酯和總膽固醇水平，其作用高于二甲雙胍，表明其具有好的降血糖降血脂活性。綜上所述，本發(fā)明的綠藻多糖具有明顯抗凝血活性、纖溶和溶栓活性以及降血糖降血脂活性，可用于制備抗凝血和降血糖藥物及保健食品。

本發(fā)明的綠藻多糖的抗凝血活性是通過測(cè)定體外活化部分凝血酶時(shí)間、凝血酶時(shí)間、凝血酶原時(shí)間和纖維蛋白原含量進(jìn)行評(píng)價(jià)，以肝素作為陽性對(duì)照?；罨糠帜笗r(shí)間反映了內(nèi)源性或者共同凝血途徑，凝血酶時(shí)間反映了對(duì)凝血酶活性或者纖維蛋白原的作用，凝血酶原時(shí)間反映了外源性凝血途徑，纖維蛋白原主要反映纖維蛋白原的含量。表1是綠藻多糖的抗凝血活性分析結(jié)果。由表1可知，本發(fā)明的綠藻多糖顯著延長(zhǎng)活化部分凝血酶時(shí)間和凝血酶原時(shí)間，降低纖維蛋白原含量，說明其具有較好的抗凝血活性，也說明綠藻多糖的抗凝血活性是通過抑制內(nèi)源和共同凝血途徑以及凝血酶活性起作用的，而對(duì)外源性凝血途徑?jīng)]有影響。

表1

本發(fā)明的綠藻多糖的纖溶和溶栓活性是通過體內(nèi)纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物、d-二聚體和纖溶酶原激活抑制物水平以及體外血凝塊溶解率進(jìn)行評(píng)價(jià)，以尿激酶作為陽性對(duì)照。d-二聚體以及纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物水平是判斷血凝以及纖溶系統(tǒng)情況的理想指標(biāo)。在纖溶系統(tǒng)的平衡中，纖溶酶原激活劑及其抑制因子起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，其中纖溶酶原激活抑制物是血漿中主要的纖溶酶原激活物抑制劑。由圖26可知，綠藻多糖能使大鼠血漿的纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物水平顯著升高，在2.5毫克/千克時(shí)，已經(jīng)能夠極顯著地增加纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物的水平，且隨著綠藻多糖劑量的增大，纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物的含量逐漸升高，在10毫克/千克時(shí)，大鼠血漿的纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物含量與陽性藥尿激酶組存在極顯著性差異。由圖27可知，綠藻多糖隨著其劑量的增加，能夠顯著提高大鼠血漿的d-二聚體的含量，在10毫克/千克時(shí)，大鼠血漿的d-二聚體含量與陽性藥尿激酶組相比存在極顯著性差異。由圖28可知，綠藻多糖能夠降低大鼠血漿的纖溶酶原激活抑制物水平，在2.5毫克/千克時(shí)，綠藻多糖就能顯著降低大鼠血漿的纖溶酶原激活抑制物水平，在10毫克/千克時(shí)，纖溶酶原激活抑制物的水平降至0。由圖29可知，隨著綠藻多糖劑量的增加，大鼠血漿的血凝塊溶解率逐漸增加，且在10毫克/毫升時(shí)，溶解率與陽性藥尿激酶組相比具有極顯著性差異，這些結(jié)果說明綠藻多糖具有很好的纖溶和溶栓活性。

本發(fā)明的綠藻多糖的降血糖降血脂活性是通過測(cè)定綠藻多糖對(duì)hepg2細(xì)胞及棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島素抵抗hepg2細(xì)胞葡萄糖消耗能力、甘油三酯及總膽固醇水平的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)，以二甲雙胍作為陽性對(duì)照。評(píng)價(jià)綠藻多糖的降血糖降血脂活性之前，首先測(cè)定綠藻多糖對(duì)hepg2細(xì)胞增殖的影響，確定了綠藻多糖的用藥濃度范圍。由圖30可知，隨著綠藻多糖濃度的增加，hepg2細(xì)胞的葡萄糖消耗能力逐漸增加，在50、100和200微克/毫升時(shí)，與空白組存在極顯著性差異，且在200微克/毫升時(shí)，葡萄糖消耗能力達(dá)到最大，與二甲雙胍組相似。由圖31可知，模型組的葡萄糖消耗能力顯著低于空白組，表明造模成功。綠藻多糖能夠極顯著地增加胰島素抵抗hepg2細(xì)胞葡萄糖的消耗，且隨著綠藻多糖濃度的增加，葡萄糖消耗逐漸增大，當(dāng)濃度為200微克/毫升，與模型組相比，具有顯著性差異。由圖32可知，模型組的甘油三酯含量與空白組相比具有極顯著性差異，表明造模成功。綠藻多糖能夠極顯著地降低胰島素抵抗hepg2細(xì)胞中甘油三酯的含量，50微克/毫升時(shí)，降低作用達(dá)到最強(qiáng)，與二甲雙胍的作用相似。由圖33可知，與空白組相比，模型組的總膽固醇含量極顯著地增加，表明造模成功。綠藻多糖能夠極顯著地降低胰島素抵抗hepg2細(xì)胞中總膽固醇的含量，當(dāng)綠藻多糖濃度為25微克/毫升和50微克/毫升時(shí)，降低總膽固醇的作用最強(qiáng)，優(yōu)于二甲雙胍的作用。

以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其進(jìn)行限制；盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對(duì)前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案的精神和范圍。