本發(fā)明屬于生物技術(shù)構(gòu)建領(lǐng)域，具體涉及一種大鼠rap1b基因重組腺病毒、質(zhì)粒、構(gòu)建方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)方法是研究基因功能的重要手段。基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)方法的本質(zhì)就是一個(gè)我們選擇研究的目的基因的功能，具體方法是將已克隆的目的基因轉(zhuǎn)移至體外培養(yǎng)的細(xì)胞中或者體內(nèi)，并且加入gfp熒光顯示報(bào)告，以方便觀察目的基因的過表達(dá)情況，研究該基因?qū)ο嚓P(guān)功能的影響。從而進(jìn)一步提高研究人員對(duì)目的基因的深入認(rèn)識(shí)，為后續(xù)試驗(yàn)做好基礎(chǔ)。目前常見的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、痘苗病毒載體、腺病毒載體等，各類載體都有自己的優(yōu)缺點(diǎn)。肝細(xì)胞肝癌基因治療中報(bào)告最多的一種病毒載體，采用體外制備滴度較大，裝載外源基因容量最大達(dá)35kb，不整合入宿主細(xì)胞基因組因而避免插入突變的危險(xiǎn)，能感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞。但易該病毒引起宿主免疫反應(yīng)而使轉(zhuǎn)染效率下降，且大劑量靜脈給予可導(dǎo)致嚴(yán)重的肝臟炎癥反應(yīng)，使其應(yīng)用受到限制。rap是ras超家族成員之一，rap又被分成rap1和rap2。rap1又分為兩個(gè)亞型：rap1a和rap1b。許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，rap1b引起細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化、凋亡等生物學(xué)反應(yīng)方面都發(fā)生著各種變化，rap1b的缺失可以導(dǎo)致細(xì)胞生長、細(xì)胞增殖及相關(guān)信號(hào)通路(erk)受阻。因此，開發(fā)rap1b基因的重組病毒質(zhì)粒，在肝細(xì)胞增殖中方面具有良好的應(yīng)用前景。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種大鼠rap1b基因重組腺病毒、質(zhì)粒、構(gòu)建方法及應(yīng)用，大鼠rap1b基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染效率高，可以作為基因治療藥物，實(shí)現(xiàn)基因干涉。本發(fā)明提供了一種大鼠rap1b基因重組腺病毒，大鼠rap1b基因重組腺病毒質(zhì)粒是先將如seqidno.1所示的rap1bcds區(qū)全長基因序列插入到pmd18-t載體中，得到重組克隆質(zhì)粒pmd-rap1b；然后將重組克隆質(zhì)粒pmd-rap1b用bamhi和ecori雙酶切后，回收的目的基因片段插入到pshuttle-cmv-egfp重組穿梭載體中得到重組穿梭質(zhì)粒pshuttle-gfp-ratrap1b；最后將重組穿梭質(zhì)粒pshuttle-gfp-ratrap1b用i-ceui和i-scei雙酶切后，回收的長序列片段的rap1b基因片段插入padxsi重組腺病毒骨架載體中后得到的。本發(fā)明還提供了一種上述大鼠rap1b基因重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建方法，具體包括以下步驟：步驟1，采用基因合成技術(shù)人工合成rap1bcds區(qū)全長基因序列，所述rap1bcds區(qū)全長基因序列如seqidno.1所示；步驟2，rap1b基因的克隆將所述rap1bcds區(qū)全長基因序列與pmd18-t載體連接，然后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌dh5α中，構(gòu)建得到重組克隆質(zhì)粒pmd-rap1b；步驟3，重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建將重組質(zhì)粒pmd-rap1b用bamhi和ecori雙酶切，凝膠回收目的基因片段；將pshuttle-cmv-egfp重組穿梭載體用bamhi和ecori雙酶切，cip去磷酸化，凝膠回收5.2kb的載體片段；用t4dna連接酶將目的基因片段和載體片段連接，構(gòu)建得到重組穿梭質(zhì)粒pshuttle-gfp-ratrap1b；步驟4，重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建將重組穿梭質(zhì)粒pshuttle-gfp-ratrap1b用i-ceui和i-scei雙酶切，凝膠回收長序列片段的rap1b基因片段；將padxsi重組腺病毒骨架載體用i-ceui和i-scei雙酶切，凝膠回收長序列片段的padxsi載體片段；用t4dna連接酶將rap1b基因片段和padxsi載體片段連接，構(gòu)建得到重組腺病毒質(zhì)粒pad-cmv-rap1b。本發(fā)明還提供了一種利用上述大鼠rap1b基因重組腺病毒質(zhì)粒制備得到的大鼠rap1b基因重組腺病毒。本發(fā)明還提供了上述大鼠rap1b基因重組腺病毒質(zhì)粒在制備促進(jìn)肝細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述大鼠rap1b基因重組腺病毒在制備促進(jìn)肝細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的一種大鼠rap1b基因重組腺病毒、質(zhì)粒、構(gòu)建方法及應(yīng)用，具有以下有益效果：1、本發(fā)明構(gòu)建的大鼠rap1b基因重組腺病毒質(zhì)粒在大鼠肝臟細(xì)胞中的過表達(dá)，過表達(dá)之后，有助于探析rap1b的功能，確定其是否在動(dòng)物應(yīng)激發(fā)生過程中可作為一個(gè)分子開關(guān)啟動(dòng)動(dòng)物細(xì)胞功能的改變，可以抵御應(yīng)激刺激。2、本發(fā)明制備的大鼠rap1b基因重組腺病毒滴度高，能夠達(dá)到1.2×1010pfu/ml，采用的是一種常用的病毒質(zhì)粒，已經(jīng)改造好，不致癌，不會(huì)導(dǎo)致肝臟炎癥反應(yīng)。附圖說明圖1是重組腺病毒質(zhì)粒pad-cmv-rap1b的陽性克隆結(jié)果；其中，泳道m(xù)為marker，泳道1為陽性克??；圖2是重組腺病毒質(zhì)粒pad-cmv-rap1b的陰性克隆結(jié)果；其中，泳道m(xù)為marker，泳道1為陰性克??；圖3不同病毒轉(zhuǎn)染brl大鼠肝細(xì)胞系的20×倍熒光顯微觀察結(jié)果；其中，圖3a為大鼠rap1b基因重組腺病毒組，圖3b為padxsi-cmv-null空載組，圖3c為對(duì)照組；圖4是熒光定量pcr檢測rap1bmrna表達(dá)量的結(jié)果；其中，1組表示大鼠rap1b基因重組腺病毒組，2組表示padxsi-cmv-null空載組，3組表示對(duì)照組；圖5是westernblotting檢測rap1b的蛋白表達(dá)的圖譜；其中，1道表示大鼠rap1b基因重組腺病毒組，2道表示padxsi-cmv-null空載組，3道表示對(duì)照組；圖6是westernblotting檢測rap1b的蛋白表達(dá)量的分析圖；其中，1組表示大鼠rap1b基因重組腺病毒組，2組表示padxsi-cmv-null空載組，3組表示對(duì)照組。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件操作，未注明的實(shí)驗(yàn)材料來源均為市售，由于不涉及發(fā)明點(diǎn)，故不對(duì)其步驟進(jìn)行詳細(xì)描述。當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。下述實(shí)施例中bamhi酶、ecori酶、i-ceui酶、i-scei酶、連接緩沖液、酶切緩沖液(10×buffer)、ripa裂解液、bca蛋白濃度測定試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)公司，rap1b單克隆抗體(mcab)、兔抗大鼠β-actin、山羊抗兔二抗igg等均購自英國abcam股份有限公司，pshuttle-cmv-egfp重組穿梭載體和padxsi重組腺病毒骨架載體均購自諾賽基因組研究中心有限公司，brl大鼠肝細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，大腸埃希菌top10、感受態(tài)大腸桿菌dh5α、cbrh-7919細(xì)胞購自全氏金生物技術(shù)有限公司，hek293細(xì)胞株購自上海漢恒。本發(fā)明提供了一種大鼠rap1b基因重組腺病毒質(zhì)粒，大鼠rap1b基因重組腺病毒質(zhì)粒是先將如seqidno.1所示的rap1bcds區(qū)全長基因序列插入到pmd18-t載體中，得到重組克隆質(zhì)粒pmd-rap1b；然后將重組克隆質(zhì)粒pmd-rap1b用bamhi和ecori雙酶切后，回收的目的基因片段插入到pshuttle-cmv-egfp重組穿梭載體中得到重組穿梭質(zhì)粒pshuttle-gfp-ratrap1b；最后將重組穿梭質(zhì)粒pshuttle-gfp-ratrap1b用i-ceui和i-scei雙酶切后，回收的長序列片段的rap1b基因片段插入padxsi重組腺病毒骨架載體中后得到的。大鼠rap1b基因重組腺病毒質(zhì)粒及病毒的構(gòu)建具體包括：步驟1，采用基因合成技術(shù)人工合成rap1bcds區(qū)全長基因序列，所述rap1bcds區(qū)全長基因序列如seqidno.1所示；步驟2，rap1b基因的克隆將所述rap1bcds區(qū)全長基因序列與pmd18-t載體連接，然后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌dh5α中，構(gòu)建得到重組克隆質(zhì)粒pmd-rap1b；具體為：將合成后的rap1bcds區(qū)全長基因序列、pmd18-t載體、連接緩沖溶液混合，然后16℃水浴過夜(12h)即可，該克隆步驟的具體操作步驟采用常規(guī)手段。由上海生工公司測序，測序結(jié)果應(yīng)用dnastar軟件進(jìn)行序列分析和比對(duì)。步驟3，重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建將重組質(zhì)粒pmd-rap1b用bamhi和ecori雙酶切，凝膠回收目的基因片段，其酶切體系如表1所示，酶切體系在37℃下反應(yīng)1h；將pshuttle-cmv-egfp重組穿梭載體用bamhi和ecori雙酶切，按照常規(guī)方法cip去磷酸化，凝膠回收5.2kb的載體片段，其酶切體系如表2所示，酶切體系在37℃下反應(yīng)1h；用t4dna連接酶將目的基因片段和載體片段連接，構(gòu)建得到重組穿梭質(zhì)粒pshuttle-gfp-ratrap1b。表1重組質(zhì)粒pmd-rap1b的酶切體系重組質(zhì)粒pmd-rap1b(500ng/μl)4μlbamhi1μlecori1μl10×buffer2μlddh2o12μl總體系20μl表2pshuttle-cmv-egfp重組穿梭載體的酶切體系pshuttle-cmv-egfp重組穿梭載體(500ng/μl)4μlbamhi1μlecori1μl10×buffer2μlddh2o12μl總體系20μl步驟4，重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建將重組穿梭質(zhì)粒pshuttle-gfp-ratrap1b用i-ceui和i-scei雙酶切，凝膠回收長序列片段的rap1b基因片段，其酶切體系如表3所示，酶切體系在37℃下反應(yīng)1h；將padxsi重組腺病毒骨架載體用i-ceui和i-scei雙酶切，凝膠回收長序列片段的padxsi載體片段，其酶切體系如表4所示，酶切體系在37℃下反應(yīng)1h；用t4dna連接酶將rap1b基因片段和padxsi載體片段連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌dh5α，構(gòu)建得到重組腺病毒質(zhì)粒pad-cmv-rap1b。采用質(zhì)粒抽提試劑盒(axygen公司)提取重組腺病毒質(zhì)粒，并采用xhoi對(duì)其酶切鑒定。xhoi對(duì)其酶切的鑒定結(jié)果如下：根據(jù)重組腺病毒質(zhì)粒pad-cmv-rap1b的序列分析攜帶目的基因表達(dá)框的陽性克隆被xhoi酶切后應(yīng)該有以下7條帶組成，陽性克?。?4.5kb、11.7kb、3.2kb、2.66kb、2.47kb、1.45kb、0.6kb，參見圖1，其中，泳道m(xù)為marker，泳道1為陽性克??；沒有重組的腺病毒空載體應(yīng)該由以下6條帶組成：陰性克?。?4.5kb、11.7kb、4.0kb、2.47kb、1.45kb、0.6kb，參見圖2。表3重組穿梭質(zhì)粒pshuttle-gfp-ratrap1b的酶切體系重組穿梭質(zhì)粒pshuttle-gfp-ratrap1b(500ng/μl)4μli-ceui1μli-scei1μl10×buffer2μlddh2o12μl總體系20μl表4重組腺病毒質(zhì)粒pad-cmv-rap1b的酶切體系重組腺病毒質(zhì)粒pad-cmv-rap1b(500ng/μl)4μli-ceui1μli-scei1μl10×buffer2μlddh2o12μl總體系20μl步驟5，大鼠rap1b基因重組腺病毒的制備步驟5.1，用t4dna連接酶將穿梭質(zhì)粒片段和骨架載體片段連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌dh5α，接種于含100μg/ml青霉素的lb培養(yǎng)基中，37℃、300rpm震蕩搖菌過夜(12h)，構(gòu)建得到重組腺病毒質(zhì)粒pad-cmv-rap1b。通過顯微鏡觀察，當(dāng)細(xì)胞生長到對(duì)數(shù)生長期時(shí)，采用質(zhì)粒抽提試劑盒大量抽提、純化重組腺病毒質(zhì)粒pad-cmv-rap1b，抽提、純化步驟按照質(zhì)粒抽提試劑盒操作說明進(jìn)行，具體如下：(1)取對(duì)數(shù)生長期的菌液150ml，裝入合適的離心瓶中，4500-6000rpm于4℃離心10min沉淀菌體，完全棄除上清。加入5mlbufferi，充分混懸震蕩菌體沉淀，使其完全分散開，至無絮塊存在。細(xì)菌懸液移入50ml離心管中。加入5mlbufferii，輕輕顛倒離心管6-8次，室溫放置5min，使細(xì)菌完全裂解，溶液透明。加入5mlbufferiii，立即顛倒離心管6-8次，充分混勻，至白色絮狀物產(chǎn)生。冰上放置10-15min。上述裂解液于4℃、12000-16000rpm離心15min，小心吸出上清，移入新的50ml離心管中。加入10ml異丙醇，顛倒離心管，充分混勻。冰上放置10-15min。于4℃、12000-16000rpm離心10min，小心棄去上清，倒置輕輕瀝干殘余液體，加入0.5mlbufferi，完全溶解沉淀團(tuán)塊(可用寬口吸管輕輕吹打輔助溶解)。移入新的1.5ml離心管中，室溫放置10-20min。質(zhì)粒粗提物用臺(tái)式離心機(jī)室溫高速離心2min，上清移入新的1.5ml離心管中，得到質(zhì)粒粗提液。(2)質(zhì)粒純化：取0.5ml質(zhì)粒粗提液中加入100μlbufferiv(雜質(zhì)清除液a)，輕輕混勻，12000rpm離心2min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。再加入100μlbufferiv(雜質(zhì)清除液a)，輕輕混勻，12000rpm離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入70μlbufferv(雜質(zhì)清除液b)，輕輕混勻，12000rmp離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入0.5ml異丙醇，混勻，室溫放置10min。12000rpm室溫離心10min，棄去上清液，用70％乙醇1ml輕輕洗滌，棄去液體，室溫倒置涼干5min。0.5mlte溶解沉淀(可在37℃水浴中振蕩或用寬口吸管輕輕吹打輔助溶解)。加入200μlbuffervi(雜質(zhì)清除液c)，混勻后冰上放置10-30min，12000rpm室溫離心10min，棄去上清液，輕輕加入1ml70％乙醇洗滌兩次，室溫倒置涼干5-10min使乙醇完全蒸發(fā)。加適量te(200-500μl)溶解沉淀(可在37℃水浴中振蕩以輔助溶解)，得到第一代毒種p1。步驟5.2，腺病毒大量擴(kuò)增步驟5.2.1，培養(yǎng)細(xì)胞密度大于等于90％的hek293細(xì)胞，將第一代毒種p1接種于hek293細(xì)胞培養(yǎng)液(dmem完全培養(yǎng)液+10％胎牛血清，其中胎牛血清的終體積濃度為10％)內(nèi)，37℃水浴培養(yǎng)，24h后顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)有60％細(xì)胞病變，46h后細(xì)胞完全病變。步驟5.2.2，收獲完全病變細(xì)胞混懸液，2000rpm離心5min，離心，棄上清，加入6mlbuffer(dmem完全培養(yǎng)液+10％胎牛血清+2.5％甘油，其中胎牛血清的終體積濃度為10％，甘油的終體積濃度為2.5％)，混勻，交替置于-80℃和37℃條件下凍融，其中-80℃和37℃分別放置3次，3000rpm離心5min，收集上清毒液，得到第二代毒種p2。步驟5.2.3，將第二代毒種p2接種于細(xì)胞密度大于等于90％的hek293細(xì)胞中，37℃水浴培養(yǎng)，46h完全病變。收獲完全病變細(xì)胞混懸液，2000rpm離心5分鐘，離心，棄上清，加入6mlbuffer(dmem完全培養(yǎng)液+10％胎牛血清+2.5％甘油，其中胎牛血清的終體積濃度為10％，甘油的終體積濃度為2.5％)，混勻，交替置于-80℃和37℃條件下凍融，其中-80℃和37℃分別放置3次，3000rpm離心5min，收集上清毒液，收集第三代毒種p3。檢測第三代毒種p3的滴度達(dá)到1010pfu/ml，所述第三代毒種p3即為大鼠rap1b基因重組腺病毒。-80℃保存?zhèn)溆谩２襟E5.3，第三代毒種p3鑒定步驟5.3.1，滴度檢測對(duì)上述方法制備而成的大鼠rap1b基因重組腺病毒的滴度進(jìn)行檢測，測定重組腺病毒的a260和a280值，計(jì)算a260/a280比值，反應(yīng)病毒的純度；將重組腺病毒10倍稀釋后，按下式計(jì)算病毒的顆粒滴度；采用reed-muench法測定重組腺病毒的tcid50值，并計(jì)算病毒的感染性滴度。病毒顆粒滴度(vp/ml)＝a260×稀釋倍數(shù)×1.2×1010。經(jīng)檢測計(jì)算，大鼠rap1b基因重組腺病毒的滴度可達(dá)1.2×1010pfu/ml。步驟5.3.2，大鼠rap1b基因重組腺病毒對(duì)brl大鼠肝細(xì)胞系感染情況,取體外培養(yǎng)1周的brl大鼠肝細(xì)胞系，以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)6孔板，37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。共分為大鼠rap1b基因重組腺病毒組、padxsi-cmv-null空載組和對(duì)照組共三組，每組3個(gè)重復(fù)孔。大鼠rap1b基因重組腺病毒組滴加滴度為1.2×109的大鼠rap1b基因重組腺病毒5μl，padxsi-cmv-null空載組加入padxsi重組腺病毒骨架載體5μl，對(duì)照組則加入超純水5μl，在37℃，5％co2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后，棄去舊液，大鼠rap1b基因重組腺病毒組、padxsi-cmv-null空載組和對(duì)照組分別收樣，熒光顯微鏡觀察感染效果并拍照，結(jié)果參見圖3，其中，圖3a為大鼠rap1b基因重組腺病毒組，圖3b為padxsi-cmv-null空載組，圖3c為對(duì)照組。熒光顯微鏡下可見大鼠rap1b基因重組腺病毒組、padxsi-cmv-null空載組中均有綠色熒光蛋白表達(dá)，發(fā)綠色熒光的細(xì)胞占總數(shù)細(xì)胞的90％以上，對(duì)照組則觀察不到熒光現(xiàn)象，說明構(gòu)建的重組腺病毒有效的感染了brl大鼠肝細(xì)胞系，同時(shí)對(duì)細(xì)胞活性沒有明顯影響。下面，我們通過一些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，來驗(yàn)證本發(fā)明大鼠rap1b基因重組腺病毒質(zhì)粒的效果：一、大鼠rap1b基因重組腺病毒對(duì)大鼠肝臟細(xì)胞中rap1bmrna表達(dá)量的影響提取收集步驟5.3.2中被大鼠rap1b基因重組腺病毒感染的brl大鼠肝細(xì)胞系，利用trizol法其中總rna，并反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)合成cdna，然后以cdna為模板，進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng)。熒光定量pcr反應(yīng)體系見表5，反應(yīng)液配制在冰上進(jìn)行，每個(gè)模板均重復(fù)三次。熒光定量pcr引物序列如下：rap1b上游引物(如seqidno.2所示)：5′-gacaaggctttgcgttggtt-3′，rap1b下游引物(如seqidno.3所示)：5′-ttgggacatcgtcagtgtct-3′，pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性5s，60℃退火30s，72℃延伸20s，45個(gè)循環(huán)。熒光定量pcr的其他步驟均按照常規(guī)方法進(jìn)行，結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明，大鼠rap1b基因重組腺病毒組表達(dá)量極顯著高于padxsi-cmv-null空載組和對(duì)照組(p<0.01)，padxsi-cmv-null空載組和對(duì)照組的mrna表達(dá)量差異不顯著。說明大鼠rap1b基因重組腺病毒穿透力強(qiáng)，可以促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞中rap1b基因的大量表達(dá)。表5熒光定量pcr擴(kuò)增體系組成成分體積(μl)sybr熒光染料12.5上游引物1.0下游引物1.0模板cdna2.0無菌水8.5總體積25.0四、大鼠rap1b基因重組腺病毒對(duì)大鼠肝臟細(xì)胞中rap1b蛋白表達(dá)量的影響利用westernblot檢測過表達(dá)效率，設(shè)計(jì)對(duì)照組、大鼠rap1b基因重組腺病毒組、padxsi-cmv-null空載組，每組3個(gè)重復(fù)孔。大鼠rap1b基因重組腺病毒組滴加感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection，moi)為400的大鼠rap1b基因重組腺病毒，padxsi-cmv-null空載組滴加感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection，moi)為400的padxsi重組腺病毒骨架載體，空白對(duì)照組則無病毒感染(添加超純水)，培養(yǎng)36h后，棄掉培養(yǎng)基，用pbsbuffer清洗cbrh-7919細(xì)胞3次，并收集各組細(xì)胞至離心管內(nèi)。向各離心管加入含0.1mmol/lpmsf的ripa裂解液(1％tritonx-100、50mmol/ltris·hclph8.0、150mmol/lnacl、0.5％sds)，吹打均勻后4℃靜置20min；超聲波破碎10s后，冰置30min。12000g離心2次，10min/次，棄沉淀，留上清。取5μl上清液用bca蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，結(jié)果確定上樣量為60μg。將蛋白樣品進(jìn)行6％sds-page凝膠電泳，結(jié)束后將凝膠電轉(zhuǎn)移(4℃，70v，2.5h)至pvdf膜上。最后按照常規(guī)方法進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，包括：(1)封閉：將pvdf膜浸泡在5％的脫脂奶粉中，在搖床上緩慢搖蕩2h。(2)洗滌：封閉結(jié)束后，將膜放在tbst中洗滌3次，每次洗滌10min。(3)一抗的稀釋：將rap1b的一抗按1:500稀釋，兔抗大鼠β-actin的一抗按1:3000稀釋，備用。(4)結(jié)合一抗：在孵育盒上滴加適量的稀釋好的一抗，將pvdf膜正面朝下貼在一抗上，操作時(shí)注意避免氣泡產(chǎn)生。然后在37℃輕搖孵育1h。(5)二抗的稀釋：按照1:5000比例將hrp標(biāo)記的二抗進(jìn)行稀釋，備用。(6)剪膜：因?yàn)閞ap1b蛋白條帶的大小為21kd，而β-actin的蛋白條帶大小為42kd，所以裁剪pvdf膜時(shí)以marker為參照標(biāo)準(zhǔn)，在marker大小為21～42kd左右將膜剪成上下兩部分，做好標(biāo)記。(7)結(jié)合二抗：將剪好的兩部分pvdf膜分別放在稀釋好的二抗中，37℃輕搖孵育1h。(8)洗滌：待二抗孵育結(jié)束后，將膜放在tbst中洗滌3次，每次洗滌10min。(9)hrp-ecl發(fā)光顯色取適當(dāng)?shù)娜芤篴和溶液b按1:1的比例混合。將混合好的發(fā)光液滴加在保鮮膜上，1min后，將pvdf膜蛋白面與發(fā)光液充分接觸，避免產(chǎn)生氣泡，避光作用1min左右，將膜放在凝膠成像系統(tǒng)中曝光拍照。(10)蛋白條帶灰度值分析應(yīng)用imagej軟件對(duì)結(jié)果中的蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。兩組樣品rap1b的蛋白表達(dá)水平以其與β-actin二者之間的灰度值比值表示。(11)統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用spss19.0統(tǒng)計(jì)軟件，運(yùn)用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，當(dāng)p<0.05和p<0.01時(shí)分別代表兩組間差異水平發(fā)生顯著和極顯著變化。采用westernblotting檢測實(shí)驗(yàn)各組rap1b的蛋白表達(dá)情況，分析westernblotting結(jié)果，結(jié)果分別如圖5和圖6所示，圖5是westernblotting檢測rap1b的蛋白表達(dá)的圖譜，其中，1道表示大鼠rap1b基因重組腺病毒組，2道表示padxsi-cmv-null空載組，3道表示對(duì)照組。圖5中能夠明顯的看到rap1b蛋白條帶，說明可以良好的表達(dá)rap1b蛋白，大鼠rap1b基因重組腺病毒組、padxsi-cmv-null空載組條帶較弱，說明其rap1b蛋白量較低。圖6是westernblotting檢測rap1b的蛋白表達(dá)量的分析圖，其中，1組表示大鼠rap1b基因重組腺病毒組，2組表示padxsi-cmv-null空載組，3組表示對(duì)照組。大鼠rap1b基因重組腺病毒組的rap1b蛋白表達(dá)量極顯著高于空載體組和對(duì)照組(p<0.01)，padxsi-cmv-null空載組和對(duì)照組的表達(dá)量差異不顯著。盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對(duì)這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。序列表<110>黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)<120>一種大鼠rap1b基因重組腺病毒、質(zhì)粒、構(gòu)建方法及應(yīng)用<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>555<212>dna<213>人工序列<400>1atgcgtgaatataagctagtcgttcttggctcaggaggtgttgggaagtcggctctgact60gtacagtttgttcaaggaatttttgttgaaaaatatgatcctacgatagaagattcttat120agaaagcaagttgaagtagatgcacagcagtgtatgcttgaaatcctggatactgcagga180acggagcagtttacagccatgagagatctgtacatgaagaacggacaaggctttgcgttg240gtttactccatcacagcacagtcgacatttaatgacttacaggatctaagagagcagatt300cttcgggttaaagacactgacgatgtcccaatgattctggttggtaacaaatgcgacctg360gaagacgaaagagttgtcgggaaggaacaaggtcagaacctggcaagacagtggagcaac420tgcgctttcttagagtcctccgccaagtccaagataaatgttaacgagatcttttatgac480ctagtgcggcaaattaacagaaaaaccccagtgcctgggaaggcccgcaaaaagtcatca540tgtcagctgctttaa555<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2gacaaggctttgcgttggtt20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3ttgggacatcgtcagtgtct20當(dāng)前第1頁12