本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用鋅指核酸酶技術(shù)破壞人bcr-abl融合基因以抑制cml細(xì)胞增殖和促使其凋亡。

背景技術(shù)：

慢性粒細(xì)胞白血病(chronicmyeloidleukemia,cml)的致病根源是由于t(9；22)(q34；q11)平衡易位導(dǎo)致c-abl基因與bcr基因形成bcr-abl融合基因。該融合基因編碼的bcr-abl融合蛋白具有強(qiáng)烈的酪氨酸激酶活性，持續(xù)激活下游的ras/mapk，pi3k/akt，stat5等促增殖抑凋亡信號(hào)，導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。臨床上的一線治療藥物伊馬替尼是一種酪氨酸激酶抑制劑(tyrosinekinaseinhibitors，tkis)，可以使近70％的cml慢性期患者達(dá)到血液學(xué)甚至遺傳學(xué)的完全緩解，但是，另外30％的患者由于bcr-abl激酶區(qū)突變引發(fā)耐藥，尤其是t315i突變，即使是新開發(fā)的第二代酪氨酸激酶抑制劑，也束手無(wú)策；并且，酪氨酸激酶抑制劑只能抑制abl激酶活性，不能使bcr-abl基因轉(zhuǎn)為陰性，特別是白血病干細(xì)胞(leukemiastemcell,lsc)對(duì)tkis不敏感，殘留的lsc成為復(fù)發(fā)的根源。因此，探索新的根治cml的方法迫在眉睫。

細(xì)胞本身存在一種dna損傷-修復(fù)機(jī)制，當(dāng)dna雙鏈的一條鏈斷裂后，以另外一條鏈為模板進(jìn)行同源修復(fù)；當(dāng)dna雙鏈的兩條鏈均斷裂后，以同源染色體的dna雙鏈為模板進(jìn)行同源修復(fù)，從而確?；蚪M的穩(wěn)定。當(dāng)兩條染色體的dna雙鏈均斷裂后，以非同源末端連接(nonhomologousendjoining,nhej)的方式進(jìn)行修復(fù)，這種修復(fù)方式極易發(fā)生插入、缺失致移碼突變。利用細(xì)胞的這種損傷-修復(fù)原理，誕生了一種可以定點(diǎn)操作基因組的核酸酶修飾技術(shù)。它由特異性的dna識(shí)別結(jié)合結(jié)構(gòu)域和非特異性剪切dna的核酸酶組成。該技術(shù)可以靶向特定位點(diǎn)的染色體dna雙鏈斷裂(double-strandedbreaks,dsb)，以供體dna為模板，促發(fā)同源定向修復(fù)(homologydirectedrepair,hdr)，或者以極易出錯(cuò)的nhej方式進(jìn)行修復(fù)。其中hdr可對(duì)靶基因進(jìn)行定點(diǎn)插入、缺失、修正等操作，而nhej由于極易出錯(cuò)，很容易導(dǎo)致靶基因發(fā)生插入、缺失和移碼突變，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的破壞(genedisruption)。

目前，主要的核酸酶修飾技術(shù)包括鋅指核酸酶(zincfingernucleases,zfns)，類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease,tal-ens)和規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)/cas核酸酶(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/crispr-associatedsystems,crispr/cas)核酸酶。crispr/ca-s核酸酶技術(shù)起步較晚，該技術(shù)操作起來(lái)最簡(jiǎn)單，但是，其潛在的完全性問(wèn)題尚未得到證實(shí)。talens的主要優(yōu)勢(shì)在于不受靶序列特征的限制，但是特異識(shí)別靶序列的talens片段太長(zhǎng)，不利于后續(xù)載體的裝載和表達(dá)，并且在靶細(xì)胞內(nèi)引入大量的重復(fù)序列也是未知的安全隱患。相比而言，雖然zfns構(gòu)建過(guò)程較復(fù)雜，但其是人類基因編輯最確立的技術(shù)，技術(shù)成熟，免疫原性低，特異性較高，較適用于體內(nèi)療法，且已在基因治療領(lǐng)域顯示出良好的前景，是本研究較為理想的工具。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)以上問(wèn)題，本發(fā)明一方面提供一種dna分子，其序列如seqidno:2所示。

本發(fā)明的另一方面在于提供如seqidno:2所示的dna分子作為靶點(diǎn)在抑制人bcr-abl融合基因表達(dá)或?qū)е氯薭cr-abl基因功能喪失中的應(yīng)用；所述抑制人bcr-abl基因表達(dá)或?qū)е氯薭cr-abl基因功能喪失是由鋅指核酸酶介導(dǎo)的bcr-abl融合基因同源重組技術(shù)帶來(lái)的。

在上述技術(shù)方案中，所述人bcr-abl基因的核苷酸序列如seqidno:1所示。

所述的鋅指核酸酶的鋅指蛋白的核苷酸編碼序列如seqidno:3和4所示。

所述的同源重組為同源定向修復(fù)，使用到的供體dna的左臂擴(kuò)增引物如seqidno:7和8所示，右臂擴(kuò)增引物如seqidno:9和10所示。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明定位了bcr-abl基因中一段特異的靶序列位點(diǎn)dna片段，并針對(duì)此特異位點(diǎn)構(gòu)建zfn質(zhì)粒，將此質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染k562細(xì)胞可以使bcr-abl基因發(fā)生定點(diǎn)斷裂,并以供體dna為模板進(jìn)行同源修復(fù)，使其插入8個(gè)堿基最終導(dǎo)致bcr-abl基因的破壞。本發(fā)明的顯著優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)在針對(duì)bcr-abl序列中特異的靶序列位點(diǎn)構(gòu)建的zfn質(zhì)?？筛咝О邢騜cr-abl基因發(fā)生dna雙鏈斷裂，以hdr方式進(jìn)行修復(fù)使bcr-abl發(fā)生移碼等突變而被破壞，從而喪失促增殖、抑凋亡等惡性轉(zhuǎn)化潛能，證實(shí)zfns靶向破壞bcr-abl基因殺傷和抑制cml細(xì)胞的可行性。

附圖說(shuō)明

圖1是鑒定轉(zhuǎn)染zfn質(zhì)粒的k562細(xì)胞基因組dna測(cè)序結(jié)果峰圖。

圖2是k562細(xì)胞相關(guān)蛋白westernblot檢測(cè)結(jié)果圖，blank：空白對(duì)照組；gfp:空載組。

圖3是k562細(xì)胞、gfp和zfn-l/r+donor質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染k562細(xì)胞克隆形成鏡下圖，k562細(xì)胞：未處理細(xì)胞，gfp：空載質(zhì)粒，zfn-l/r+donor：zfns和donor同時(shí)作用于k562細(xì)胞。

圖4是gfp和zfn-l/r+donor質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染k562細(xì)胞后細(xì)胞克隆形成數(shù)柱狀圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1、針對(duì)人bcr-abl基因特異靶位點(diǎn)序列的zfn質(zhì)粒和donor質(zhì)粒的設(shè)計(jì)與構(gòu)建

一、針對(duì)人bcr-abl基因特異靶位點(diǎn)序列的鋅指核酸酶的設(shè)計(jì)合成

根據(jù)ncbi的查詢和拼接確定了人bcr-abl基因的基因序列(如seqidno:1所示)，通過(guò)生物信息學(xué)的方法，完成zfns設(shè)計(jì)，確定了該人bcr-abl基因的鋅指核酸酶作用的特異靶位點(diǎn)序列為：

ggcgtcgacggcgactacgaggacgccgag(如seqidno:2所示)；中間部分序列(gactac)為foki內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)，也即zfn特異敲除的靶位點(diǎn)序列，且本發(fā)明中所用的foki內(nèi)切核酸酶為專性異二聚化foki質(zhì)粒，購(gòu)自addgene公司，可避免同源二聚化導(dǎo)致的非特異切割。

本發(fā)明中設(shè)計(jì)的針對(duì)人bcr-abl基因的鋅指核酸酶(zfns)由鋅指蛋白(zfp)和foki酶構(gòu)成

(1)鋅指蛋白(zfp)的左臂(zfp-l)、右臂(zfp-r)序列

zfp-l的dna序列為(如seqidno:3所示)：

5’-gtcgacctggagcccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagcgactgccgcgacctggcccgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagcgaccccggcaacctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagcgaccccggcgccctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagcgactgccgcgacctggcccgccaccagcgcacccacaccggcaagaagaccagctgcggccgc-3’。

zfp-r的dna序列為(如seqidno:4所示)：

5’-gtcgacctggagcccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagccgcagcgacaacctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagcgactgccgcgacctggcccgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagcgaccccggcaacctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagccgcagcgacaacctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcaagaagaccagctgcggccgc-3’。

在上述zfp-l和zfp-r的dna序列中，5’端的下劃線部分為sali酶切位點(diǎn)。3’端的下劃線部分為noti酶切位點(diǎn)，下劃線前面的堿基t為防止移碼添加的堿基。

(2)foki酶

foki-l質(zhì)粒(質(zhì)粒編號(hào)37198)和foki-r質(zhì)粒(質(zhì)粒編號(hào)37199)均購(gòu)自addgene。

二、質(zhì)粒pad-track-cmv-zfn-l的構(gòu)建

按照如下步驟操作：

(1)將上述zfp-l的編碼序列交由北京華大基因公司合成；用sali酶和noti酶(takara公司)對(duì)zfp-l和pad-track-cmv(重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存)進(jìn)行雙酶切，37℃，1h；

(2)隨后將酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行純化回收，具體步驟按照天根生化科技有限公司普通dna產(chǎn)物純化試劑盒(貨號(hào)dp204)；

(3)將酶切回收產(chǎn)物用t4連接酶(takara公司)進(jìn)行連接，16℃，16h；

(4)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入dh5α感受態(tài)后在kana抗性的平板上進(jìn)行分區(qū)劃線，隨后在37℃孵箱中培養(yǎng)12h；

(5)在上述kana平板上挑取8-10個(gè)單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；

(6)在擴(kuò)增得到的菌液中提取質(zhì)粒，具體步驟按照天根生化科技有限公司質(zhì)粒小提試劑盒(貨號(hào)dp103)；

(7)提取得到的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，其中得到的測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒就為pad-track-cmv-zfp-l；

(8)以foki-l質(zhì)粒為模板，pcr擴(kuò)增foki-l質(zhì)粒，以表1所列的引物進(jìn)行目的片段pcr擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系為25μl，12.5μlpremixtaq、1μl10μm引物foki-senceprimer、1μl25μm引物foki-antisenceprimer、100ng質(zhì)粒dna，加超純水至25μl。pcr擴(kuò)增程序：94℃5min；94℃30s，退火溫度58℃，72℃30s，循環(huán)29次，最后72℃延伸5min；pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；

表1擴(kuò)增foki質(zhì)粒dna目的片段引物表

注：foki-senceprimer中g(shù)cggccgc為noti酶切位點(diǎn)，下劃線為linker序列，5’端的aaggaaaaaa為保護(hù)堿基。foki-antisenceprimer中ctcgag為xhoi酶切位點(diǎn)，5’端的ccg為保護(hù)堿基。

(9)隨后將pcr產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，具體步驟按照天根生化科技有限公司普通dna產(chǎn)物純化試劑盒(貨號(hào)dp204)；

(10)用xhoi酶和noti酶(takara公司)對(duì)foki-l和pad-track-cmv-zfp-l質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，37℃，1h；

(11)隨后將酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行純化回收，具體步驟按照天根生化科技有限公司普通dna產(chǎn)物純化試劑盒(貨號(hào)dp204)；

(12)將它們的酶切回收產(chǎn)物用t4連接酶(takara公司)進(jìn)行連接，16℃，16h；

(13)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入dh5α感受態(tài)后在kana抗性的平板上進(jìn)行分區(qū)劃線，隨后在37℃孵箱中培養(yǎng)12h；

(15)在上述kana平板上挑取8-10個(gè)單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；

(16)在擴(kuò)增得到的菌液中提取質(zhì)粒，具體步驟按照天根生化科技有限公司質(zhì)粒小提試劑盒(貨號(hào)dp103)；

(17)提取得到的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，其中得到的測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒就為pad-track-cmv-zfn-l。

三、質(zhì)粒pad-track-cmv-zfn-r質(zhì)粒的構(gòu)建

過(guò)程與上述“質(zhì)粒pad-track-cmv-zfn-l的構(gòu)建”過(guò)程類似，不同處是將zfp-r合成后構(gòu)建pad-track-cmv-zfp-r質(zhì)粒，再與foki-r質(zhì)粒相連接構(gòu)建pad-track-cmv-zfn-r質(zhì)粒。(擴(kuò)增foki-r質(zhì)粒所用的pcr引物\程序和產(chǎn)物長(zhǎng)度同表1)。

四、同源模板donor質(zhì)粒的構(gòu)建

以k562細(xì)胞cdna為模板，pcr擴(kuò)增donor(左臂bcr217～758，長(zhǎng)542bp；右臂：bcr759～1523bp，長(zhǎng)765bp)，左臂克隆入kpni和noti酶切位點(diǎn)，右臂克隆入noti和xbai酶切位點(diǎn)，將左、右臂同時(shí)克隆入質(zhì)粒pad-track-cmv中。

按照如下步驟操作：

(1)以k562細(xì)胞(上海細(xì)胞所提供)cdna為模板，pcr擴(kuò)增donor左臂(donor-l)，以表2所列的引物進(jìn)行目的片段pcr擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系為25μl，12.5μlpremixtaq、1μl10μm引物donor-l-f、1μl25μm引物donor-l-r、100ngcdna，加超純水至25μl。pcr擴(kuò)增程序：94℃5min；94℃30s，退火溫度56℃，72℃30s，循環(huán)29次，最后72℃延伸5min，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；

表2擴(kuò)增donor左臂的引物

注：以上2條引物的下劃線處堿基分別為kpni和noti酶切位點(diǎn)

(2)用kpni酶和noti酶(takara公司)對(duì)donor-l的pcr產(chǎn)物和pad-track-cmv進(jìn)行雙酶切，37℃，1h；

(3)隨后將酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行純化回收，具體步驟按照天根生化科技有限公司普通dna產(chǎn)物純化試劑盒(貨號(hào)dp204)；

(4)將它們的酶切回收產(chǎn)物用t4連接酶(takara公司)進(jìn)行連接，16℃，16h；

(5)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入dh5α感受態(tài)后在kana抗性的平板上進(jìn)行分區(qū)劃線，隨后在37℃孵箱中培養(yǎng)12h；

(6)在上述kana平板上挑取8-10個(gè)單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；

(7)在擴(kuò)增得到的菌液中提取質(zhì)粒，具體步驟按照天根生化科技有限公司質(zhì)粒小提試劑盒(貨號(hào)dp103)；

(8)提取得到的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，其中得到的測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒就為pad-track-cmv-donor-l；

(9)再以k562細(xì)胞cdna為模板，pcr擴(kuò)增donor右臂(donor-r)，以表3所列的引物進(jìn)行目的片段pcr擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系為25μl，12.5μlpremixtaq、1μl10μm引物donor-r-f、1μl25μm引物donor-r-r、100ngcdna，加超純水至25μl。pcr擴(kuò)增程序：94℃5min；94℃30s，退火溫度56℃(見表3)，72℃30s，循環(huán)29次，最后72℃延伸5min，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；

表3擴(kuò)增donor右臂的引物

注：以上2條引物的下劃線部分堿基分別為noti和xbai酶切位點(diǎn)

(10)隨后將pcr產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，具體步驟按照天根生化科技有限公司普通dna產(chǎn)物純化試劑盒(貨號(hào)dp204)；

(11)用noti酶和xbai酶(takara公司)對(duì)donor-r的pcr產(chǎn)物和pad-track-cmv-donor-l質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，37℃，1h；

(12)隨后將酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行純化回收，具體步驟按照天根生化科技有限公司普通dna產(chǎn)物純化試劑盒(貨號(hào)dp204)；

(13)將它們的酶切回收產(chǎn)物用t4連接酶(takara公司)進(jìn)行連接，16℃，16h；

(14)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入dh5α感受態(tài)后在kana抗性的平板上進(jìn)行分區(qū)劃線，隨后在37℃孵箱中培養(yǎng)12h；

(15)在上述kana平板上挑取8-10個(gè)單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；

(16)在擴(kuò)增得到的菌液中提取質(zhì)粒，具體步驟按照天根生化科技有限公司質(zhì)粒小提試劑盒(貨號(hào)dp103)；

(17)提取得到的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，其中得到的測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒就為pad-track-cmv-donor。

實(shí)施例2、鋅指核酸酶定點(diǎn)切割bcr-abl基因并插入noti酶切位點(diǎn)促發(fā)同源定向修復(fù)

1、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)

從液氮中取出裝有k562細(xì)胞的凍存小管，立即投入37℃的溫水中快速晃動(dòng)，直至凍存液完全融解；在2min內(nèi)完成復(fù)溫；將細(xì)胞懸液移入無(wú)菌的離心管，加入5ml培養(yǎng)液，輕輕吹勻；將細(xì)胞懸液1000r/min離心5min，棄上清；向含有細(xì)胞沉淀的離心管加入1ml完全培養(yǎng)基。

2、細(xì)胞培養(yǎng)條件及傳代培養(yǎng)：

細(xì)胞培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基組成成分：1640(gibcolot:1737734)

10％fbs(bilot:1616756)

傳代培養(yǎng)：

(1)k562細(xì)胞密度達(dá)約80％左右；

(2)用移液器反復(fù)吹打數(shù)次，至細(xì)胞全部均勻重懸在培養(yǎng)基中，將其轉(zhuǎn)移到離心管中；500rpm離心5min；

(3)棄上清，加入2ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，分兩份加到有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中；

(4)晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使細(xì)胞分布均勻后，至37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3、核轉(zhuǎn)染方法

使用lonza公司提供的電轉(zhuǎn)試劑celllinenucleofectorkitv及核轉(zhuǎn)染儀進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，具體操作按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。

4、細(xì)胞基因組dna提取：按照天根生化科技有限血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒(貨號(hào)：dp304)操作步驟說(shuō)明，提取步驟3得到的培養(yǎng)48小時(shí)的細(xì)胞基因組dna。

5、目的片段pcr擴(kuò)增反應(yīng)和pcr產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證

以上述步驟4得到的細(xì)胞基因組dna為模板，以下表4所列的引物進(jìn)行目的片段pcr擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系為25μl，12.5μlpremixtaq、1μl10μm引物senceprimer、1μl25μm引物anti-senceprimer、100ng基因組dna，加超純水至25μl。pcr擴(kuò)增程序：94℃5min；94℃30s，退火溫度56℃，72℃30s，循環(huán)29次，最后72℃延伸5min。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表4擴(kuò)增bcr-abl基因組dna目的片段引物表

將pcr產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序所得的序列結(jié)果與bcr-abl基因中的靶位點(diǎn)序列進(jìn)行同源性比較分析，以鑒定轉(zhuǎn)染zfn質(zhì)粒k562細(xì)胞基因組dna中靶位點(diǎn)是否被定點(diǎn)插入noti酶切位點(diǎn)。測(cè)序結(jié)果峰圖如圖1所示，k562細(xì)胞基因組dna的靶位點(diǎn)被定點(diǎn)插入noti酶切位點(diǎn)。

6、westernblot檢測(cè)相關(guān)蛋白變化

提取細(xì)胞總蛋白與濃度測(cè)定：

(1)收集前述步驟3得到的培養(yǎng)48小時(shí)的細(xì)胞到10ml離心管里，1000rpm離心10min，棄盡上清液；

(2)再加入2mlpbs于離心管中將細(xì)胞懸液，吹打混勻，1000rpm離心10min，棄盡上清液；

(3)加入1mlpbs重新混勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至新的1.5mlep管中；

(4)配制裂解液：pmsf：naf：navo4：ripa＝1:1:1:100，每個(gè)dish加60μl裂解液。冰上裂解30分鐘，每10分鐘振蕩一次(5-10s)；

(5)將ep管放入4℃離心機(jī)，12000rpm離心40分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)新的ep管中，記錄體積，加上清液1/4體積的5×蛋白上樣buffer，沸水煮5分鐘，-80℃超低溫冰箱保存；

(6)bca試劑盒測(cè)蛋白濃度：配制bca標(biāo)準(zhǔn)品工作液，終濃度0.5mg/ml。將標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)品加入96孔板，按照說(shuō)明書向每孔加工作液，振蕩混勻后37℃水浴箱孵育35分鐘，測(cè)定560nm處吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算蛋白濃度及上樣量(見表5)。

表5蛋白濃度測(cè)定

westernblot：

(1)配制10％分離膠加入安裝好的電泳儀中，1ml無(wú)水乙醇?jí)壕€，37℃烤箱靜置30min取出，棄去無(wú)水乙醇，配制5％濃縮膠，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求加入適量孔梳，再將配好的濃縮膠加入，37℃烤箱靜置20min。待濃縮膠完全凝固后去掉膠條放入電泳槽中，加入內(nèi)槽液(1×sds)后拔掉梳子，加入外槽液后排氣泡。每孔加入30μg蛋白樣品，兩步法電泳：80v電泳30分鐘，120v電泳90分鐘；

(2)提前預(yù)冷濕轉(zhuǎn)液并將濾紙浸泡在濕轉(zhuǎn)液中，按目的條帶分子量切膠浸潤(rùn)濕轉(zhuǎn)液待用。剪與切膠大小相等的膜，甲醇活化1min，雙蒸水2min轉(zhuǎn)入濕轉(zhuǎn)液中。轉(zhuǎn)膜：按照三層濾紙、膜、膠和三層濾紙的順序放入轉(zhuǎn)膜儀，210ma恒流，小分子蛋白按照分子量大小相同時(shí)間轉(zhuǎn)膜，大分子量蛋白按照分子量×0.85時(shí)間轉(zhuǎn)膜；

(3)配制5％的封閉奶粉待轉(zhuǎn)膜結(jié)束時(shí)將pvdf膜放入進(jìn)行封閉，4℃冰箱4h；

(4)tbst去除膜上封閉液放置于蠟板上，加入一抗(1:1000稀釋)后密封，4℃冰箱充分反應(yīng)14-18h；

(5)取出pvdf膜，tbst洗3次/5min，加入二抗(1:2000稀釋)，4℃90分鐘后再用tbst洗2次/5min，tbs洗5min；

(6)配制發(fā)光液：a液：b液＝1:1，加在膜上避光于發(fā)光儀內(nèi)顯像。

westernblot檢測(cè)相關(guān)蛋白結(jié)果如圖2所示，與空白組，空載組以及各種質(zhì)粒單獨(dú)作用組對(duì)比zfn-l/r和donor共同作用于cml細(xì)胞后能使p-bcr-abl蛋白明顯下調(diào)，且bcr-abl蛋白下游的效應(yīng)分子p-stat5和p-erk都明顯下調(diào)；與空白組，空載組以及各種質(zhì)粒單獨(dú)作用組對(duì)比zfn-l/r和donor共同作用于cml細(xì)胞后能激活parp和caspase-3蛋白，說(shuō)明其能促進(jìn)cml細(xì)胞凋亡。

7、克隆形成實(shí)驗(yàn)

(1)分別用空載質(zhì)粒gfp和zfn-l/r+donor質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染k562細(xì)胞，并且設(shè)對(duì)照組(無(wú)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染)，每組處理設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每孔鋪300個(gè)細(xì)胞于24孔板，調(diào)整每孔終培養(yǎng)基至750μl；

(2)在每孔中加入750μl2.7％甲基纖維素，混勻；

(3)37℃、5％co2恒溫細(xì)胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)7-10天觀察結(jié)果。結(jié)果如圖3、4所示：zfn-l/r和donor共同作用于k562細(xì)胞后能明顯抑制k562細(xì)胞的克隆大小和克隆數(shù)量，即抑制k562細(xì)胞的克隆形成能力。

序列表

<110>重慶醫(yī)科大學(xué)

<120>采用鋅指核酸酶技術(shù)破壞人bcr-abl融合基因以抑制cml細(xì)胞增殖和促使其凋亡

<130>1

<160>12

<210>1

<211>6021

<212>dna

<213>人工序列

<223>人bcr-abl基因

<400>1

atggtggacccggtgggcttcgcggaggcgtggaaggcgcagttcccggactcagagccc60

ccgcgcatggagctgcgctcagtgggcgacatcgagcaggagctggagcgctgcaaggcc120

tccattcggcgcctggagcaggaggtgaaccaggagcgcttccgcatgatctacctgcag180

acgttgctggccaaggaaaagaagagctatgaccggcagcgatggggcttccggcgcgcg240

gcgcaggcccccgacggcgcctccgagccccgagcgtccgcgtcgcgcccgcagccagcg300

cccgccgacggagccgacccgccgcccgccgaggagcccgaggcccggcccgacggcgag360

ggttctccgggtaaggccaggcccgggaccgcccgcaggcccggggcagccgcgtcgggg420

gaacgggacgaccggggaccccccgccagcgtggcggcgctcaggtccaacttcgagcgg480

atccgcaagggccatggccagcccggggcggacgccgagaagcccttctacgtgaacgtc540

gagtttcaccacgagcgcggcctggtgaaggtcaacgacaaagaggtgtcggaccgcatc600

agctccctgggcagccaggccatgcagatggagcgcaaaaagtcccagcacggcgcgggc660

tcgagcgtgggggatgcatccaggcccccttaccggggacgctcctcggagagcagctgc720

ggcgtcgacggcgactacgaggacgccgagttgaacccccgcttcctgaaggacaacctg780

atcgacgccaatggcggtagcaggcccccttggccgcccctggagtaccagccctaccag840

agcatctacgtcgggggcatgatggaaggggagggcaagggcccgctcctgcgcagccag900

agcacctctgagcaggagaagcgccttacctggccccgcaggtcctactccccccggagt960

tttgaggattgcggaggcggctataccccggactgcagctccaatgagaacctcacctcc1020

agcgaggaggacttctcctctggccagtccagccgcgtgtccccaagccccaccacctac1080

cgcatgttccgggacaaaagccgctctccctcgcagaactcgcaacagtccttcgacagc1140

agcagtccccccacgccgcagtgccataagcggcaccggcactgcccggttgtcgtgtcc1200

gaggccaccatcgtgggcgtccgcaagaccgggcagatctggcccaacgatggcgagggc1260

gccttccatggagacgcagatggctcgttcggaacaccacctggatacggctgcgctgca1320

gaccgggcagaggagcagcgccggcaccaagatgggctgccctacattgatgactcgccc1380

tcctcatcgccccacctcagcagcaagggcaggggcagccgggatgcgctggtctcggga1440

gccctggagtccactaaagcgagtgagctggacttggaaaagggcttggagatgagaaaa1500

tgggtcctgtcgggaatcctggctagcgaggagacttacctgagccacctggaggcactg1560

ctgctgcccatgaagcctttgaaagccgctgccaccacctctcagccggtgctgacgagt1620

cagcagatcgagaccatcttcttcaaagtgcctgagctctacgagatccacaaggagttc1680

tatgatgggctcttcccccgcgtgcagcagtggagccaccagcagcgggtgggcgacctc1740

ttccagaagctggccagccagctgggtgtgtaccgggccttcgtggacaactacggagtt1800

gccatggaaatggctgagaagtgctgtcaggccaatgctcagtttgcagaaatctccgag1860

aacctgagagccagaagcaacaaagatgccaaggatccaacgaccaagaactctctggaa1920

actctgctctacaagcctgtggaccgtgtgacgaggagcacgctggtcctccatgacttg1980

ctgaagcacactcctgccagccaccctgaccaccccttgctgcaggacgccctccgcatc2040

tcacagaacttcctgtccagcatcaatgaggagatcacaccccgacggcagtccatgacg2100

gtgaagaagggagagcaccggcagctgctgaaggacagcttcatggtggagctggtggag2160

ggggcccgcaagctgcgccacgtcttcctgttcaccgagctgcttctctgcaccaagctc2220

aagaagcagagcggaggcaaaacgcagcagtatgactgcaaatggtacattccgctcacg2280

gatctcagcttccagatggtggatgaactggaggcagtgcccaacatccccctggtgccc2340

gatgaggagctggacgctttgaagatcaagatctcccagatcaagagtgacatccagaga2400

gagaagagggcgaacaagggcagcaaggctacggagaggctgaagaagaagctgtcggag2460

caggagtcactgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaac2520

ggcaagagttacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaac2580

atccgggagcagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcag2640

atgctgaccaactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaat2700

aaggaagaagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaa2760

gccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaac2820

cttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaa2880

ggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaacc2940

aaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaa3000

cactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcagcggg3060

atcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcg3120

ctgagatacgaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctc3180

tacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacg3240

gtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccact3300

gtctatggtgtgtcccccaactacgacaagtgggagatggaacgcacggacatcaccatg3360

aagcacaagctgggcgggggccagtacggggaggtgtacgagggcgtgtggaagaaatac3420

agcctgacggtggccgtgaagaccttgaaggaggacaccatggaggtggaagagttcttg3480

aaagaagctgcagtcatgaaagagatcaaacaccctaacctggtgcagctccttggggtc3540

tgcacccgggagcccccgttctatatcatcactgagttcatgacctacgggaacctcctg3600

gactacctgagggagtgcaaccggcaggaggtgaacgccgtggtgctgctgtacatggcc3660

actcagatctcgtcagccatggagtacctggagaagaaaaacttcatccacagagatctt3720

gctgcccgaaactgcctggtaggggagaaccacttggtgaaggtagctgattttggcctg3780

agcaggttgatgacaggggacacctacacagcccatgctggagccaagttccccatcaaa3840

tggactgcacccgagagcctggcctacaacaagttctccatcaagtccgacgtctgggca3900

tttggagtattgctttgggaaattgctacctatggcatgtccccttacccgggaattgac3960

ctgtcccaggtgtatgagctgctagagaaggactaccgcatggagcgcccagaaggctgc4020

ccagagaaggtctatgaactcatgcgagcatgttggcagtggaatccctctgaccggccc4080

tcctttgctgaaatccaccaagcctttgaaacaatgttccaggaatccagtatctcagac4140

gaagtggaaaaggagctggggaaacaaggcgtccgtggggctgtgagtaccttgctgcag4200

gccccagagctgcccaccaagacgaggacctccaggagagctgcagagcacagagacacc4260

actgacgtgcctgagatgcctcactccaagggccagggagagagcgatcctctggaccat4320

gagcctgccgtgtctccattgctccctcgaaaagagcgaggtcccccggagggcggcctg4380

aatgaagatgagcgccttctccccaaagacaaaaagaccaacttgttcagcgccttgatc4440

aagaagaagaagaagacagccccaacccctcccaaacgcagcagctccttccgggagatg4500

gacggccagccggagcgcagaggggccggcgaggaagagggccgagacatcagcaacggg4560

gcactggctttcacccccttggacacagctgacccagccaagtccccaaagcccagcaat4620

ggggctggggtccccaatggagccctccgggagtccgggggctcaggcttccggtctccc4680

cacctgtggaagaagtccagcacgctgaccagcagccgcctagccaccggcgaggaggag4740

ggcggtggcagctccagcaagcgcttcctgcgctcttgctccgcctcctgcgttccccat4800

ggggccaaggacacggagtggaggtcagtcacgctgcctcgggacttgcagtccacggga4860

agacagtttgactcgtccacatttggagggcacaaaagtgagaagccggctctgcctcgg4920

aagagggcaggggagaacaggtctgaccaggtgacccgaggcacagtaacgcctcccccc4980

aggctggtgaaaaagaatgaggaagctgctgatgaggtcttcaaagacatcatggagtcc5040

agcccgggctccagcccgcccaacctgactccaaaacccctccggcggcaggtcaccgtg5100

gcccctgcctcgggcctcccccacaaggaagaagctggaaagggcagtgccttagggacc5160

cctgctgcagctgagccagtgacccccaccagcaaagcaggctcaggtgcaccagggggc5220

accagcaagggccccgccgaggagtccagagtgaggaggcacaagcactcctctgagtcg5280

ccagggagggacaaggggaaattgtccaggctcaaacctgccccgccgcccccaccagca5340

gcctctgcagggaaggctggaggaaagccctcgcagagcccgagccaggaggcggccggg5400

gaggcagtcctgggcgcaaagacaaaagccacgagtctggttgatgctgtgaacagtgac5460

gctgccaagcccagccagccgggagagggcctcaaaaagcccgtgctcccggccactcca5520

aagccacagtccgccaagccgtcggggacccccatcagcccagcccccgttccctccacg5580

ttgccatcagcatcctcggccctggcaggggaccagccgtcttccaccgccttcatccct5640

ctcatatcaacccgagtgtctcttcggaaaacccgccagcctccagagcggatcgccagc5700

ggcgccatcaccaagggcgtggtcctggacagcaccgaggcgctgtgcctcgccatctct5760

aggaactccgagcagatggccagccacagcgcagtgctggaggccggcaaaaacctctac5820

acgttctgcgtgagctatgtggattccatccagcaaatgaggaacaagtttgccttccga5880

gaggccatcaacaaactggagaataatctccgggagcttcagatctgcccggcgacagca5940

ggcagtggtccggcggccactcaggacttcagcaagctcctcagttcggtgaaggaaatc6000

agtgacatagtgcagaggtag6021

<210>2

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<223>人bcr-abl基因的鋅指核酸酶作用的特異靶位點(diǎn)

<400>2

ggcgtcgacggcgactacgaggacgccgag30

<210>3

<211>375

<212>dna

<213>人工序列

<223>zfp-l

<400>3

gtcgacctggagcccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagc60

gactgccgcgacctggcccgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgc120

cccgagtgcggcaagagcttcagcgaccccggcaacctggtgcgccaccagcgcacccac180

accggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagcgaccccggcgcc240

ctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggc300

aagagcttcagcgactgccgcgacctggcccgccaccagcgcacccacaccggcaagaag360

accagctgcggccgc375

<210>4

<211>375

<212>dna

<213>人工序列

<223>zfp-r

<400>4

gtcgacctggagcccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagc60

cgcagcgacaacctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgc120

cccgagtgcggcaagagcttcagcgactgccgcgacctggcccgccaccagcgcacccac180

accggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagcgaccccggcaac240

ctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggc300

aagagcttcagccgcagcgacaacctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcaagaag360

accagctgcggccgc375

<210>5

<211>78

<212>dna

<213>人工序列

<223>foki-senceprimer

<400>5

aaggaaaaaagcggccgcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgccctggtgaag60

agcgagctggaggagaag78

<210>6

<211>46

<212>dna

<213>人工序列

<223>foki-antisenceprimer

<400>6

ccgctcgagtcagaagttgatctcgccgttgttgaacttgcgccgc46

<210>7

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<223>donor-l-f

<400>7

cggggtacccagcgatggggcttccggcg29

<210>8

<211>45

<212>dna

<213>人工序列

<223>donor-l-r

<400>8

aaggaaaaaagcggccgcgggttcaactcggcgtcctcgtagtcg45

<210>9

<211>44

<212>dna

<213>人工序列

<223>donor-r-f

<400>9

aaggaaaaaagcggccgcccgcttcctgaaggacaacctgatcg44

<210>10

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<223>donor-r-r

<400>10

gctctagagccaggattcccgacaggacccattttc36

<210>11

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<223>senceprimer

<400>11

gacgccgagaagcccttc18

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>anti-senceprimer

<400>12

aatcctcaaaactccggggg20